孫譽軒，陳晨，李俊

（淮北師范大學 生命科學學院，安徽 淮北 235000）

0 引言

昆蟲細胞培養(yǎng)作為細胞工程的重要組成部分，已廣泛運用在分子生物學、免疫學、生物反應器研發(fā)等領域［1］.自Grace［2］設計出Grace昆蟲細胞培養(yǎng)基，建立桉蠶（Antheraea eucalypti）卵巢細胞系以來，昆蟲組織及細胞培養(yǎng)取得快速發(fā)展.有統(tǒng)計的數(shù)據(jù)表明，昆蟲中已經(jīng)建成的細胞系已達800余株［3］.但相較于昆蟲的巨大數(shù)量來講，目前已經(jīng)建成的細胞系還遠遠不能滿足對特定物種和特定功能細胞的研究.已建成的細胞系中，母細胞來源通常采用胚胎或卵巢，其優(yōu)點是再生潛力較高，如黃粉蟲、甜菜夜蛾等［4-5］.其他來源亦有中腸、脂肪體、器官芽和血液等［6］.此外，在達摩鳳蝶細胞系的建立過程中采用新孵的幼蟲為母細胞來源［7］.在甜菜夜蛾中，Wu等［8］采用蛹組織為材料，獲得對甜菜夜蛾核多角體病毒（SeMNPV）和苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（AcMNPV）高敏感的NTU-SE細胞系.基于不同組織或細胞類型建立的細胞系豐富昆蟲的細胞系類型，對病毒敏感型細胞株篩選及特定組織的功能研究具有重要意義.

脂肪體組織是昆蟲能量儲存和代謝的主要場所.組成脂肪體組織的細胞主要是滋養(yǎng)細胞（trophocyte）、尿細胞（urocyte）和含菌細胞（mycetocyte）.滋養(yǎng)細胞是脂肪體組織的主要細胞，在不同的昆蟲類型和生命階段其細胞的形狀多樣且不規(guī)則，脂肪以小的脂滴或以大的液泡形式占據(jù)滋養(yǎng)細胞細胞質的大部分空間［9］.脂肪體除為昆蟲生長發(fā)育提供能量外，還具有多種生理功能.脂肪體是昆蟲先天免疫過程中體液免疫的重要組織，通過合成抗菌肽抵御病原菌入侵.此外，脂肪體受蛻皮激素（20E）調控參與蛹期脂肪體解離及變態(tài)發(fā)育過程［10］.目前利用昆蟲脂肪體組織建成的脂肪體細胞系還較少.但對于脂肪體生理功能及脂類代謝等研究來講，脂肪體的原代培養(yǎng)及細胞系建立是十分必要的.

柞蠶是大蠶蛾科的絹絲昆蟲，其體型較大，易于解剖，進行組織或細胞培養(yǎng).關于柞蠶脂肪體的原代培養(yǎng)還未有相關研究報道.本研究以柞蠶脂肪體組織為材料進行原代培養(yǎng)，觀察原代培養(yǎng)過程中脂肪體細胞的各種形態(tài).通過轉染昆蟲表達載體，驗證脂肪體細胞的轉染能力和外源蛋白表達能力.

1 材料與方法

1.1 材料、主要試劑及儀器

柞蠶蛹為青6號品種，購自吉林省蠶業(yè)研究所.Grace培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國GIBCO公司.青霉素、鏈霉素雙抗購自武漢普諾賽.高效轉染試劑StarFectⅡ購自北京康潤誠業(yè).實驗主要儀器為美國Thermo公司8000WJ型培養(yǎng)箱；上海三發(fā)SF-CJ-1型超凈臺；日本奧林巴斯IX71型熒光倒置顯微鏡.

1.2 柞蠶蛹脂肪體組織的獲取

在超凈臺中，將柞蠶蛹置于含75%酒精的離心管中浸洗消毒30 min，隨后用無菌水沖洗蛹體表2～3次，再用滅菌紗布擦干體表水分.用無菌的剪刀將柞蠶表皮剪開一小口，用鑷子夾取脂肪體組織，置于盛有滅菌生理鹽水的無菌平皿中.去除與脂肪體連接的馬氏管、卵巢或精巢等組織后，將脂肪體在含有生理鹽水的平皿中漂洗3次，去除血細胞和脂肪滴.最后轉移至新的盛有生理鹽水的平皿中，再轉移至無菌的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中.

1.3 柞蠶蛹脂肪體的原代培養(yǎng)及染色

用鑷子和剪刀將脂肪體組織分成較小的組織塊，接種于細胞培養(yǎng)瓶T25中，組織塊先不加培養(yǎng)基，并用吸管吸去表面液體，倒置并使其牢固貼壁.經(jīng)2 h倒置貼壁后在組織塊周邊滴加Grace培養(yǎng)基（含20%血清及終濃度100 U/mL青霉素、鏈霉素雙抗），置于27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，緩緩的加入3 mL培養(yǎng)基.隨后置于27℃培養(yǎng)箱中長期培養(yǎng).

將脂肪體組織接種至60 mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一段時間后進行油紅O染色.染色前小心吸棄培養(yǎng)基和脂肪體組織塊，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，向培養(yǎng)皿中加入4%的甲醛固定細胞30 min.隨后用PBS稀釋油紅O染液儲備液至終濃度3 mg/mL，加入培養(yǎng)皿.室溫染色30 min，隨后吸棄染液，并加入PBS洗數(shù)次直到透明，置于顯微鏡下觀察.

1.4 柞蠶脂肪體細胞的轉染

將脂肪體細胞培養(yǎng)于60 mm的培養(yǎng)皿中，按轉染試劑盒的操作說明將7.5μL轉染試劑和2.5μg昆蟲表達載體pIZT/V5-His（帶有綠色熒光蛋白GFP基因）震蕩混勻成復合物，室溫孵育10 min后加入培養(yǎng)皿中，輕搖使其充分混勻.27℃培養(yǎng)24～48 h，置于熒光倒置顯微鏡觀察.

2 結果與分析

2.1 蛹脂肪體原代培養(yǎng)的組織細胞類型和特點

本研究以倒置貼壁法對柞蠶蛹脂肪體進行原代培養(yǎng)，相較于直接貼壁培養(yǎng)，倒置貼壁更有助于脂肪體的貼壁和脂肪體細胞的解離.柞蠶脂肪體組織塊貼壁后約3 d即能觀察到脂肪體細胞的解離，解離的脂肪體細胞部分懸浮于培養(yǎng)基中，部分貼壁于培養(yǎng)瓶底部（圖1A）.經(jīng)過5 d左右的培養(yǎng)后，可觀察到少量脂肪組織塊周圍出現(xiàn)輻射狀細胞，初期較為細長.部分脂肪組織塊周邊可看到含有油滴的細紋狀細胞（圖1B）.隨著時間的增長，這些細長的細胞逐漸的部分聚集，包含的油滴越來越多.

經(jīng)過約5 d的培養(yǎng)，在組織塊周圍出現(xiàn)一些長的梭形細胞，并不斷向外伸展.梭形細胞的細胞體積較大，細胞呈梭形或不規(guī)則圓形、多角形，細胞核位于細胞中央清晰可見.經(jīng)過約15 d培養(yǎng)，梭形細胞不斷向外擴展，呈放射狀生長（圖1C）.此時細胞數(shù)量不斷增加，細胞生長較快，細胞相互之間相互擠壓連接.經(jīng)過約30 d的培養(yǎng)，梭形細胞生長變緩，在梭形細胞的相互連接處開始逐漸出現(xiàn)一些小的圓形脂肪體細胞，其形態(tài)規(guī)則，細胞核清晰可見，可能是由梭形細胞分化產(chǎn)生（圖1D）.

經(jīng)過約10 d左右的培養(yǎng)，部分脂肪體除解離出較大的顏色較深的脂肪體細胞外，在一些組織周圍開始出現(xiàn)小的卵圓形細胞（圖1E），其大小與梭形細胞分化產(chǎn)生的圓形細胞相比略小.在前期培養(yǎng)階段卵圓形細胞的分裂能力較強，隨后細胞不斷長大，顏色加深，并逐漸成熟.培養(yǎng)約30 d左右，許多卵圓形細胞開始聚集成團塊狀，但仍有許多卵圓形細胞不斷增殖（圖1F）.在脂肪體組織周圍解離出的細胞中，卵圓形細胞的數(shù)量最多，生長最快，成熟顏色加深以后與組織解離出的成熟圓形脂肪體較為相近.

除上述幾種生長較快的細胞外，在脂肪體的原代培養(yǎng)過程中，還觀察到一些其他類型的細胞.瘤狀細胞在經(jīng)過約5 d左右的培養(yǎng)時產(chǎn)生（圖1G）.瘤狀細胞是成熟脂肪體解離后多個細胞聚集形成的一種類似瘤體的細胞.瘤狀細胞的分裂增殖能力較弱，經(jīng)過約30 d的培養(yǎng)后，許多貼壁生長的瘤狀細胞不再貼壁，或出現(xiàn)大量的脂肪油滴，逐漸死亡.在培養(yǎng)的過程中，還觀察到少量管道狀細胞，其細胞較其他類型的細胞明顯細長，細胞顏色較淺，較為透明，脂肪滴在整個細胞中可較為明顯觀察到（圖1H）.

圖1 原代培養(yǎng)中不同形態(tài)的柞蠶脂肪體細胞的觀察

2.2 原代培養(yǎng)細胞的轉染和觀察

取培養(yǎng)較好的15 d左右的原代脂肪體細胞，加入轉染試劑和pIZT/V5-His表達載體，使載體轉染進入脂肪體細胞中.由于載體上帶有GFP基因，若轉染進入細胞中，則GFP蛋白表達后可通過熒光顯微鏡觀察到綠色熒光.觀察發(fā)現(xiàn)，轉染24 h后，卵圓形脂肪體細胞已能觀察到綠色熒光（圖2A）.結果表明新生的細胞具有較強的活性，具有一定的轉染能力.經(jīng)過48 h的轉染后，大多數(shù)卵圓形的脂肪體細胞均可見綠色熒光（圖2B），表明轉染效率較高.

圖2 pIZT/V5-His昆蟲表達載體轉染原代培養(yǎng)的脂肪體細胞

2.3 原代培養(yǎng)脂肪體細胞的油紅O染色觀察

油紅O為脂溶性染料，用于脂肪或脂類物質含量高的細胞或組織的染色.基于此，通過油紅O染色對不同形態(tài)的脂肪體細胞進行染色觀察和鑒定.結果表明，在脂肪體細胞的原代培養(yǎng)過程中，梭形細胞和卵圓形細胞的染色均較為清晰，細胞核均清晰可見（圖3A、3B），表明這些細胞中脂肪含量均較高，符合脂肪體細胞的特點.此外，油紅O的染色液表明瘤狀細胞和管道狀細胞也含有較多的脂肪（圖3C、3D）.這些脂肪后期會隨著細胞的死亡以油滴的形式分散于整個培養(yǎng)基或貼壁于培養(yǎng)皿底部，影響其他正常細胞的貼壁生長，給原代培養(yǎng)和細胞系構建帶來一定的困難.

圖3 不同形態(tài)柞蠶脂肪體細胞的油紅O染色觀察

3 討論

昆蟲的脂肪體類似于人體的肝臟和脂肪，是昆蟲脂類和糖類代謝以及多種中間代謝過程的主要器官［11-12］.不同種類昆蟲的脂肪體組織形態(tài)存在一些差異，有些為片層狀，有些為串珠狀或條帶狀等［9］.脂肪體組織通常由中胚層起源的細胞組成，有時也包含一些外胚層細胞，因此在脂肪體原代培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)多種形態(tài)的細胞，并可反映其胚層起源.在柞蠶脂肪體的原代培養(yǎng)過程中觀察到多種形態(tài)的細胞，這些細胞的形態(tài)和特點與文獻［13］研究結果較為一致.柞蠶脂肪體原代培養(yǎng)中，卵圓形細胞的分裂增殖能力較強，從點狀分布逐漸發(fā)展成成片分布，最后聚集成團塊狀.在家蠶脂肪體原代培養(yǎng)中，Kishimoto等［14］發(fā)現(xiàn)卵形細胞和球形細胞聚集成網(wǎng)格狀組織的現(xiàn)象，這些網(wǎng)格狀組織中的細胞分裂繁殖能力較強.除卵圓形細胞外，長期的培養(yǎng)觀察表明，梭形細胞等也具有較強的分裂增殖能力.然而，這些細胞增殖能力隨著培養(yǎng)時間的增加而減緩.油紅O染色也表明許多脂肪體細胞在長期培養(yǎng)后逐漸出現(xiàn)細胞死亡，脂質油滴分散至培養(yǎng)基中.因此，通過脂肪體的原代培養(yǎng)，篩選出增殖能力強的細胞類群，如卵圓形細胞，建立柞蠶脂肪體組織的細胞系具有一定的可行性.

本研究采用的倒置貼壁法更容易使貼壁的組織塊游離出脂肪體細胞，原代培養(yǎng)效果較好.目前已有的柞蠶原代培養(yǎng)多采用精巢、卵巢等分裂能力較強的組織，培養(yǎng)方法采用組織塊直接貼壁法、胰酶消化法等，培養(yǎng)基采用TC-100、Grace等.柞蠶蛹卵巢原代培養(yǎng)中，王林美等［15］對培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基進行對比，表明采用機械分散法及MGM-448培養(yǎng)基的細胞貼壁效果好，生長旺盛.對于分裂能力相對較弱的脂肪體組織來講，倒置貼壁有助于脂肪體組織更好貼壁并適應新的體外培養(yǎng)環(huán)境，較快解離或游離出脂肪體細胞，加快原代培養(yǎng)進程.因此，培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基等條件可影響細胞的分裂和分化潛能，進而影響柞蠶相關組織細胞系的建立.本研究為柞蠶原代培養(yǎng)提供良好的方法補充，可為柞蠶脂肪體功能研究打下良好的基礎.

目前，柞蠶中還未有脂肪體細胞系建立的報道，僅有柞蠶胚胎細胞系的建立和成蟲卵巢細胞株的建立［16］.細胞株系的建立對相關組織的功能研究提供很好的材料，但一般周期較長.本研究成功在原代培養(yǎng)的脂肪體細胞中直接進行轉染表達外源基因，表明脂肪體細胞較好的轉染能力，特別是一些活性較強的新生細胞.因此，在原代培養(yǎng)過程中去除較大的組織塊，通過細胞轉染可實現(xiàn)基因在脂肪體細胞中表達，這對于柞蠶脂肪體功能的研究具有重要的意義.