王曉丹，劉寶玲，李潤植

（山西農業(yè)大學農學院，山西太谷030801）

藻類植物生活在復雜多變的棲息地，經(jīng)常要適應極其惡劣的環(huán)境。它們的代謝受到水溫、鹽分、光照和營養(yǎng)成分等因素的影響，為了生存，被迫快速適應不斷變化的環(huán)境條件，產(chǎn)生大量具有生物活性的次生代謝物[1]。在逆境條件下，雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）能大量積累蝦青素及一些化合物，其中，蝦青素具有抗氧化、抗炎、抗癌和增強免疫等活性，被廣泛應用于功能型營養(yǎng)食品和藥物中。因此，研究逆境條件下，雨生紅球藻中這些活性物質合成積累機制以及建立相應的調控技術，促進微藻高效生產(chǎn)這些有益生物資源，以達到商業(yè)化應用是目前研究的一個活躍領域[2]。

應對不利的環(huán)境條件，植物（微藻）會在細胞和分子水平上利用各種機制來應對[3]。前期的研究表明，雨生紅球藻797在高光脅迫條件下，細胞內產(chǎn)生蝦青素，同時發(fā)生細胞自噬對抗活性氧（reactive oxide species，ROS），總脂肪酸的含量增加，脂肪酸成分發(fā)生改變，飽和脂肪酸增加而不飽和脂肪酸降低[4]。雨生紅球藻中氨基酸和無機礦質元素是否也協(xié)同蝦青素參與逆境調控卻未知。前人研究表明，脯氨酸在花生[5]、柵藻（Scenedesmus quadricauda）[6]和嗜鹽真菌（halophile fungi）[7]中，具有抗逆活性。筆者研究17種水解氨基酸，以探討高光誘導雨生紅球藻中蝦青素積累時，脯氨酸是否也參與對抗高光的氧化脅迫，以及其他氨基酸的代謝變化。一些藻類能吸收周圍水域中的可吸收元素，一些元素在藻細胞內的積累量能達到其生活水域中該元素濃度的數(shù)倍[8]。所以，在研究雨生紅球藻適應環(huán)境脅迫下，有機化合物（蝦青素）積累變化的同時，也需要分析細胞體內氨基酸和無機元素的動態(tài)變化。

本試驗對雨生紅球藻797藻株在高光脅迫條件下，藻細胞形態(tài)、細胞中蝦青素含量、氨基酸和無機元素等動態(tài)變化進行分析，以期深入揭示雨生紅球藻細胞脅迫應激的生理生化反應機制。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藻種及培養(yǎng)基 雨生紅球藻（797株系）購自上海光語生物科技有限公司。藻細胞以光自養(yǎng)的方式培養(yǎng)在無菌的BG-11培養(yǎng)基中[9]。

1.1.2 主要儀器 氨基酸自動分析儀（Biochrom 30+）；正置顯微鏡（奧林帕斯，BX53，日本）；原子吸收光譜儀（德國耶拿Zip 700型）；SP-Max 2300A2光吸收型全波長酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）；血球計數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司；人工氣候箱（寧波東南儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 雨生紅球藻797的培養(yǎng) 在人工氣候箱中靜置培養(yǎng)，正常條件及高光誘導條件下的培養(yǎng)參照文獻[4]進行。

1.2.2 雨生紅球藻797生長曲線的測定 在紫外消殺4 h以上的超凈工作臺中，進行雨生紅球藻的接種。無菌條件下，吸取10 mL雨生紅球藻藻液加入到滅菌的250 mL錐形瓶中（含100 mL BG-11液體培養(yǎng)基），在人工氣候箱中靜置培養(yǎng)。每間隔2 d進行一次取樣，使用血細胞計在正置顯微鏡下進行細胞計數(shù)[9]。同時，利用酶標儀在680 nm波長下測定藻液的吸光度值（OD680）。試驗設置3個平行，每個平行測定3次。

1.2.3 細胞形態(tài)的顯微觀察 在高光脅迫條件下處理雨生紅球藻，在0、7、10、13、16和19 d取各試驗組的懸浮藻液1 mL，放入1.5 mL離心管中，放置1 min左右，藻體沉降到離心管底。吸取10 μL沉降的藻液滴到載玻片上，蓋上蓋玻片，在正置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照采集圖片。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 蝦青素的測定 分別取高光脅迫7、10、13、16和19 d的藻細胞凍干樣品各5 mg左右，使用二甲基亞砜提取[4]后，采用分光光度法測定蝦青素的質量濃度[10]。

式中，CA為蝦青素的質量濃度，OD530為530 nm處的吸光度值，m（mg）為凍干細胞樣品的質量。

1.3.2 氨基酸的測定 稱取0.05 g左右的雨生紅球藻凍干藻粉，采用酸水解法測定17種氨基酸[11]。

1.3.3 粗蛋白的測定 稱取100 mg左右的凍干藻粉，使用南京建成生物公司的試劑盒進行測定。按照試劑盒的說明進行總蛋白的測定，使用酶標儀測定樣品、雙蒸水和蛋白標準品的OD595值。

1.3.4 礦質元素的測定

1.3.4.1 樣品的消解 按照國標GB/T5009.12—2003、GB/T5009.15—2003和GB/T5009.17—2003中的方法進行消煮，待消煮液冷卻后轉移入10 mL容量瓶，加入1%（m/V）SrCl21 mL，再用1%（V/V）的HCl定容到10 mL。同時，做2個試劑空白。

1.3.4.2 標準溶液的配制 在10 mL的容量瓶中加入1 mL 1%的SrCl2和各濃度梯度對應的標準溶液量，再用1%的HCl定容到刻度。標準溶液購買自鋼鐵研究總院分析測試研究所鋼研納克檢測技術有限公司，屬于國家標準物質。使用原子吸收光譜儀的火焰法進行測定。各元素標準曲線的相關系數(shù)（r）≥0.98。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。采用t檢驗來分析培養(yǎng)細胞處理組（誘導16 d）和對照組（指數(shù)生長中期）差異是否有統(tǒng)計學意義，以*和**分別表示P≤0.05和P≤0.01[12]。

2 結果與分析

2.1 正常培養(yǎng)條件下，雨生紅球藻797生長密度的動態(tài)變化

為了建立雨生紅球藻綠色生長階段的生長曲線以及OD680值和單位體積細胞個數(shù)的對應關系，在正常培養(yǎng)條件下，每2 d取樣測定OD680值和進行細胞計數(shù)。從圖1-A可以看出，雨生紅球藻797在OD680＝0.6左右時進入指數(shù)生長中期，當OD680達到0.759時，開始進入穩(wěn)定期。在人工氣候箱中，用盛有100 mL BG-11培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶培養(yǎng)該藻株，細胞密度最大可達4.167×105個細胞/mL。需要指出的是，一般來講，以分裂方式進行繁殖的微藻等微生物，接種到適應的液體培養(yǎng)基中，生長曲線會出現(xiàn)4個階段：緩慢生長期、對數(shù)增長期、穩(wěn)定期和凋亡期。本試驗是以1∶10的比例進行藻液接種，因此，沒有出現(xiàn)緩慢生長期（圖1-B）。此外，本試驗測定雨生紅球藻綠色階段的生長情況，所以，也沒有檢測凋亡期。

利用作圖分析軟件origin 9.1，以測定生長曲線的雨生紅球藻藻液的OD680值為橫坐標，細胞密度為縱坐標，先建立OD680值和細胞密度對應的散點圖，再進行線性擬合。由圖2可知，在標準培養(yǎng)條件下，綠色生長階段的雨生紅球藻797的OD680和細胞密度呈線性關系。OD680在0.1～0.9的范圍內，符合朗伯-比爾定律，獲得的回歸方程為y＝-0.769 98＋5.891 81x，式中，y是細胞密度，即細胞個數(shù)，單位：105個細胞/mL，x是OD680測定的吸光度值，相關系數(shù)為r＝0.987 64。說明2個變量線性相關性顯著。

2.2 高光誘導對雨生紅球藻細胞形態(tài)和蝦青素含量的影響

從圖3、4可以看出，指數(shù)生長期（0 d）的雨生紅球藻797呈現(xiàn)綠色的球形或橢圓形；在高光誘導7 d時，雨生紅球藻797細胞都變成圓形，整體呈紅色，開始積累蝦青素，含量達0.59%；在高光誘導10 d時，雨生紅球藻797蝦青素基本充滿整個細胞，還能看到一點黃綠色在細胞周圍，蝦青素含量達到1.27%；在高光誘導13、16 d時，細胞中充滿蝦青素，雨生紅球藻797細胞呈現(xiàn)黑紅色，蝦青素含量分別達到2.17%和2.78%；高光誘導19 d時，蝦青素含量高達3.18%，整個細胞的邊緣變成亮紅色，細胞中夾雜黑紅色。表明隨著雨生紅球藻細胞內蝦青素含量的增加，細胞形態(tài)、大小和顏色也發(fā)生改變。

2.4 高光脅迫下雨生紅球藻氨基酸含量和粗蛋白含量的動態(tài)變化

從表1可以看出，在高光誘導條件下，雨生紅球藻797細胞中的脯氨酸含量極大增加，由指數(shù)生長中期（對照）的12.61 μg/mg增加到高光誘導16 d時的24.72 μg/mg，差異極顯著，增加了96.03%（P≤0.01）；而在高光誘導16 d時，與對照相比，其他氨基酸成分都明顯降低（P≤0.01）。其中，異亮氨酸＋亮氨酸和苯丙氨酸的含量分別降低了78.28%和77.75%；纈氨酸＋胱氨酸降低了39.13%；谷氨酸、蛋氨酸、組氨酸和精氨酸含量分別降低了58.40%、57.07%、59.19%和50.64%；其他氨基酸含量都下降了68.52%～73.47%。在高光誘導條件下，與大部分氨基酸含量都顯著下降相對應，粗蛋白的含量也顯著降低，由對照的244.21 μg/mg降低到高光誘導16 d時的196.43 μg/mg，減少了19.57%（P≤0.01）。

表1 雨生紅球藻797在指數(shù)生長中期（對照）和蝦青素高積累期（誘導16 d）的氨基酸和粗蛋白含量 μg/mg

2.5 高光脅迫下雨生紅球藻797主要礦質元素含量的動態(tài)變化

從表2可以看出，與對照組相比，高光處理16 d的雨生紅球藻細胞中Ca和Mg含量都顯著增加（P≤0.01），Ca在雨生紅球藻細胞中的含量由0.740 μg/mg增加到1.680 μg/mg，增加了127.03%；雨生紅球藻細胞中Mg的含量由0.046 μg/mg增加到2.677 μg/mg，增加了5 719.5%。K、Na、Fe、Cu、Mn和Zn的含量都顯著降低（P≤0.01），分別比對照組降低了71.53%、60.64%、79.17%、54.55%、81.44%和41.33%。

表2 雨生紅球藻797在指數(shù)生長中期（對照）和蝦青素高積累期（誘導16 d）的礦質元素含量 μg/mg

3 結論與討論

本研究表明，在雨生紅球藻797的綠色生長階段OD680和細胞個數(shù)之間存在強線性關系（r＝0.987 64）。在其他研究結果中也驗證了綠藻的OD680和細胞個數(shù)之間存在很強的線性關系[13]。

在正常培養(yǎng)條件下，雨生紅球藻細胞是處于營養(yǎng)生長階段的能動的綠色細胞。但是，在逆境條件下，雨生紅球藻細胞先是由能動的綠色細胞變?yōu)椴荒軇拥木G色細胞，隨后，開始積累蝦青素變?yōu)椴荒軇拥募t色細胞，最后積累高量蝦青素的紅色孢子囊細胞形成[14]。本研究對綠色階段（指數(shù)生長中期）以及逆境高光誘導階段雨生紅球藻細胞形態(tài)的觀察與前人對雨生紅球藻營養(yǎng)生長階段及逆境條件下細胞形態(tài)變化的描述一致。

光是微藻的能量來源，在微藻的培養(yǎng)中起到重要作用。但是，持續(xù)的高光照不利于雨生紅球藻綠色階段細胞生物量的增長，因為持續(xù)的高光照使雨生紅球藻細胞變成厚壁孢子而停止分裂[15]。所以，在本試驗高光誘導的時間段內（0～19 d），雨生紅球藻797細胞內的蝦青素持續(xù)積累，以抵抗高光氧化產(chǎn)生的ROS對藻細胞的細胞膜、DNA和蛋白質等的損傷[16]。

本研究表明，在高光誘導條件下，雨生紅球藻797細胞中脯氨酸的含量比對照組增加了96.03%。這是因為在不利的環(huán)境條件下，細胞通過改變脯氨酸代謝來保持細胞內環(huán)境的平衡[17]。前人研究表明，雨生紅球藻在積累蝦青素的過程中，細胞內的蛋白質含量下降了36.7%[18]，并且蛋白質的含量與氨基酸的含量成正相關。本試驗中雨生紅球藻797藻株在高光脅迫下細胞大部分氨基酸的組分降低，粗蛋白的含量降低了24%。

在高光脅迫下，雨生紅球藻797細胞的Ca含量顯著增加（P≤0.01），這是因為雨生紅球藻細胞在逆境條件下形成厚壁孢子，鈣離子主要以果膠酸鈣的形式存在于細胞壁中，起到固定細胞壁和維持細胞形態(tài)的作用[19]。表明雨生紅球藻對高光脅迫產(chǎn)生了適應機制，對鈣的吸收增加，以利于逆境脅迫信號的傳遞、細胞壁的增厚和維持細胞膜形態(tài)，防止高光毒害產(chǎn)生的ROS等有害物質對細胞膜造成的破壞。

前人研究表明，缺Mg嚴重影響植物的光合作用[20]。本研究結果表明，雨生紅球藻797在高光條件下，Mg含量升高，以保證脅迫條件下，光合作用的正常進行；Fe含量顯著下降，可能是因為Fe2+參與催化哈伯-韋斯反應產(chǎn)生ROS，以促進碳源向蝦青素合成途徑轉移來提高蝦青素含量[21-22]。

本研究表明，高光脅迫下雨生紅球藻細胞內K的含量極顯著低于對照組（P≤0.01）。與本試驗結果一致的是，對番茄的根區(qū)同時進行低溫和鹽脅迫的誘導，使得K的含量顯著下降[23]。這可能是因為逆境脅迫影響K+轉運蛋白酶的活性，進而抑制鉀離子的吸收[24]。

本研究結果表明，高光脅迫使得雨生紅球藻細胞中Na、Cu、Mn和Zn的含量極顯著低于指數(shù)生長中期（對照）雨生紅球藻中的含量（P≤0.01）。前人研究也表明，干旱脅迫顯著抑制了番茄、玉米和蘋果植株對大量元素和微量元素的吸收[25-27]。這是因為逆境脅迫抑制了植物和微藻對礦質元素的同化吸收，導致植株和微藻相對生長速率和生物量積累的減少[28]。

總之，高光脅迫下，雨生紅球藻細胞中粗蛋白和大部分氨基酸以及礦質元素含量降低，以降低光合作用和細胞的生長率，同時，誘發(fā)蝦青素積累、脯氨酸、Mg和Ca等元素含量升高，以增強藻細胞抵御氧化脅迫的活力，共同應對高光對藻細胞造成的毒害作用。本研究為探究雨生紅球藻細胞抵抗逆境脅迫的相關機制等方面奠定了基礎，進而為建立外源調控蝦青素富集的有效技術提供了科學依據(jù)。