龍鳳 李劍鋒 李暉仁 何杰勇 秦桂清 黃麗非 張色萍 李桂花 農(nóng)潔田

（1.崇左市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 崇左532200；2.崇左市畜牧站，廣西 崇左532200；3.崇左市江州區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 崇左532200）

口蹄疫（Foot-and-Mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度傳染性的疫病，該病傳播速度快，距離遠(yuǎn)。易感動物包括豬、牛、羊等偶蹄動物。臨床上以口鼻、乳房、蹄冠和趾間的皮膚黏膜出現(xiàn)水泡和爛斑為特征?？谔阋吣壳耙寻l(fā)現(xiàn)七個血清型，分別為南非1、2、3型，亞洲Ⅰ型和A、O、C型，我國主要流行的血清型為O型、A型和亞洲Ⅰ型。口蹄疫不同血清型之間無交叉保護(hù)，防控難度大，是危害我國畜牧業(yè)健康發(fā)展的一類重大動物疫病[1，2]。

小反芻獸疫（Peste des petits ruminants,PPR）俗稱羊瘟，是由小反芻獸疫病毒引起的一種急性、烈性傳染病，主要感染小反芻動物，以山羊和綿羊最為易感，臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎等，發(fā)病率和致死率可達(dá)100%。該病于2007年7月首次傳入我國西藏，2013年11月起再次傳入新疆，隨后甘肅、內(nèi)蒙、寧夏等地相繼暴發(fā)疫情，并且在數(shù)月內(nèi)蔓延至全國大部分省份[3，4]。

當(dāng)前，這兩種疫病暫無有效治療措施，疫苗免疫是預(yù)防這兩種疫病發(fā)生的最重要手段。近年來崇左市大力發(fā)展羊養(yǎng)殖業(yè)，始終將FMD和PPR防控作為防疫工作的重點(diǎn)，通過強(qiáng)制免疫FMD滅活疫苗和PPR弱毒疫苗等手段達(dá)到對這兩種疫病防控。

為了合理使用口蹄疫及小反芻獸疫疫苗，掌握兩種疫苗不同免疫方法對免疫抗體的效價(jià)和消長規(guī)律的影響，降低免疫成本，提高工作效率，本研究對崇左市規(guī)?；驁隹谔阋逴-A型二價(jià)滅活苗和小反芻獸疫弱毒苗（Clone 9株）免疫后羊群進(jìn)行抗體水平監(jiān)測，通過比較兩種疫苗以不同的方法免疫后抗體變化規(guī)律和免疫持續(xù)期，綜合評估這兩種疫苗在邊境山區(qū)羊場的臨床免疫效果，為進(jìn)一步優(yōu)化適合邊境山區(qū)羊場的疫苗免疫程序提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 在崇左市選取2個飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相當(dāng)?shù)囊?guī)模羊場，每個羊場選3月齡肉羊45只，試驗(yàn)羊品種、大小相近，臨床檢查健康，從未接種過口蹄疫疫苗和小反芻獸疫疫苗。

1.1.2 疫苗種類 口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活疫苗（O/MYA98/BY/2010株+Re-A/WH/09株），由中農(nóng)威特生物科技股份有限公司生產(chǎn)；小反芻獸疫活疫苗（Clone9株），由西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠生產(chǎn)。

1.1.3 檢測試劑 口蹄疫病毒O型抗體ELISA檢測試劑盒（JNT金諾診斷，批號：20190405）和A型抗體ELISA檢測試劑盒（JNT金諾診斷，批號：20190812）均購自北京金諾百泰生物技術(shù)有限公司；小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒（青島立見，批號:02171907），購自青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心。

1.1.4 儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀（RT-6100），購自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；移液器，購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組與免疫及采血時(shí)間設(shè)定 將兩個羊場90只試驗(yàn)羊隨機(jī)分為5個組，其中A-D組為試驗(yàn)組，每組20只；E組為對照組，10只。A組同時(shí)分點(diǎn)免疫口蹄疫O-A疫苗、小反芻獸疫疫苗；B組先免疫口蹄疫O-A疫苗，7d后再免疫小反芻獸疫疫苗；C組先免疫小反芻獸疫疫苗，7d后再免疫免疫口蹄疫O-A疫苗；D組同時(shí)分點(diǎn)免疫口蹄疫O-A疫苗、小反芻獸疫疫苗，28d后再進(jìn)行二免。

口蹄疫O-A疫苗每只羊頸部肌肉注射2mL，小反芻獸疫疫苗每只羊頸部皮下注射1mL。試驗(yàn)分組及各組免疫情況見表1。所有羊只分別于免疫后0d、7d、14d、28d、42d、56d、70d、120d、150d頸靜脈采血備檢。

表1 試驗(yàn)分組及疫苗免疫情況

1.2.2 血清樣品采集、處理方法 按試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用5mL采血貯血器采血，每管采集3mL左右，離心后分離血清，分裝并做好標(biāo)記。于-20℃保存待檢。

1.2.3 檢測方法 口蹄疫O型、A型抗體采用固相阻斷ELISA方法，檢測FMDV結(jié)構(gòu)蛋白抗體，按照試劑盒說明書進(jìn)行；小反芻獸疫抗體檢測按照小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 口蹄疫O型、A型抗體：試驗(yàn)成立條件 陰性對照OD450nm平均值大于0.7；陽性對照S/N平均值＜0.3；S/N=樣品OD值/（NC OD均值），NC OD均值=NC1+NC2。判定：S≤0.5·N判為陽性，S＞0.5·N判為陰性。

小反芻獸疫抗體：陰性血清平均OD值，即OD·NC；陽性血清平均OD值即ODPC，酶標(biāo)抗體平均OD值即ODcm；樣品的OD值即ODS，計(jì)算陰性對照、陽性對照、樣品的阻斷率PB。

PB=100-100*OD/ODcm。試驗(yàn)成立條件：PBPC＞60，PBNC＜40，試驗(yàn)結(jié)果有效。判定：PBS＞50，結(jié)果為陽性；PBs≤50，結(jié)果為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 口蹄疫O型免疫抗體檢測結(jié)果

從表2可以看出，試驗(yàn)羊免疫前口蹄疫O型抗體均為陰性。A-C組山羊分別在各自免疫后第7d開始產(chǎn)生抗體，28d時(shí)抗體水平最高，分別達(dá)到80%、85%、85%，超過70%陽性率的國家標(biāo)準(zhǔn)?？谔阋逴型免疫抗體從免疫后42d開始下降，70d時(shí)接近國家70%陽性率標(biāo)準(zhǔn)，120d時(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于70%的標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)免疫和兩種疫苗分先后免疫的3組不同免疫方式，對口蹄疫O型抗體陽性率影響差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同免疫分組中口蹄疫O型抗體檢測結(jié)果 單位：%

對比A組和D組檢測結(jié)果可以看出，只進(jìn)行一次免疫的A組抗體陽性率在28d時(shí)最高，之后開始下降，第70d時(shí)下降到70.59%，150d時(shí)下降到26.67%；而D組在一免后28d加強(qiáng)免疫一次，口蹄疫O型抗體陽性率在二免后14d達(dá)到100%，并且到150d時(shí)還有73.33%的抗體陽性率，說明二次免疫增強(qiáng)了免疫效果。

2.2 口蹄疫A型免疫抗體檢測結(jié)果

從表3來看，試驗(yàn)羊免疫前口蹄疫A型抗體均為陰性。分析A-C組檢測結(jié)果可以看出，山羊在各自免疫后第7d開始產(chǎn)生抗體，28d時(shí)抗體水平最高，均達(dá)到80%，C組在7d時(shí)免疫口蹄疫疫苗，42d時(shí)抗體水平最高達(dá)到80%，到70d時(shí)A-C組的口蹄疫A型抗體均已低于70%陽性率標(biāo)準(zhǔn)。3組不同免疫方式下對口蹄疫A型抗體陽性率影響差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同免疫分組中口蹄疫A型抗體檢測結(jié)果 單位：%

對比A組和D組檢測結(jié)果可以看出，只進(jìn)行一次免疫的1組抗體陽性率在28d時(shí)最高，之后開始下降，第70d時(shí)下降到64.71%，150d時(shí)下降到20%；而D組在一免后28d加強(qiáng)免疫一次，口蹄疫A型抗體陽性率在二免后14d達(dá)到100%，并且到150d時(shí)還有73.33%的抗體陽性率，說明二次免疫增強(qiáng)了免疫效果。

2.3 小反芻獸疫免疫抗體檢測結(jié)果

從表4可以看出，試驗(yàn)羊免疫前小反芻獸疫抗體均為陰性。A、C、D組在0d時(shí)免疫小反芻獸疫疫苗，7d時(shí)抗體陽性率均達(dá)90%以上，B組在7d時(shí)免疫小反芻獸疫苗，14d時(shí)抗體陽性率達(dá)95%。所有組在免疫后第7d均產(chǎn)生很高的抗體陽性率，并且持續(xù)到150d時(shí)仍有90%以上的陽性率。綜合分析4個試驗(yàn)組檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合其他疫苗免疫、單獨(dú)免疫、增加二次免抗，小反芻獸疫抗體陽性率差異不顯著（P＞0.05）。

表4 不同免疫分組中小反芻獸疫抗體檢測結(jié)果 單位：%

3 討論與小結(jié)

崇左市地處西南邊陲，是我國最大的甘蔗種植、蔗糖生產(chǎn)基地，素有“中國糖都”之稱。全市年種植甘蔗400多萬畝，產(chǎn)生大量的甘蔗秸稈，為草食動物提供豐富的青貯飼料，非常適合草食動物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近年來，該市牛羊養(yǎng)殖業(yè)得到了迅猛發(fā)展，中小規(guī)模羊場在崇左山區(qū)遍地開花，2017年出欄山羊近10萬只。由于口蹄疫、小反芻獸疫等危害羊群發(fā)展的重大動物疫病在我國時(shí)有發(fā)生并呈一定的流行態(tài)勢[4，5]，國外疫情更為復(fù)雜，疫病防控形式嚴(yán)峻。崇左市有4個縣（市）與越南接壤，邊境線長達(dá)533km，加強(qiáng)邊境動物免疫帶建設(shè)，建立有效免疫屏障，是防止口蹄疫、小反芻獸疫等疫病傳入與流行的主要措施之一。

疫苗的免疫效果受多方因素的影響，其中保存方式、免疫劑量、免疫方法、免疫程序、外界應(yīng)激、自身健康狀態(tài)、養(yǎng)殖管理?xiàng)l件等等，都會影響免疫效果[6]。多種疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫，能降低免疫成本，減少動物應(yīng)激，但若疫苗組合不當(dāng)，可能會導(dǎo)致兩種疫苗之間產(chǎn)生免疫應(yīng)答干擾現(xiàn)象，降低免疫效果，并且動物機(jī)體會因同時(shí)承受多種抗原的刺激導(dǎo)致抵抗力下降而引發(fā)疾病[7]。在該次試驗(yàn)中，所有的試驗(yàn)組山羊沒有出現(xiàn)明顯的免疫副反應(yīng)，采食、增重、健康狀態(tài)等與對照組無明顯差異，說明試驗(yàn)選擇的兩種疫苗都具有較高的安全性。從各試驗(yàn)組來看，不同的免疫方法所檢測的口蹄疫、小反芻獸疫抗體陽性率之間差異不顯著，說明這兩種疫苗可以同時(shí)分點(diǎn)注射，這樣可以降低多次注射疫苗帶來的應(yīng)激反應(yīng)，提高工作效率，降低勞動強(qiáng)度。

該次試驗(yàn)對口蹄疫疫苗采取頸部肌肉注射2mL的方式進(jìn)行免疫，山羊O型、A型口蹄疫免疫抗體陽性率雖然都超過了國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，但是只進(jìn)行一次免疫，其抗體水平都不是很高，免疫持續(xù)時(shí)間也不長，可能是由于口蹄疫疫苗為滅活苗，對動物機(jī)體刺激有局限性，免疫效果有待提高。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)免疫口蹄疫O-A二價(jià)滅活苗，雖然O型、A型抗體消長規(guī)律相近，但A型抗體陽性率比O型抗體陽性率略低，可能與疫苗中兩個亞型毒株的濃度有關(guān)，也可能與動物機(jī)體反應(yīng)有關(guān)。該次試驗(yàn)證明對山羊進(jìn)行口蹄疫二次免疫，可明顯提升抗體陽性率和效價(jià)持續(xù)時(shí)間。這與郝玉清[8]、鄭秀紅[9]、陽廷朗[10]等的研究結(jié)果相符合。

該次試驗(yàn)對小反芻獸疫疫苗采取頸部皮下注射1mL的方式進(jìn)行，4個免疫試驗(yàn)組均在免疫后7d開始產(chǎn)生抗體，14d后抗體陽性率上升到100%，抗體水平達(dá)到峰值，免疫抗體陽性率差異不顯著，表明疫苗具有良好的免疫原性和較長的免疫持續(xù)期。在試驗(yàn)過程中，由于經(jīng)歷較長時(shí)間，部分試驗(yàn)羊被場主賣出，部分羊標(biāo)識不清或丟失，無法連續(xù)跟蹤，導(dǎo)致有些血清樣品采集缺乏連貫性。同時(shí)由于條件限制未對小反芻獸疫免疫羊群進(jìn)行免疫持續(xù)期監(jiān)測，但從抗體水平及陽性率考慮，其持續(xù)期應(yīng)不低于1年[10，11]，每年加強(qiáng)免疫1次即可。

綜上所述，口蹄疫O型、A型二價(jià)疫苗與小反芻獸疫疫苗可以同時(shí)分點(diǎn)注射，所產(chǎn)生的抗體水平較高，兩種疫苗不產(chǎn)生干擾。但口蹄疫疫苗免疫有效期短，建議28d后加強(qiáng)免疫1次。本試驗(yàn)為兩種疫苗的合理使用提供了依據(jù)，可大規(guī)模推廣應(yīng)用。