鳳舞劍，朱 強(qiáng)，白耀博，曹 丹，陶佩琳

（1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院/徐州市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221006；2.江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005）

草莓因種植周期短、見效快、收益高，而被廣泛種植，同時(shí)也深受消費(fèi)者喜歡。江蘇作為草莓發(fā)展重點(diǎn)省份，種植規(guī)模與產(chǎn)量均居全國(guó)前列[1]，尤其是近幾年來江蘇各地著力發(fā)展草莓產(chǎn)業(yè)，主要以鎮(zhèn)江市句容市、連云港市東?？h、徐州市賈汪區(qū)及銅山區(qū)等為中心，打造出多個(gè)草莓特色小鎮(zhèn)，如徐州市賈汪區(qū)耿集鎮(zhèn)“莓好田園”現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生態(tài)小鎮(zhèn)、徐州市銅山臺(tái)上草莓特色小鎮(zhèn)等[2]。徐州地區(qū)草莓生產(chǎn)規(guī)模已達(dá)2.3萬hm2，栽培模式主要以保護(hù)地為主，因連作時(shí)間長(zhǎng)、管理粗放，導(dǎo)致土傳病害嚴(yán)重，主要表現(xiàn)在草莓苗定植后根腐病大發(fā)生，導(dǎo)致大面積缺苗或斷壟，給種植戶生產(chǎn)帶來較大的損失，嚴(yán)重阻礙了草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，草莓根腐病致病菌種類多且分布廣，徐州地區(qū)草莓根腐病致病菌病原尚未有報(bào)道。因此，篩選、分離及鑒定徐州地區(qū)根腐病病原菌種類，為預(yù)防草莓根腐病的防控提供科學(xué)的依據(jù)，對(duì)于指導(dǎo)當(dāng)?shù)夭葺a(chǎn)實(shí)踐、推動(dòng)草莓產(chǎn)業(yè)綠色防控具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集

樣本采集于江蘇省徐州市徐州安耕現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園草莓種植基地，經(jīng)徐州市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李文紅教授鑒定其為典型根腐病病株。

1.2 病原菌的分離與純化

取典型病株切取根部，用自來水反復(fù)沖洗至潔凈無雜質(zhì)，將病變組織切成1 cm×1 cm塊狀。用無菌鑷夾取病塊組織置于75%乙醇溶液中浸泡30 s，取出用無菌水沖洗干凈，放置于0.1%氯化汞溶液中浸泡2 min，取出后用無菌水沖洗干凈，然后用無菌紗布擦拭掉水分。用無菌解剖刀將病組織塊切成5 mm×5 mm規(guī)格，放于PDA培養(yǎng)基上在恒溫25 ℃室內(nèi)暗條件下培養(yǎng)5 d[3]。自菌落邊緣挑取不同形態(tài)菌絲進(jìn)行分離培養(yǎng)[4]，純化后于恒溫箱中保存。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

采用平板扦片法[5]。將菌株XZ-D01置于PDA培養(yǎng)基上并進(jìn)行25 ℃恒溫培養(yǎng)，在菌絲生長(zhǎng)初期插入已滅菌的蓋玻片，5 d后菌絲延伸至蓋玻片上，用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液染色后挑取菌絲并制作水浸片，用顯微鏡觀察菌絲生長(zhǎng)情況及其形態(tài)特征。

1.3.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定

挑取病原體，經(jīng)培養(yǎng)后提取DNA[6]再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)定堿基序列，將獲得的序列存儲(chǔ)于NCBI網(wǎng)站并提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，采用BLAST軟件，比對(duì)病原菌堿基序列與其他草莓根腐病病原菌堿基序列同源性[7]，最后借助MEGA 7.0軟件構(gòu)建rDNA-ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓根腐病病原菌的分離

采用組織分離法，從徐州市賈汪區(qū)“莓好田園”現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園草莓生產(chǎn)基地根腐病害植株（圖1-a、圖1-b）上共分離出細(xì)菌4株（圖1-c），真菌11株（圖1-d）；其中，5株真菌表達(dá)出典型的根腐病病原菌致病特征，分別命名為CMGF-1、CMGF-2、CMGF-3、CMGF-4、CMGF-5。

圖1 草莓根腐病病株及病原菌的分離

2.2 草莓根腐病病原菌的鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)學(xué)鑒定

由圖2可知，菌株CMGF-1—GMGF-5中有3株產(chǎn)菌核，3株產(chǎn)色素，5株初生菌絲均為白色，生長(zhǎng)迅速（5 d可鋪滿平板）；5株氣生菌絲發(fā)達(dá)，空間伸展力強(qiáng)；其中，CMGF-4生長(zhǎng)速度最快，氣生菌絲呈絲絨狀；3株菌落輻射呈環(huán)狀，2株菌落邊緣呈不規(guī)則狀，詳述如表1，CMGF-1：邊緣整齊，有白色、發(fā)達(dá)的氣生菌絲，產(chǎn)黑色菌核，不產(chǎn)色素，呈環(huán)狀輻射；CMGF-2：邊緣參差不齊，氣生菌絲發(fā)達(dá)且顯白色，產(chǎn)黑色菌核，產(chǎn)黃色素，外緣生菌絲呈黃色，內(nèi)緣生菌絲呈白色，無輻射狀；CMGF-3：邊緣參差不齊，氣生菌絲發(fā)達(dá)且呈白色，產(chǎn)黃色素，無輻射狀；CMGF-4：邊緣齊整，氣生菌絲發(fā)達(dá)且呈白色，產(chǎn)黑紫色素，不產(chǎn)菌核，呈環(huán)狀輻射；CMGF-5：邊緣整齊，氣生菌絲發(fā)達(dá)呈白色，不產(chǎn)色素且無菌核，呈環(huán)狀輻射。

表1 菌落形態(tài)

圖2 CMGF-1—CMGF-5菌落形態(tài)學(xué)特征（5 d）

2.2.2 微觀形態(tài)學(xué)鑒定

由圖3可知：CMGF-1是無隔膜、無顏色的氣生菌絲，分生孢子梗直立，產(chǎn)孢于分生孢子座上，分生孢子短桿狀，無隔膜，脫落孢子盤呈簇狀。

圖3 CMGF-1微觀形態(tài)觀察（40×10倍）

由圖4可知：CMGF-2和CMGF-3是細(xì)長(zhǎng)、彎曲的氣生菌絲，有隔膜，隔膜處有縊縮，產(chǎn)生紡錘形分生孢子，頂端無附屬絲，脫落后可見葡萄狀孢子盤。這2個(gè)菌株微觀形態(tài)極其相似，比對(duì)圖2菌落形態(tài)學(xué)特征，可判定其為同屬，是否為同種尚需進(jìn)一步研究。

圖4 CMGF-2和CMGF-3微觀形態(tài)觀察（40×10倍）

由圖5可知：CMGF-4細(xì)長(zhǎng)筆直的氣生菌絲無隔膜，產(chǎn)球狀分生孢子，單梗產(chǎn)圓鈍形孢子，分布于兩側(cè)，釋放后呈較為典型鐮刀狀。依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》[8]可初步診斷為串珠鐮刀菌。

圖5 CMGF-4微觀形態(tài)觀察（40×10倍）

由圖6可知：CMGF-5直而長(zhǎng)的氣生菌絲無隔膜，單梗產(chǎn)圓鈍孢子，釋放后孢子細(xì)長(zhǎng)且兩端尖銳，呈鐮刀狀。依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》[8]可初步診斷為尖孢鐮刀菌。

圖6 CMGF-5微觀形態(tài)觀察（40×10倍）

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

由圖7可知：CMGF-1與K C010547.1Colletotrichum gloeosporioides在進(jìn)化樹中最近緣，可鑒別為同種，則CMGF-1為膠孢炭疽菌，近緣性為58%。

圖7 CMGF-1系統(tǒng)進(jìn)化樹

由圖8可知：CMGF-2與K Y_606543.1Neopestalotiopsis clavispora在進(jìn)化樹中最近緣，可鑒別為同種，則CMGF-2為棒孢擬盤多毛孢，近緣性高達(dá)87%。

圖8 CMGF-2系統(tǒng)進(jìn)化樹

由圖9可知：CMGF-3與K R_052094.1Neopestalotiopsis clavispora在進(jìn)化樹中最近緣，可鑒別為同種，則CMGF-3為棒孢擬盤多毛孢，近緣性為58%。圖8和圖9系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)一步驗(yàn)證了CMGF-2和CMGF-3菌株的近緣性，可推斷出這2個(gè)菌株屬于同種的2個(gè)亞種。

圖9 CMGF-3系統(tǒng)進(jìn)化樹

由圖10可知：CMGF-4與NR_159818.1Fusarium continuum在進(jìn)化樹中最近緣，可鑒別為同種，則CMGF-4為串珠鐮刀菌，近緣性達(dá)91%，進(jìn)一步驗(yàn)證了2.2.2形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)論。

圖10 菌株CMGF-4系統(tǒng)進(jìn)化樹

CMGF-5的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果同CMGF-4。

3 結(jié)論與討論

本研究采用組織分離法，從江蘇省徐州市賈汪區(qū)“莓好田園”現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園草莓生產(chǎn)基地取樣，通過分離、純化，從大量感病植株病原菌落中獲取了5個(gè)真菌菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)甄別與分子生物學(xué)堿基序列測(cè)定，鑒定結(jié)論是：CMGF-1是膠孢炭疽菌或其亞種，CMGF-2、CMGF-3是棒孢擬盤多毛孢或其亞種，CMGF-4是串珠鐮刀菌或其亞種，CMGF-5是尖孢鐮刀菌或其亞種。徐州地區(qū)草莓根腐病病原菌是由多種病原菌長(zhǎng)期適應(yīng)連作生境而進(jìn)化的結(jié)果。目前國(guó)內(nèi)草莓根腐病致病菌多達(dá)20種[9-15]，癥狀表達(dá)具有多樣化。從徐州地區(qū)草莓根腐癥狀表達(dá)上來看，草莓黑根根腐致病菌是鐮刀菌和擬盤多毛孢菌，此類發(fā)病率高、危害重；其次，草莓紅中柱根腐致病菌是病原菌膠孢炭疽菌。不同的區(qū)位環(huán)境可能會(huì)導(dǎo)致病原菌的基因構(gòu)型及致病力差異化，基于rDNA-ITS序列分析低緣性關(guān)系與此是否具有相關(guān)性，尚需進(jìn)一步研究。