趙喆禛，王夢雅，薛 嬌，張嘉銘，劉 萍

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是一種珍稀的藥用真菌，屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、多孔菌目[1]。樺褐孔菌多糖是樺褐孔菌中的主要化學(xué)物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等活性功能，在糖尿病防治方面受到越來越多關(guān)注[2-7]。

由于野生樺褐孔菌子實體在自然生長狀態(tài)下要經(jīng)10～15年才能具有藥用價值，資源非常有限，無法滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求，因此解決樺褐孔菌資源短缺問題迫在眉睫。液體深層發(fā)酵法培養(yǎng)樺褐孔菌具有周期短、產(chǎn)量高、價格低的優(yōu)勢，被廣泛使用。目前，對液體深層培養(yǎng)的研究大多集中在如何提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上，對于如何提高其活性的研究不多，而液體發(fā)酵樺褐孔菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物活性與天然生長子實體中的相比還存在一定差距。近年研究表明，添加刺激因子能改變次生代謝途徑中催化酶的活性，從而達到提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和活性的目的[8-9]。樺褐孔菌通過寄生在樺樹皮上進行自身生長繁殖，樺樹皮中含有多種營養(yǎng)成分，能夠確保樺褐孔菌生長及合成生物活性物質(zhì)。采用高效液相色譜方法研究樺樹汁液的營養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)白樺液中含有近70 種化合物，主要包括各種維生素、氨基酸、脂肪酸和礦物質(zhì)元素等[10]。Wang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)添加樺樹皮水提取物（0.01 g/L）能夠刺激液體深層培養(yǎng)的樺褐孔菌菌絲體生長，且其產(chǎn)生的類固醇產(chǎn)量達（225.5±8.7）mg/L，比對照組高97.0%，說明白樺樹皮的提取物可作為樺褐孔菌類固醇生物合成的誘導(dǎo)劑。

II 型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）又稱非胰島素依賴型糖尿病，其重要發(fā)病機制之一為胰島素抵抗（Insulin resisitance，IR）[12-13]。HepG2 細胞被廣泛用作胰島素抵抗發(fā)病機制和糖尿病治療藥物作用機制的體外研究細胞模型[14]。本試驗通過探究不同刺激因子（樺樹浸提汁、VB1、VB6和白樺脂醇）作用下樺褐孔菌液體深層發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對HepG2 細胞及胰島素抵抗HepG2 細胞（IR-HepG2）葡萄糖消耗量的影響，確定導(dǎo)致樺褐孔菌液體深層發(fā)酵與子實體多糖降血糖活性差異的主要刺激因子，為樺褐孔菌降血糖保健食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料 樺褐孔菌菌種購于四川省綿陽市食用菌研究所，HepG2 肝癌細胞株購于北京博奧森生物公司。

1.1.2 試劑 DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液，北京科奧試劑有限公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）、胰島素，美國Sigma 公司；胎牛血清（FBS），杭州四季青生物工程材料有限公司；二甲基亞砜（DMSO），天津市富宇精細化工有限公司；葡萄糖測定試劑盒，南京建成生物科技股份有限公司；鹽酸二甲雙胍（Met），北京中惠藥業(yè)有限公司。

1.1.3 儀器 SW-CJ-2D 超凈工作臺、YCP-50 CO2 培養(yǎng)箱，北京三木科技儀器有限公司；M200 pro 多功能酶標儀，購自Tecan 集團奧地利有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 液體深層發(fā)酵 將樺褐孔菌接種到馬鈴薯斜面培養(yǎng)基（PDA）上，于28 ℃下培養(yǎng)7～9 d。在4℃條件下保存獲得的斜面純培養(yǎng)菌絲體，每3 個月傳代一次。種子培養(yǎng)基由葡萄糖（20 g/L），胰蛋白胨（4 g/L），KH2PO4（1 g/L）和MgSO4（1 g/L）組成。將斜面純培養(yǎng)菌絲體接種到含100 mL 種子培養(yǎng)基的250 mL 一級搖瓶中，并在28 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)7 d。將種子液接種到含100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中于28 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)13 d。在種子培養(yǎng)基中分別依次添加4 μg/mL VB1、4 μg/mL VB6、2 μg/mL 白樺脂醇和40%樺樹浸提汁（稱取一定量樺木屑，常溫水提8～12 h，抽濾去掉樺木屑渣得到）作為發(fā)酵培養(yǎng)基，并設(shè)不添加任何刺激因子組。在第13 天收集各種培養(yǎng)條件下的樺褐孔菌培養(yǎng)液，發(fā)酵液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后加入4 倍體積的乙醇醇沉過夜后得到多糖。

1.2.2 樺褐孔菌胞外多糖對HepG2 細胞影響的測定

1.2.2.1 不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對HepG2 細胞增殖影響的測定 凍存的HepG2 細胞經(jīng)復(fù)蘇后，培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基中（含10%FBS），于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，每3 d 傳代一次。培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用胰蛋白酶進行消化，加新鮮培養(yǎng)液吹打制成密度為1×105細胞/mL 的單細胞懸液，按100 μL/孔接種于96 孔板，置于5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后，吸棄舊培養(yǎng)基，5 種多糖分別按照終質(zhì)量濃度為20、40、80、120、160、320 μg/mL 添加，并設(shè)置空白對照組，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 和48 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），再于培養(yǎng)箱中孵化4 h，棄去舊培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO 終止反應(yīng)。待結(jié)晶物充分溶解后，用酶標儀在波長490 nm 處測定吸光度，計算增殖率[15]。

1.2.2.2 不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對正常HepG2 細胞葡萄糖消耗影響的測定 參照文獻[16]的方法進行測定，以加入終質(zhì)量濃度為20，40，80，160 μg/mL 的多糖樣品組為試驗組，并設(shè)置空白對照組以及Met 組（終濃度1×10-3mmol/L）和胰島素組（終濃度1×10-8mmol/L）兩組陽性對照，分別孵育24 h 和48 h 后，按試劑盒說明書檢測葡萄糖含量。細胞葡萄糖消耗量（△GC）為空白組葡萄糖含量減試驗組葡萄糖含量[17]。每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，孵育4 h 后再加入150 μL DMSO，用酶標儀在波長570 nm 處測定吸光值，結(jié)果以△GC/MTT 表示，以去除因活細胞數(shù)量改變而引起的誤差。

1.2.2.3 HepG2 細胞胰島素抵抗模型的建立 采用高糖高胰島素法建立胰島素抵抗模型[18]。用胰蛋白酶消化HepG2 細胞后，加入新鮮DMEM 培養(yǎng)液吹打制成細胞密度為2×105細胞/mL 的單細胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，更換為含胰島素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，通過葡萄糖消耗測定判斷胰島素抵抗細胞模型是否建立成功。

1.2.2.4 不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對胰島素抵抗（IR）-HepG2 細胞葡萄糖消耗影響的測定 參考文獻[19]的方法，將細胞以2×105細胞/mL 的密度接種于96 孔板，以含誘導(dǎo)濃度（10-6mmol/L）胰島素的培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h。以加入不同質(zhì)量濃度的多糖組為試驗組，并設(shè)置空白對照組、陽性對照組（二甲雙胍組）、陰性對照組（IR 模型組），在處理24 h 和48 h 后，同1.2.2.2 節(jié)處理，結(jié)果以△GC/MTT 表示。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 計算結(jié)果用平均值±標準差（±s）表示，采用Excel、SPSS 22.0 統(tǒng)計分析軟件進行分析，并用ANOVA 方差分析進行多組間比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同刺激因子發(fā)酵生產(chǎn)的胞外多糖對HepG2 細胞增殖的影響

由表1 可以看出，細胞培養(yǎng)24 h 后，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，細胞存活率逐漸下降。與對照組相比，無刺激因子組、樺樹浸提汁組、VB1組、VB6組以及白樺脂醇組發(fā)酵多糖，在低（20～40 μg/mL）、中質(zhì)量濃度（80～160 μg/mL）時對HepG2細胞增殖無顯著影響，細胞死亡率小于6%，表明其對細胞沒有毒性。當(dāng)質(zhì)量濃度為320 μg/mL 時，細胞死亡率絕大多數(shù)大于6%，但均低于10%，說明多糖質(zhì)量濃度越高，對細胞增殖的影響越大。

表1 不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對HepG2 細胞增殖的影響Table 1 Effect of extracellular polysaccharides produced by different stimulating factors on the proliferation of HepG2 cells

細胞培養(yǎng)48 h 后，除白樺脂醇組外，細胞死亡率均低于10%，說明多糖對HepG2 細胞毒性較小。白樺脂醇組細胞死亡率大于10%，且當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達到320 μg/mL 時，細胞存活率下降顯著（P<0.01），說明過高質(zhì)量濃度的多糖對細胞具有一定的毒性影響。

綜上，添加刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖與不添加刺激因子產(chǎn)生的胞外多糖對HepG2 細胞的增殖影響效果相近。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為20～160 μg/mL 時，對細胞存活率無顯著影響，培養(yǎng)24 h 后，與陽性對照組（二甲雙胍組和胰島素組）無顯著差異，因此，選擇20，40，80，160 μg/mL 為安全范圍進行進一步研究。

2.2 不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對HepG2 細胞葡萄糖消耗的影響

由表2 可知，與空白對照組相比，陽性對照組（10-8mmol/L 胰島素組、10-3mmol/L 二甲雙胍組）葡萄糖消耗量顯著提高。無刺激因子組發(fā)酵產(chǎn)生的多糖，僅在質(zhì)量濃度為80 μg/mL 時顯著促進HepG2 細胞葡萄糖消耗率（與對照組相比，P<0.01），培養(yǎng)24 h 和48 h 后分別提高了80.46%和40.80%。

表2 不同刺激因子發(fā)酵多糖對HepG2 細胞葡萄糖消耗的影響Table 2 Effect of fermented polysaccharides with different stimulating factors on glucose consumption in HepG2 cells

樺樹浸提汁發(fā)酵組隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，HepG2 細胞葡萄糖消耗率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，培養(yǎng)24 h 和48 h 后，與對照組相比，40～160 μg/mL 胞外多糖均能促進細胞葡萄糖攝取，其中葡萄糖攝取率最高處理組為160 μg/mL 樣品組，培養(yǎng)24 h 和48 h 后，攝取率分別提高81.61%和31.20%，分別顯著高于對照組（P<0.01）和胰島素組（P<0.05），但較二甲雙胍組的效果差。

使用VB1發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖培養(yǎng)細胞24 h 后，低質(zhì)量濃度（20～40 μg/mL）時葡萄糖消耗量與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），而80 μg/mL時可顯著提高HepG2 細胞的葡萄糖消耗量，葡萄糖消耗率比對照組提高了56.32%；培養(yǎng)48 h 后，20～160 μg/mL 的多糖均能夠促進HepG2 細胞的葡萄糖消耗，其中80 μg/mL 處理組的葡萄糖攝取率較對照組提高了53.60%，差異具有顯著性（P<0.01），且高于相同試驗條件下胰島素的效果（P<0.01）[20]。此外，80 μg/mL 多糖培養(yǎng)細胞48 h 后，HepG2 細胞的葡萄糖消耗量高于無刺激因子組。

VB6發(fā)酵組隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，葡萄糖的消耗率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與對照組相比，低質(zhì)量濃度組樣品組（40 μg/mL）和中質(zhì)量濃度組（80～160 μg/mL）的胞外粗多糖均能促進細胞對葡萄糖攝取，其中80 μg/mL 樣品組培養(yǎng)24 h和48 h 后的葡萄糖攝取率最高，比對照組分別提高了139.08%，86.40%，比無刺激因子組分別提高了32.48%，32.39%，且顯著高于胰島素組和二甲雙胍組[21]。

添加白樺脂醇發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖，與對照組相比，40 μg/mL 和80 μg/mL 的胞外粗多糖均能促進葡萄糖攝取，葡萄糖攝取率最高的處理組為40 μg/mL 樣品組，培養(yǎng)24 h 和48 h 后對HepG2細胞的攝取率較對照組分別提高了48.28%和22.40%，然而160 μg/mL 處理下的細胞葡萄糖攝取率較對照組低，可能與細胞存活率有關(guān)。此外有研究發(fā)現(xiàn)，將白樺脂醇添加到樺褐孔菌發(fā)酵培養(yǎng)基中能顯著提高三萜類、類固醇類代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，這也說明白樺脂醇可作為樺褐孔菌液體發(fā)酵的刺激因子[19]。

綜上，在細胞培養(yǎng)24 h 和48 h 后，添加不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的多糖均能在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)促進HepG2 細胞的葡萄糖消耗，但不同刺激因子影響體外降血糖活性效果不一致，推測可能是由于不同刺激因子產(chǎn)生的多糖種類和單糖組成等不同，導(dǎo)致其體外降血糖活性不同[22]。160 μg/mL樺樹浸提汁組、80 μg/mL VB1組和VB6組、40 μg/mL 白樺脂醇組多糖均能顯著提高HepG2 細胞24 h 的葡萄糖消耗量，且VB6的促進效果最好。其原因可能是維生素常以輔酶或輔基的形式參與生物催化劑-酶系的活動，能夠促進甲基的形成和轉(zhuǎn)移，促進細胞周圍組織的碳水化合物代謝，參與蛋白質(zhì)及脂肪代謝等重要生命活動，故在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)中常加入VB1、VB6、VB12等作為生長因子刺激菌絲體生長以及代謝產(chǎn)物的生成[23-25]。

2.3 不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對IRHepG2 細胞葡萄糖消耗的影響

根據(jù)表3 結(jié)果顯示，IR 組的葡萄糖消耗量與對照組相比顯著降低，說明模型建立成功，且陽性對照二甲雙胍組（10-3mmol/L）能夠促進HepG2 細胞對葡萄糖的攝取。無刺激因子組胞外多糖細胞培養(yǎng)24 h 后，40～160 μg/mL 的樣品組均能提高IR-HepG2 細胞的葡萄糖消耗量，然而當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h 后，其促進IR-HepG2 細胞葡萄糖消耗的效果下降，與IR 組無顯著差異，且低于空白對照組。

表3 不同刺激因子發(fā)酵多糖對IR-HepG2 細胞葡萄糖消耗的影響Table 3 Effect of fermented polysaccharides with different stimulating factors on glucose consumption in IR-HepG2 cells

使用樺樹浸提汁組產(chǎn)生的胞外多糖培養(yǎng)細胞24 h 后，與IR 組相比，20～160 μg/mL 的胞外多糖均能促進IR-HepG2 細胞葡萄糖的攝取，其中160 μg/mL 樣品組的葡萄糖攝取率最高，較IR 組提高183.33%；培養(yǎng)48 h 后，40～160 μg/mL 的胞外多糖均能促進葡萄糖消耗，其中160 μg/mL 樣品組的葡萄糖攝取率最高，較對照組提高21.55%，較IR組提高40.41%（P<0.01），但較相同試驗條件下二甲雙胍的促進效果差。

使用VB1組產(chǎn)生的胞外多糖培養(yǎng)細胞24 h后，樣品組在40～160 μg/mL 時能提高葡萄糖攝取率，且在160 μg/mL 時促進效果最好，較IR 組提高152.56%（P<0.01）；培養(yǎng)48 h 后，樣品組在40～160 μg/mL 范圍能提高葡萄糖消耗率，其中當(dāng)質(zhì)量濃度為80 μg/mL 時，葡萄糖消耗量顯著提高（P<0.05），較IR 組提高39.59%，較無刺激因子組提高29.55%。

添加VB6發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖，與IR 組相比，20～160 μg/mL 多糖均能促進IR-HepG2 細胞的葡萄糖消耗，培養(yǎng)24 h 后，當(dāng)質(zhì)量濃度為80 μg/mL 時，葡萄糖消耗量顯著升高（P<0.01），較IR組提高196.15%；培養(yǎng)48 h 后，當(dāng)質(zhì)量濃度為40 μg/mL 時，葡萄糖消耗量與IR 組相比提高76.33%，與無刺激因子組相比提高66.80%，且顯著高于相同試驗條件下二甲雙胍組的葡萄糖消耗量（P<0.01）。

添加白樺脂醇發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖在20～160 μg/mL 范圍均能促進IR-HepG2 細胞的葡萄糖消耗量。其中多糖質(zhì)量濃度為80 μg/mL 時（細胞培養(yǎng)24 h），葡萄糖消耗量較IR 組顯著提高（P<0.01），但略低于對照組；培養(yǎng)48 h 后，其葡萄糖消耗量較IR 組顯著提高（P<0.01），且高于對照組，較無刺激因子組提高20.08%。

綜上，在細胞培養(yǎng)24 h 和48 h 后，添加不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖均對IR-HepG2 細胞的葡萄糖消耗具有促進作用，但促進效果不一致，與IR 組相比，160 μg/mL 樺樹浸提汁組、40 μg/mL VB6組、80 μg/mL VB1組和白樺脂醇組發(fā)酵多糖均能顯著提高胰島素抵抗HepG2 細胞48 h 的葡萄糖消耗量，且效果均好于無刺激因子組，其中VB6組的促進效果最為顯著。

3 結(jié)論

在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中添加樺樹浸提汁后，產(chǎn)生的樺褐孔菌能夠促進樺褐孔菌液體深層發(fā)酵產(chǎn)多糖培養(yǎng)的正常及胰島素抵抗HepG2 細胞葡萄糖的消耗量，證明樺樹中確實含有促進樺褐孔菌子實體產(chǎn)生活性多糖的刺激因子，且樺樹浸提汁中的白樺脂醇、VB1和VB6均能在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對多糖的降血糖活性起到不同程度的促進作用，其中VB6的促進效果最顯著，可能是由于添加不同刺激因子產(chǎn)生的發(fā)酵胞外多糖種類和其單糖組成不同所致。后續(xù)可深入研究不同刺激因子對于樺褐孔菌活性多糖生成的調(diào)節(jié)機理，或?qū)ζ浼兓嗵堑臉?gòu)效關(guān)系進一步討論，以期為調(diào)控樺褐孔菌高降血糖活性多糖的產(chǎn)生提供新的思路和理論基礎(chǔ)。