唐悅恒 趙莉 鄒欣 徐麗君 陸付耳 董慧

摘要 目的：研究交泰丸中主要活性成分小檗堿（BBR）、肉桂酸（CA）及其配伍（BBR/CA）對(duì)軟脂酸（PA）誘導(dǎo)的NIT-1胰島B細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響。方法：將細(xì)胞在PA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，建立高脂誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積模型。分為模型組、BBR組、CA組、BBR/CA組、二甲雙胍（Met）組，分別給予相應(yīng)藥物干預(yù)，另設(shè)對(duì)照組。油紅O染色法評(píng)估細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積情況;酶法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)三酰甘油（TG）含量;使用Western Blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測(cè)細(xì)胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）及其下游脂肪生成和脂肪酸氧化基因的表達(dá)水平，包括脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶（p-ACC）、肉堿酰轉(zhuǎn)移酶-1（CPT-1）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP-1c）。結(jié)果：PA誘導(dǎo)使NIT-1胰島B細(xì)胞中脂肪沉積明顯增加，TG含量顯著升高，AMPK蛋白及其下游靶標(biāo)（如p-ACC、CPT-1等）表達(dá)顯著降低。同時(shí)，AMPK下游脂肪生成基因包括SREBP-1c mRNA、FAS和ACC蛋白表達(dá)顯著增加。BBR單藥和BBR/CA配伍處理優(yōu)于CA單藥，可顯著逆轉(zhuǎn)NIT-1胰島B細(xì)胞中上述基因表達(dá)水平的變化。結(jié)論：在體外，交泰丸活性組分配伍可減少高脂誘導(dǎo)的NIT-1胰島B細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積，其機(jī)制可能與減少脂肪合成和增加脂肪氧化有關(guān)。

關(guān)鍵詞 交泰丸;小檗堿;肉桂酸;NIT-1胰島B細(xì)胞;脂肪

Abstract Objective：To investigate the effects of berberine（BBR） and cinnamic acid（CA），the main active compounds of Jiaotai pills，and the combination of berberine and cinnamic acid（BBR/CA） on palmitic acid（PA）-induced lipid accumulation in NIT-1 pancreatic B cells.Methods：Cells were incubated in culture medium containing PA for 24 hours to establish a model of lipid accumulation induced by high fat.Then treatments with BBR，CA，the combination of BBR and CA（BBR/CA） and Metformin（Met） were performed respectively，and a control group was set up.Intracellular lipid accumulation was assessed by Oil Red O staining and TG content was measured by enzymatic assay.The expression of adenosine monophosphate-activated protein kinase（AMPK） protein and its downstream lipogenic and fatty acid oxidation genes，including fatty acid synthase（FAS），acetyl-CoA carboxylase（ACC），phosphorylation acetyl-CoA carboxylase（p-ACC），carnitine acyl transferase 1（CPT-1） and sterol regulatory element binding protein 1c（SREBP-1c） were determined by Western blot or real time polymerase chain reaction（RT-PCR）.Results：PA induced an obvious lipid accumulation and a significant increase in intracellular TG content in NIT-1 pancreatic B cells.PA also induced a remarkable decrease in AMPK protein expression and its downstream targets such as p-ACC and CPT-1.Meanwhile，AMPK downstream lipogenic genes，including SREBP-1c mRNA，F(xiàn)AS and ACC protein expressions，were increased significantly.Treatments with BBR and BBR/CA，superior to CA，significantly reversed the above genes changes in NIT-1 pancreatic B cells.Conclusion：It can be concluded that in vitro，the active compounds of Jiaotai pills inhibits PA-induced lipid accumulation by decreasing lipogenesis and increasing lipid oxidation in NIT-1 pancreatic B cells.

Keywords Jiaotai pills; Berberine; Cinnamic Acid; NIT-1 pancreatic B cells; Lipid

中圖分類號(hào)：R587.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.002

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）是一種由胰島素分泌缺陷和（或）胰島素功能缺陷引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病[1]。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation，IDF）報(bào)告，2019年全球約有4.63億成年人患有DM，預(yù)計(jì)到2045年這一數(shù)字將達(dá)到7億[2]。而中國(guó)是世界上DM患者數(shù)量最多的國(guó)家，發(fā)病率高達(dá)11.2%[3]。DM嚴(yán)重威脅人類健康，其并發(fā)癥同樣給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)，相關(guān)醫(yī)療支出巨大，防控形勢(shì)嚴(yán)峻，因此，必須加強(qiáng)對(duì)其進(jìn)行綜合管理和治療。

高脂血癥是一組以血液中脂質(zhì)過(guò)多為特征的代謝性疾病，隨著肥胖癥的全球流行，其患病率也在不斷增加[4]。游離脂肪酸（Free Fatty Acid，F(xiàn)FA）在生理狀況下可以轉(zhuǎn)化成三酰甘油（Triglyceride，TG）和膽固醇酯，以脂滴的形式儲(chǔ)存于脂肪細(xì)胞中[5]。已有大量研究結(jié)果證實(shí)，增加的FFA水平的升高會(huì)誘導(dǎo)胰島素抵抗和胰腺B細(xì)胞功能障礙，并最終導(dǎo)致2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）的發(fā)生發(fā)展[6-8]。先前的研究結(jié)果還證實(shí)，可以通過(guò)減少胰島中的脂肪生成和增加脂質(zhì)氧化來(lái)減少脂質(zhì)沉積，從而達(dá)到減少胰島B細(xì)胞凋亡的目的[9]。因此，減少胰島B細(xì)胞中的脂肪沉積可能成為治療T2DM的新的研究方向。

交泰丸，起源于明代韓懋的《韓氏醫(yī)通》一書，由黃連和肉桂兩味藥組成。方中黃連大苦大寒，清降心火以下交腎水;肉桂辛甘大熱，溫腎陽(yáng)蒸腎水上濟(jì)于心，兩藥配伍，一寒一熱，一陰一陽(yáng)，相反相成，可使腎水與心火升降協(xié)調(diào)，彼此交通，是主治心腎不交之不寐證的經(jīng)典方劑。本課題組經(jīng)過(guò)多年臨床實(shí)踐已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其顯著的降糖效果。進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，交泰丸可減輕DM大鼠的高血糖、高脂血癥，減少胰島脂肪沉積[10-11]，其可能作用機(jī)制包括：1）減少肝臟、骨骼肌、心肌的脂肪沉積，改善胰島素磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙[12];2）減少胰腺脂肪沉積，胰島細(xì)胞凋亡[13]。然而，關(guān)于交泰丸減少脂肪沉積的體外藥理學(xué)研究尚未有報(bào)道。

體外的藥理研究有條件易控、敏感性和特異性強(qiáng)、快捷迅速等諸多優(yōu)點(diǎn)[14]。因此，在對(duì)藥物進(jìn)行各方面深入評(píng)價(jià)時(shí)，需要進(jìn)行體外藥理實(shí)驗(yàn)。為了提高配伍組方的科技含量，有人提出了有效組分配伍的新模式。小檗堿（Berberine，BBR），是一種從黃連中分離得到的生物堿，已被證實(shí)可以起到保護(hù)胰島B細(xì)胞的作用，包括調(diào)節(jié)胰島素分泌和抑制脂肪細(xì)胞凋亡，從而改善胰島素抵抗，調(diào)節(jié)血糖血脂[15-17]。然而BBR對(duì)胰島B細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響尚不明確。肉桂酸（Cinnamic Acid，CA），是肉桂代謝后的主要成分，其胰島素釋放特性已通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)[18]，但尚未有關(guān)于CA對(duì)胰島B細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響的研究。此外，BBR和CA對(duì)胰島B細(xì)胞脂質(zhì)沉積的協(xié)同作用亦未被研究。本研究旨在比較BBR、CA及其配伍對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)的NIT-1胰島B細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 小鼠NIT-1胰島B細(xì)胞株（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貨號(hào)：CL-0562）。

1.1.2 藥物 鹽酸小檗堿（Berberine，BBR，黃連素，純度>98%）（四川蘄州市市郊植物提制，批號(hào)：110406），二甲雙胍（深圳市中聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)：1103078）。

1.1.3 試劑與儀器 肉桂酸（Cinnamic Acid，CA，Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：MK887111），軟脂酸（Palmitic Acid，PA，Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：087K1877）和牛血清清蛋白（BSA，Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：041M18021V），南非胎牛血清（FBS）（Thermo公司，美國(guó)，貨號(hào)：10091155）、DMEM高糖培養(yǎng)基（Thermo公司，美國(guó)，貨號(hào)：11965092）、RMPI 1640培養(yǎng)基（Thermo公司，美國(guó)，貨號(hào)：11875101），胰蛋白酶（武漢谷歌生物科技有限公司，貨號(hào)：G4001），青鏈霉素（武漢谷歌生物科技有限公司，貨號(hào)：G4003），MTT試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司，貨號(hào)：G4101），三酰甘油檢測(cè)試劑盒（長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：K068a），BCA法蛋白測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：P0012），肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-1（CPT-1）抗體（Abcam公司，英國(guó)，貨號(hào)：ab234111），腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗體（Abcam公司，英國(guó)，貨號(hào)：ab32047），乙酰輔酶A羧化酶抗體（ACC，Abcam公司，英國(guó)，貨號(hào)：ab45174），磷酸化乙酰輔酶A羧化酶（p-ACC）抗體（Abcam公司，英國(guó)，貨號(hào)：ab68191），脂肪酸合成酶（FAS）抗體（GeneTex公司，美國(guó)，貨號(hào)：GT1169），TRIzol試劑（TaKaRa公司，日本，貨號(hào)：740955.50），PrimeScript RT試劑盒（TaKaRa公司，日本，貨號(hào)：RR014B），SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa公司，日本，貨號(hào)：639676）。CO2培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：BPN-80CRH），電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：DKB-600B），恒溫水平搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：Orbital Shaker TS-1），生化分析儀（Roche公司，瑞士，型號(hào)：iMagic-M7），Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（Odyssey公司，美國(guó)，型號(hào)：LI-COR Odyssey），光學(xué)顯微鏡（Nikon公司，日本，型號(hào)：E100），核酸/蛋白分析儀（Thermo公司，美國(guó)，型號(hào)：NanoDrop ONEC），Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System（Applied Biosystems公司，美國(guó)，型號(hào)：4376599）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

取90 mL 1640培養(yǎng)基、10 mL FBS和1 mL青鏈霉素，充分混勻得到1640完全培養(yǎng)基。將一定量的小鼠NIT-1胰島B細(xì)胞接種于25 mL的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，用配制好的完全培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代或凍存。

棄掉NIT-1胰島B細(xì)胞中原有的培養(yǎng)基，加入含0.5% BSA，0.25 mmol/L PA培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，建立高脂誘導(dǎo)的NIT-1胰島B細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積模型后將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、小檗堿組、肉桂酸組、交泰丸組分配伍組（BBR/CA）和二甲雙胍組。

1.2.2 干預(yù)方法

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NIT-1胰島B細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種到96孔板中，待細(xì)胞融合按不同濃度梯度加入藥物：1）PA：0.10、0.25、0.40、0.50 μmol/L;2）BBR：5、10、15、20、30、50、100 μmol/L;3）CA：50、100、200、300、500 μmol/L;4）Met：10、15、20、25、30、35、40 μmol/L。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，正常組和空白對(duì)照組分別加入等量未加藥的細(xì)胞懸液和PBS，孵育24 h。向每孔加入MTT工作液50 μL，孵育4 h后棄掉液體，加入100 μL的DMSO，搖床振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)各孔的吸光度。選擇合適的藥物干預(yù)濃度干預(yù)對(duì)應(yīng)組別細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 細(xì)胞內(nèi)TG測(cè)定

將細(xì)胞按1×105個(gè)/mL種入6孔板，按對(duì)照組、模型組、小檗堿組、肉桂酸組、交泰丸組分配伍組（BBR/CA）和二甲雙胍組的分組進(jìn)行造模加藥。孵育24 h后裂解各組細(xì)胞，以酶法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG含量。

1.2.3.2 油紅O染色

如前所述對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組造模加藥。孵育24 h后用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2遍，固定于10%甲醛中，加入油紅染液染色1 h，使用光學(xué)顯微鏡觀察并拍攝脂滴。

1.2.3.3 Western Blotting法檢測(cè)

棄去含藥培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次后將細(xì)胞裂解提取蛋白，使用BCA法蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，用Buffer給蛋白統(tǒng)一濃度。

配制10% SDS-PAGE凝膠，按40 μg的蛋白含量完成上樣，電泳完成后使用NC膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后使用含5%脫脂奶粉或5% BSA的封閉液封閉1 h。在4 ℃下與一抗（AMPK、ACC、p-ACC、FAS、CPT-1）孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次后，將膜與熒光標(biāo)記的二抗在室溫下避光孵育1 h。最后將膜在TBST中洗滌3次后使用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，用ImageJ軟件分析條帶灰度，以目的基因條帶與內(nèi)參基因β-actin的比值來(lái)表示蛋白的表達(dá)水平。

1.2.3.4 RT-PCR檢測(cè)

采用TRIzol和氯仿提取細(xì)胞總RNA，使用核酸/蛋白分析儀檢測(cè)所提取RNA的濃度和純度。根據(jù)PrimeScript RT試劑盒說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq試劑盒的說(shuō)明依次加入cDNA、引物混合液和熒光試劑后設(shè)置RT-PCR程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s，PCR 95 ℃、5 s，60 ℃、30 s。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，擴(kuò)增結(jié)束后以2-△△Ct法計(jì)算mRNA的表達(dá)水平。

引物序列如下：β-actin：前引物：5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′;后引物：5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′;SREBP-1c：前引物：5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′;后引物：5′-GAAGTCACTGTCTTGGTTGTTGATG-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，如果方差齊性用LSD-t檢驗(yàn)，如果方差不齊性用Dunnett′s T3檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad軟件完成制圖。

2 結(jié)果

2.1 各組藥物及軟脂酸對(duì)NIT-1胰島B細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響

如前所述，用不同濃度PA、BBR、CA和Met干預(yù)NIT-1胰島B細(xì)胞，孵育24 h后比較相鄰2濃度細(xì)胞存活率間差值的差異（△D），將差異最大的濃度作為藥物干預(yù)的合適濃度，最終選擇0.25 mmol/L的PA、10 μmol/L的BBR、100 μmol/L的CA和35 μmol/L的Met供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

2.2 BBR、CA及其配伍對(duì)NIT-1胰島B細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響

與對(duì)照組比較，PA誘導(dǎo)的模型組NIT-1胰島B細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，小檗堿組、交泰丸組分配伍組和二甲雙胍組細(xì)胞內(nèi)TG含量均顯著降低，而肉桂酸組細(xì)胞內(nèi)TG含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;單獨(dú)給予BBR處理后細(xì)胞內(nèi)TG含量與交泰丸組分配伍組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而肉桂酸組細(xì)胞內(nèi)TG含量與交泰丸組分配伍組比較顯著升高（P<0.05）。見圖1A。

油紅O染色的結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯增多;與模型組比較，小檗堿組和交泰丸組分配伍組細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)量均顯著減少，Met處理后脂滴數(shù)量同樣減少，而單獨(dú)給予CA處理后細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量雖有所減少，但效果不如其他組明顯。見圖1B。

2.3 BBR、CA及其配伍對(duì)NIT-1胰島B細(xì)胞AMPK及其下游脂肪生成基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，PA作用24 h后NIT-1胰島B細(xì)胞內(nèi)FAS和ACC蛋白表達(dá)顯著增加而AMPK和p-ACC蛋白表達(dá)水平明顯下降（P<0.01）。與模型組比較，小檗堿組、肉桂酸組、交泰丸組分配伍組和二甲雙胍組細(xì)胞內(nèi)FAS和ACC蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01），AMPK和p-ACC蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。與交泰丸組分配伍組比較，小檗堿組細(xì)胞AMPK蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05），而小檗堿組和肉桂酸組細(xì)胞FAS蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。見圖2。

2.4 BBR、CA及其配伍對(duì)NIT-1胰島B細(xì)胞AMPK下游脂肪酸氧化基因表達(dá)的影響

經(jīng)PA誘導(dǎo)后，NIT-1胰島B細(xì)胞中CPT-1蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，小檗堿組、肉桂酸組、交泰丸組分配伍組和二甲雙胍組細(xì)胞CPT-1蛋白表達(dá)均顯著增加（P<0.01）。與交泰丸組分配伍組比較，單獨(dú)給予BBR處理后細(xì)胞CPT-1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），單獨(dú)給予CA處理后細(xì)胞內(nèi)CPT-1蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），這或許證明CA可以增強(qiáng)NIT-1胰島B細(xì)胞中的脂肪酸氧化。見圖3。

2.5 各組NIT-1胰島B細(xì)胞SREBP-1c mRNA表達(dá)的比較

與對(duì)照組比較，PA作用24 h后NIT-1胰島B細(xì)胞SREBP-1c mRNA表達(dá)顯著增加（P<0.01）。給予BBR、CA或BBR聯(lián)合CA處理后NIT-1胰島B細(xì)胞SREBP-1c mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01），而Met處理后細(xì)胞內(nèi)SREBP-1c mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與BBR/CA組比較，肉桂酸組細(xì)胞SREBP-1c mRNA表達(dá)顯著增加（P<0.01），小檗堿組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

DM的發(fā)病率正在逐年上升，對(duì)人類健康的影響巨大，其帶來(lái)的醫(yī)療保健費(fèi)用也日益增長(zhǎng)，給患者本身及其家庭以及社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。DM在中醫(yī)學(xué)中屬于消渴病范疇，正如《素問(wèn)病機(jī)氣宜保命集·卷下·消渴論》所記載的“上熱故煩渴多飲，下寒故小便多出。本因下部腎水虛，而不能制其上焦心火，故上實(shí)熱而下虛冷”，腎陽(yáng)虛于下，心火亢于上，是消渴的重要病機(jī)[20]。由黃連和肉桂兩味藥所組成的交泰丸，一直以來(lái)是治療心煩不寐、心悸不安、頭暈耳鳴、腰酸遺精、五心煩熱等心腎不交癥狀的經(jīng)典方劑，其溫腎清心、交通心腎的功效正切中消渴腎陽(yáng)虛心火亢的基本病機(jī)。本課題組將交泰丸臨床應(yīng)用于T2DM患者的治療發(fā)現(xiàn)，給予交泰丸治療后，患者的睡眠質(zhì)量得到明顯改善，血糖也有不同程度的下降，血脂紊亂得到糾正。而許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣表明，交泰丸及其單味藥黃連、肉桂可有效治療T2DM大鼠[10-11，21]，其降糖調(diào)脂的作用機(jī)制可能與降低肝臟、胰腺、骨骼肌和心肌TG含量，減少胰島細(xì)胞凋亡有關(guān)[22-23]。

異位脂質(zhì)堆積是指非脂肪組織中出現(xiàn)脂肪沉積，肝臟中的異位脂質(zhì)堆積與肥胖、胰島素抵抗和T2DM密切相關(guān)[24]。骨骼肌中過(guò)量的脂質(zhì)堆積同樣被認(rèn)為與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[24-25]。高脂飲食會(huì)引起循環(huán)中FFA水平升高，而長(zhǎng)時(shí)間的FFA水平升高會(huì)引起B(yǎng)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，最終導(dǎo)致B細(xì)胞損傷及功能下降。FFA能酯化為TG儲(chǔ)存于體內(nèi)各器官中：一方面，TG分解代謝時(shí)產(chǎn)生大量的脂酰輔酶A（CoA），其中一部分進(jìn)行β氧化產(chǎn)能，更多的脂酰CoA進(jìn)入非氧化的代謝途徑，代謝產(chǎn)物可對(duì)B細(xì)胞產(chǎn)生脂毒性，誘導(dǎo)B細(xì)胞凋亡;另一方面，軟脂酸CoA可與絲氨酸在絲氨酸神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)移酶的催化下，合成神經(jīng)酰胺，后者激活核因子κB（NF-κB），進(jìn)而使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNO）表達(dá)增加，NO合成增多，NO源性氧自由基過(guò)多，造成B細(xì)胞DNA的損傷，B細(xì)胞凋亡[26-27]。因此，可以通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積來(lái)減輕B細(xì)胞損傷，從而達(dá)到改善脂毒性和預(yù)防T2DM發(fā)展的目的。由于交泰丸可能具有減少胰島細(xì)胞凋亡的作用，但中藥成分復(fù)雜，因此我們選擇黃連、肉桂各自的有效活性成分小檗堿和肉桂酸為研究對(duì)象，通過(guò)體外藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索交泰丸活性成分對(duì)NIT-1胰島B細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積的影響。

本研究中，我們采用軟脂酸作用24 h誘導(dǎo)NIT-1胰島B細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積。結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)TG含量升高，油紅O染色也觀察到細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多，提示模型建立成功。給予BBR以及BBR/CA干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)TG含量下降，脂滴明顯減少，而CA干預(yù)使細(xì)胞內(nèi)脂滴有一定程度的減少，細(xì)胞內(nèi)TG含量下降，但與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以上結(jié)果提示BBR減少細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積作用優(yōu)于CA。此外，交泰丸組分配伍組，即BBR/CA組降低細(xì)胞內(nèi)TG含量作用并不優(yōu)于BBR單藥，這可能與二者配伍后有效濃度下降有關(guān)。全世建等[28]采用高效液相色譜法測(cè)定黃連和肉桂不同比例配伍后的5種有效成分小檗堿、藥根堿、巴馬亭、桂皮醛和肉桂酸的質(zhì)量百分含量變化趨勢(shì)，結(jié)果表明，黃連含量固定時(shí)，隨著肉桂配伍含量增加，黃連中的生物堿含量比例下降;而隨著肉桂含量增加，桂皮醛和肉桂酸含量未呈比例上升。本課題組前期研究同樣證實(shí)，肉桂比例升高會(huì)降低黃連中小檗堿的溶出量;黃連比例越高，肉桂中肉桂醛、肉桂酸含量越低，這可能是由于黃連和肉桂配伍后，在煎煮過(guò)程中黃連中的生物堿與肉桂中的酚酸類成分產(chǎn)生沉淀所導(dǎo)致的[29-30]。

AMPK是脂肪組織中一個(gè)主要的能量感應(yīng)器和調(diào)節(jié)器。AMPK的抑制與肥胖和DM等脂肪沉積障礙的發(fā)展有關(guān)，相反，AMPK的激活可以抑制脂肪生成并刺激脂肪酸氧化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量減少[31-32]。脂肪的累積取決于脂肪合成加再酯化和脂肪分解兩方面，F(xiàn)AS和ACC是調(diào)控該過(guò)程的2個(gè)關(guān)鍵酶。An等[33]的研究顯示，AMPK在脂肪酸代謝過(guò)程中有著重要作用，在一定程度上可以調(diào)控ACC的活性。此外，長(zhǎng)鏈脂肪酸（Long Chain Fatty Acid，LCFA）氧化的調(diào)控在代謝性疾病的研究中引起了越來(lái)越多的關(guān)注，通過(guò)CPT-1在線粒體外膜運(yùn)輸是LCFA氧化的限速步驟，研究結(jié)果證實(shí)CPT-1是LCFA的氧化過(guò)程中必不可少的部分[34]。此外，肝脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)是由一些核受體和轉(zhuǎn)錄因子密切調(diào)控的。SREBP-1c是刺激一些與脂肪合成相關(guān)的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它可以連接脂肪合成基因包括固醇調(diào)節(jié)元件的啟動(dòng)區(qū)，如ACC和FAS，并且能夠上調(diào)這些基因的表達(dá)[35-36]。Zhu等[37]的研究結(jié)果證實(shí)，SREBP-1c基因的表達(dá)水平與肝細(xì)胞內(nèi)TG含量存在密切聯(lián)系。

黃連及其有效成分BBR對(duì)DM的治療效果已被證實(shí)有效，且BBR在治療有血脂異常的T2DM患者時(shí)能兼顧有效性和安全性[38]。Shen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，BBR可以減少胰島B細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積，其可能機(jī)制是激活NIT-1細(xì)胞AMPK，同時(shí)引起其下游分子ACC磷酸化和FAS表達(dá)下降。本研究結(jié)果同樣表明，BBR能激活NIT-1細(xì)胞AMPK蛋白的表達(dá)，降低脂肪生成基因ACC、FAS和SREBP-1c的表達(dá)，上調(diào)ACC的磷酸化水平，提示BBR可抑制細(xì)胞內(nèi)脂肪合成。這一發(fā)現(xiàn)與Brusq等[39]的研究結(jié)果一致，后者表明BBR通過(guò)AMPK激活抑制HepG2細(xì)胞中的脂質(zhì)合成。此外，BBR干預(yù)后，AMPK下游脂肪酸氧化基因CPT-1表達(dá)上調(diào)，提示BBR可增加細(xì)胞內(nèi)脂肪氧化。這可能是BBR減少NIT-1胰島B細(xì)胞內(nèi)TG含量的原因之一。雖然本研究中沒有檢測(cè)p-AMPK蛋白的表達(dá)水平，但AMPK下游脂肪生成基因表達(dá)的減少和脂肪酸氧化基因的增強(qiáng)在一定程度上同樣可以反映B細(xì)胞中的AMPK活化。

CA是肉桂在機(jī)體代謝后的主要效應(yīng)成分。Qin等[40]發(fā)現(xiàn)肉桂提取物對(duì)SREBP-1c mRNA表達(dá)的抑制效果可能涉及小腸上皮細(xì)胞的胰島素通路。本研究發(fā)現(xiàn)，CA與BBR一樣能激活NIT-1胰島B細(xì)胞AMPK的蛋白表達(dá)，降低脂肪生成基因ACC、FAS和SREBP-1c的表達(dá)，上調(diào)ACC的磷酸化水平，提示CA可抑制細(xì)胞內(nèi)脂肪合成;CA干預(yù)可上調(diào)NIT-1胰島B細(xì)胞CPT-1蛋白表達(dá)，提示CA可增加細(xì)胞內(nèi)脂肪氧化。然而，CA減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的作用明顯弱于BBR，且在增加AMPK蛋白表達(dá)和降低FAS蛋白表達(dá)方面，BBR單藥似乎比交泰丸組方配伍更有效。似乎CA單藥不能極大地抑制NIT-1胰島B細(xì)胞中的脂肪生成過(guò)程。這些發(fā)現(xiàn)可能是給予CA干預(yù)后NIT-1胰島B細(xì)胞內(nèi)TG含量的降低與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因之一。此外，本研究并未觀察到BBR和CA對(duì)PA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積和細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用;相反，BBR的作用很可能會(huì)因培養(yǎng)基中CA的存在而減弱，這需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們的體外研究表明，在低濃度軟脂酸存在下，交泰丸活性組分配伍和小檗堿單藥可有效抑制NIT-1胰島B細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積，其機(jī)制與增加AMPK的活性、減少脂肪合成以及增加脂肪酸氧化有關(guān)，這種抑制作用可以保護(hù)B細(xì)胞免受軟脂酸誘導(dǎo)的脂毒性的損傷。而交泰丸活性組分配伍組并不明顯優(yōu)于小檗堿、肉桂酸單藥組，其可能原因尚需進(jìn)一步探討。

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（2021-08-10收稿 責(zé)任編輯：王明）