張雨恬，伍振峰，黃 藝，章 俊，張 詢，林瑞華，萬 娜*，楊 明*

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)的鮮竹瀝治療“咳、喘、痰”機(jī)制及其質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測分析

張雨恬1, 2，伍振峰1，黃 藝3，章 俊4，張 詢1，林瑞華1，萬 娜3*，楊 明1*

1. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004 2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330004 3. 江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004 4. 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，對鮮竹瀝發(fā)揮“咳、喘、痰”作用的機(jī)制及潛在的質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）預(yù)測分析。采用干餾法和火烤法制備鮮竹瀝，對鮮竹瀝的指紋圖譜進(jìn)行研究，篩選并預(yù)測其中14個(gè)成分的潛在作用靶點(diǎn)及通路，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫分析確定“咳、喘、痰”病癥的靶基因；取藥物與疾病交集基因，將交集基因上傳String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，利用Rstudio的clusterProfiler功能對交集基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；預(yù)測鮮竹瀝的Q-Marker，并運(yùn)用分子對接軟件對部分關(guān)鍵靶點(diǎn)及其對應(yīng)成分進(jìn)行分子對接，驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果。采用指紋圖譜研究得到8批干餾法、火烤法的鮮竹瀝主要活性成分，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接分析鮮竹瀝對“咳、喘、痰”病癥的治療作用，推測鮮竹瀝的Q-Marker為香草酸、對乙基苯酚、丁香醛、二氫丁香酚、對乙烯基愈創(chuàng)木酚，主要通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號(hào)通路等重要生物通路來發(fā)揮止咳、平喘、化痰的作用。通過預(yù)測鮮竹瀝的Q-Marker，為提升其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為鮮竹瀝功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)的研究及作用機(jī)制的闡釋提供參考，為其二次開發(fā)以及擴(kuò)大臨床使用范圍提供參考依據(jù)。

鮮竹瀝；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；質(zhì)量標(biāo)志物；分子對接；止咳；化痰；平喘；香草酸；對乙基苯酚；丁香醛；二氫丁香酚；對乙烯基愈創(chuàng)木酚

竹子為禾本科多年生常綠喬木狀植物，其分布廣、品種多，在世界范圍內(nèi)約87個(gè)屬、1500多個(gè)種。鮮竹瀝為禾本科植物粉綠竹McClure、凈竹McClure及同屬數(shù)種植物的鮮桿經(jīng)加熱后自然瀝出的液體，性味甘、苦、寒，入心、胃經(jīng)，具有清熱化痰、鎮(zhèn)驚利竅之功效，鮮竹瀝在古代被中醫(yī)譽(yù)為“痰家圣劑”，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“竹葉，味苦平，主咳逆上氣溢筋急，惡瘍，小蟲；竹根，益氣止渴，補(bǔ)虛下氣；竹汁，主風(fēng)庢實(shí)，通神明，輕身益氣”[1]。臨床多用于治療肺熱咳嗽痰多、氣喘胸悶、中風(fēng)舌強(qiáng)、痰涎壅盛、小兒痰熱驚風(fēng)等癥[2]。鮮竹瀝是中藥品種鮮竹瀝口服液、復(fù)方鮮竹瀝液的主要原料藥，也是竹類植物在臨床上常用的藥用制劑。鮮竹瀝的古法炮制工藝有燒制法和干餾法，分別載于唐朝《急備千金藥方》[3]：“取淡竹斷兩頭節(jié)，火燒中央，器盛兩頭得汁”；明朝《本草綱目》[4]：“以竹截長五六寸，以瓶盛，倒懸，下用一器承之，周圍以炭火逼之，其油瀝于器也”。

鮮竹瀝化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有揮發(fā)性成分、氨基酸、黃酮類成分、維生素及微量元素等。據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局統(tǒng)計(jì)，處方中含鮮竹瀝的中成藥有16種（包括去痰靈口服液、瀝水調(diào)脂膠囊等），含鮮竹瀝的中藥方劑有81條（包括阿膠飲子、八仙膏、白術(shù)和中湯等）。同時(shí)，鮮竹瀝也被開發(fā)成具有一定食用價(jià)值的飲料（包括鮮竹瀝飲料、蛇膽枇杷瀝、無花果飲料等）。但目前鮮竹瀝現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)水平較低，導(dǎo)致市售產(chǎn)品存在炮制方法混亂、物質(zhì)成分不清晰等問題，嚴(yán)重影響了鮮竹瀝臨床用藥的安全性和有效性。

中藥的臨床療效取決于其所含化學(xué)成分（群）的特征，采用多種分析技術(shù)手段構(gòu)建整體質(zhì)量評(píng)價(jià)體系成為近年來中藥標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)展方向。中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）是劉昌孝院士[5]近年來提出的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與質(zhì)量控制的核心概念，其基于有效、特有、傳遞與溯源、可測和處方配伍的“五原則”[6]，目前已用于藥材、飲片、復(fù)方Q-Marker的研究。Q-Marker概念的提出，為中藥的質(zhì)量控制研究指明了方向，為后續(xù)研究中藥發(fā)揮作用的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)基礎(chǔ)上的研究方法，能夠推動(dòng)對藥物作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，加速藥物靶點(diǎn)篩選以及生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)[7-8]，清華大學(xué)李梢教授于1999年首次以“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”為特點(diǎn)進(jìn)行了一系列開拓性探索[9]；2002年提出中藥方劑發(fā)揮“多因微效”的整體療效調(diào)節(jié)作用機(jī)制[10]；2007年利用生物信息學(xué)方法首次構(gòu)建出中醫(yī)寒熱證生物分子網(wǎng)絡(luò)及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)效應(yīng)及框架[11-13]，2013年提出中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理論、方法論與應(yīng)用，并使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)行中藥復(fù)方作用機(jī)制解析的研究工作[14]，隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的影響力和應(yīng)用日益廣泛，研究者通過運(yùn)用各大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)信息的搜集、預(yù)測與篩選，構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行靶標(biāo)基因富集分析，從分子機(jī)制方面揭示成分在疾病預(yù)防或治療方面發(fā)揮效用的途徑，闡明中藥“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的治療特點(diǎn)[15]，是解析藥物及治療對象之間的分子關(guān)聯(lián)規(guī)律，符合中醫(yī)藥特色的科學(xué)研究方法。

鮮竹瀝作為臨床上常用止咳、平喘、祛痰的中藥，其功效已明確，但該中藥發(fā)揮治療作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制卻不甚清晰，因此本研究從Q-Marker的“五原則”出發(fā)，通過對鮮竹瀝的目標(biāo)化學(xué)成分的潛在病癥靶點(diǎn)進(jìn)行映射，結(jié)合傳統(tǒng)功效進(jìn)行分組，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從化學(xué)和生物信息角度預(yù)測分析鮮竹瀝功效的潛在Q-Marker及分子機(jī)制，為鮮竹瀝的質(zhì)量控制及后續(xù)研究開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890A/5975C型氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀（GC-MS，美國Agilent公司）；MS-105DU型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500B型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；H1650-W型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；TD5001C型電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

竹子采自江西南昌灣里區(qū)，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)曹嵐副教授鑒定為2～3年生禾本科剛竹屬毛竹(Carr.) Mitford cv.的莖稈。對照品愈創(chuàng)木酚（質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%，批號(hào)100491-201902）、苯甲酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%，批號(hào)100419-201703）購自中國食品藥品檢定研究院；4-乙基愈創(chuàng)木酚對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，批號(hào)Y03M8C30736）購自上海源葉生物科技有限公司；對照品醋酸（批號(hào)CHB201106）、糠醛（批號(hào)CHB210222）、糠醇（批號(hào)CHB210223）、4-甲基愈創(chuàng)木酚（批號(hào)CHB210223）、對乙基苯酚（批號(hào)CHB210123）、對乙烯基愈創(chuàng)木酚（批號(hào)CHB210111）、紫丁香醇（批號(hào)CHB201107）、二氫丁香酚（批號(hào)CHB210308）、香蘭素（批號(hào)CHB210107）、香草酸（批號(hào)CHB210305）、丁香醛（批號(hào)CHB201130）購自成都克洛瑪生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；乙腈、甲醇（色譜純）購自德國Merck公司；純凈水購自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；其他試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 GC-MS方法

2.1.1 色譜條件 123-1334 Aglient DB-624毛細(xì)管色譜柱（30 m×320 μm×1.8 μm）；載氣為氦氣，柱體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為280 ℃；分流比5∶1；程序升溫：起始溫度30 ℃，保持5 min；以3 ℃升溫至40 ℃，保持4 min；以5 ℃/min升溫至60 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升溫至80 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升溫至110 ℃，保持3 min；以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升溫至144 ℃，保持0 min；以3 ℃/min升溫至180 ℃，保持0 min；以8 ℃/min升溫至280 ℃，保持1 min；以5 ℃/min升溫至300 ℃，保持0 min；進(jìn)樣量為1.0 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 四極桿溫度150 ℃；電離源為標(biāo)準(zhǔn)電子轟擊源（EI），離子源溫度230 ℃；電子倍增管電壓2 447.06V；掃描范圍/50～650。

2.2 樣品制備

2.2.1 干餾法 選取2～3年生毛竹，鋸成約40 cm段，去節(jié)，將其置于干餾裝置內(nèi)，固定溫度，從竹瀝滴出開始計(jì)時(shí)，收集鮮竹瀝液，于4 ℃保存。

2.2.2 火烤法 選取2～3年生毛竹，鋸成約40 cm段，去節(jié)，用酒精噴燈加熱中部，收集兩端流出的竹瀝，烤至竹變黑且無汁液流出，收集鮮竹瀝液，于4 ℃保存。

按以上方法各制備8批（S1～S8）鮮竹瀝樣品。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品5 mL，用萃取劑二氯甲烷（色譜級(jí)）以1∶1萃取2次，靜置20 min，分層后取下層，合并萃取液，過0.45 μm微孔濾膜，于4 ℃保存，即得。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取對照品愈創(chuàng)木酚、苯甲酸、4-乙基愈創(chuàng)木酚、醋酸、糠醛、糠醇、4-甲基愈創(chuàng)木酚、對乙基苯酚、對乙烯基愈創(chuàng)木酚、紫丁香醇、二氫丁香酚、香蘭素、香草酸、丁香醛適量，以甲醇溶解，得到適宜質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

2.5 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

各取8批干餾法、火烤法制得的鮮竹瀝，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測，記錄鮮竹瀝色譜圖，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年版）軟件，以S8的指紋圖譜作為參照圖譜，采用平均數(shù)法，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，自動(dòng)匹配生成指紋圖譜共有模式。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果，并對鮮竹瀝的不同制備工藝的共有成分進(jìn)行篩選。

2.6 鮮竹瀝成分篩選方法

通過比對指紋圖譜鮮竹瀝2種工藝下的物質(zhì)成分，發(fā)現(xiàn)共有峰，并結(jié)合TCMSP中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）中收錄的化學(xué)成分，按以下方式進(jìn)行篩選：（1）該中藥成分在部頒或局頒標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的Q-Marker；（2）通過文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫可以搜索得到的已有明確藥理活性的化合物；（3）含量相對較高的化合物。

2.7 候選化合物靶點(diǎn)預(yù)測

通過化合物CAS號(hào)在PubChem數(shù)據(jù)庫尋找化合物的SMILES號(hào)，將化合物SMILES上傳至SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction. ch/）網(wǎng)站進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，以“Probability”≥0.05作為標(biāo)準(zhǔn)篩選藥物成分靶點(diǎn)。

2.8 “咳、喘、痰”疾病靶點(diǎn)獲取

通過CNKI數(shù)據(jù)庫與Web of Science數(shù)據(jù)庫查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)“痰”與“氣道黏液高分泌”存在著極為緊密的聯(lián)系[16]，因此選擇“phlegm”“hypersecretion of airway mucus”作為痰的檢測，同時(shí)將咳嗽病癥關(guān)鍵詞“cough”、哮喘病癥關(guān)鍵詞“asthma”為檢索條件輸入，分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www. genecards.org/）數(shù)據(jù)庫搜尋相關(guān)靶點(diǎn)，以“Relevance score”大于中位數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)篩選疾病靶點(diǎn)，獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

2.9 藥物-疾病靶點(diǎn)預(yù)測

搜集得到中藥目標(biāo)化合物靶點(diǎn)集合與病癥靶點(diǎn)集合后，將成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)相互映射上傳至Draw Veen數(shù)據(jù)庫取交集，從而獲得交集基因。使用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“藥物-疾病”網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)化合物與靶點(diǎn)的連接情況篩選出鮮竹瀝作用于“咳、喘、痰”病的關(guān)鍵化合物，并分析成分網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)[17]。

2.10 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析

為進(jìn)一步研究鮮竹瀝治療咳喘痰的蛋白之間的相互作用，將獲得的藥物-疾病交集基因?qū)朐诰€STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input. pl）進(jìn)行PPI數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建，物種選擇為人（homo sapiens），隱藏游離節(jié)點(diǎn)，將網(wǎng)絡(luò)參數(shù)以“tsv”格式輸出，將“tsv”文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0，并對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。用節(jié)點(diǎn)大小和顏色反應(yīng)反映度值的大小，節(jié)點(diǎn)越大則表明度值越大；邊的粗細(xì)用于反映結(jié)合分?jǐn)?shù)的大小，邊越粗則結(jié)合分?jǐn)?shù)越大，得到核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

2.11 功能富集分析與通路富集分析

利用David 6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf. gov/）對交集基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析，探討藥物作用的生物學(xué)過程，描述基因靶點(diǎn)的功能，包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組成（cellular component，CC）；對交集基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，探討藥物作用的生物通路，得到潛在靶點(diǎn)所富集的信號(hào)通路。GO功能和KEGG通路分析均以＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.12 分子對接實(shí)驗(yàn)

一般而言，在1個(gè)網(wǎng)絡(luò)中度值越高，它的地位也就越重要，即PPI網(wǎng)絡(luò)中度值越大的蛋白在鮮竹瀝治療“咳、喘、痰”病癥中有重要影響作用。利用AutoDock Vina 1.1.2對鮮竹瀝活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，驗(yàn)證其相互作用活性。具體方法如下：

（1）小分子處理：根據(jù)CAS號(hào)從PubChem數(shù)據(jù)庫下載3D結(jié)構(gòu)的“SDF”格式小分子，然后導(dǎo)入Chembio3D進(jìn)行能量最小化導(dǎo)出為mol2格式，導(dǎo)入AutodockTools（v1.5.6）加氫、計(jì)算電荷、分配電荷、設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵后保存為“pdbqt”格式。

（2）蛋白的準(zhǔn)備及處理：從PDB（http://www. rcsb. org/）數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白（人源蛋白優(yōu)先，原始配體與要對接的活性成分結(jié)構(gòu)相似度高的優(yōu)先，選取分辨率高的）；將蛋白倒入PyMoL（2.3.0）去除原始配體和水分子，然后將蛋白導(dǎo)入AutodockTools（v1.5.6）進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、分配電荷、指定原子類型并保存為“pdbqt”格式。

（3）參數(shù)文件的準(zhǔn)備：以蛋白原始配體作為對接盒子中心，若無原始配體則將整個(gè)蛋白作為對接區(qū)域，格點(diǎn)盒子的大小設(shè)定為80×80×80（每個(gè)格點(diǎn)的間距為0.037 5 nm），其余參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。

（4）對接：利用PyMOL和Ligplot進(jìn)行相互作用模式分析。最后整理分析所得的評(píng)分，用以評(píng)價(jià)小分子化合物與蛋白靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性。

3 結(jié)果及分析

3.1 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)及結(jié)果分析

通過中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年版）軟件，分別以干餾法和火烤法S8的指紋圖譜作為參照圖譜，采用平均數(shù)法，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，自動(dòng)匹配生成指紋圖譜共有模式。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，干餾法處理鮮竹瀝的相似度為0.944～0.991，火烤法處理鮮竹瀝的相似度為0.960～0.997，表明同一產(chǎn)地的2種炮制方法制備的8批鮮竹瀝質(zhì)量較為穩(wěn)定均一。干餾法及火烤法處理鮮竹瀝的GC-MS指紋圖譜疊加圖見圖1、2，相似度結(jié)果見表1。

3.2 鮮竹瀝活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測

通過比對指紋圖譜鮮竹瀝2種工藝下的物質(zhì)成分，發(fā)現(xiàn)鮮竹瀝指紋圖譜可確定火烤法共15個(gè)共有峰，干餾法共51個(gè)共有峰。通過“2.6”項(xiàng)下鮮竹瀝成分篩選方法，篩選出14種化合物，其中丁香醛、二氫丁香酚、香草酸、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對乙基苯酚、香蘭素僅在干餾法中存在，苯甲酸僅在火烤法中存在，指紋圖譜及其中篩選出的14個(gè)成分峰見圖1標(biāo)示，根據(jù)篩選原則篩選出的化合物活性成分信息詳見表2。

圖1 干餾法制備的鮮竹瀝GC-MS指紋圖譜

圖2 火烤法制備的鮮竹瀝GC-MS指紋圖譜

表1 干餾法及火烤法制備的鮮竹瀝GC-MS指紋圖譜相似度

表2 篩選出的鮮竹瀝活性成分的質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)

3.3 “咳、喘、痰”病癥相關(guān)靶點(diǎn)

從SwissTargetPrediction（http://swisstarget- prediction.ch/）網(wǎng)站進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，以“Probability”≥0.05作為標(biāo)準(zhǔn)篩選藥物成分靶點(diǎn)，最終得到與候選化合物作用相關(guān)的109個(gè)靶點(diǎn)蛋白。分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）搜尋疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，以“Relevance score”大于中位數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)篩選疾病靶點(diǎn)，總共獲得3162個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

3.4 鮮竹瀝“成分-疾病”靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

將鮮竹瀝化合物作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)基因取交集（圖3），共獲得鮮竹瀝-疾病交集基因61個(gè)，對應(yīng)鮮竹瀝化合物12個(gè)，使用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建鮮竹瀝“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖4），網(wǎng)絡(luò)中共有165個(gè)節(jié)點(diǎn)（化合物12個(gè)節(jié)點(diǎn)、靶點(diǎn)143個(gè)節(jié)點(diǎn)）；度值較高的化合物有MOL000098（二氫丁香酚）、MOL000422（香草酸）、MOL000358（對乙烯基愈創(chuàng)木酚）、MOL000449（丁香醛）、MOL004561（對乙基苯酚），表明這些化合物可能是鮮竹瀝治療“咳、喘、痰”病癥的關(guān)鍵化合物。

圖3 鮮竹瀝成分-疾病交集基因韋恩圖

圖4 鮮竹瀝“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

3.5 核心靶點(diǎn)及PPI網(wǎng)絡(luò)

將韋恩圖得到的成分與疾病的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫獲得靶點(diǎn)間的相互作用，并以.tsv格式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，之后拓?fù)浞治觯远戎捣从嘲悬c(diǎn)大小及顏色，以結(jié)合分?jǐn)?shù)反映邊的粗細(xì)，從而構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)[18]，如圖5所示。該網(wǎng)絡(luò)共有61個(gè)節(jié)點(diǎn)和281條邊，網(wǎng)絡(luò)平均鄰居節(jié)點(diǎn)數(shù)為9.21，核心靶點(diǎn)相關(guān)參數(shù)見表3。

3.6 GO功能與KEGG通路富集分析

在GO功能富集分析中，共獲取281個(gè)GO條目，其中BP占187個(gè)、MF占64個(gè)、CC占30個(gè)，BP顯著富集炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein，MAP）的調(diào)控、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號(hào)通路的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等過程；CC主要富集在細(xì)胞核、細(xì)胞膜及外泌體周圍區(qū)域；MF主要富集在Zn離子結(jié)合、氧化還原酶活性、類固醇結(jié)合等功能，具體信息見表4。鮮竹瀝中化合物主要富集在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、MAP酶活性的正向調(diào)節(jié)、cAMP反應(yīng)、氧化還原過程、炎癥反應(yīng)等靶點(diǎn)，提示鮮竹瀝通過多種生物學(xué)途徑治療“咳、喘、痰”病癥。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)

表3 核心靶點(diǎn)相關(guān)節(jié)點(diǎn)參數(shù)

KEGG通路富集結(jié)果顯示（圖6），61個(gè)交集基因顯著富集在36條通路上（＜0.05），選取排名前15位靶基因功能信息。與抗炎抗感染有關(guān)的通路為代謝途徑、花生四烯酸代謝、瞬時(shí)受體電位（transient receptor potential，TRP）通道炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)；與神經(jīng)興奮有關(guān)的通路為羥色胺能突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、多巴胺能突觸、酪氨酸代謝、苯丙氨酸代謝；與細(xì)胞刺激導(dǎo)致興奮的通路為cAMP信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、血管平滑肌收縮；與代謝有關(guān)的通路為脂肪細(xì)胞中脂解調(diào)控、藥物代謝-細(xì)胞色素P450；其他通路為缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號(hào)通路。表明這15個(gè)核心靶點(diǎn)可能主要通過調(diào)控上述通路達(dá)到干預(yù)疾病的目的。

表4 GO功能富集分析 (top15)

圖6 KEGG通路富集分析(top15)

3.7 分子對接結(jié)果

選取8個(gè)核心靶點(diǎn)與度值較高的化合物進(jìn)行半柔性對接（表5），以結(jié)合能表示小分子與靶蛋白結(jié)合的優(yōu)劣，結(jié)合能小于0代表小分子與靶蛋白可自由結(jié)合，結(jié)合能越小結(jié)合的可能性也就越高[19-20]。分子對接技術(shù)僅作為藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合情況的參考研究，后續(xù)將再細(xì)化深入。

表5 核心小分子與核心靶蛋白對接結(jié)果

本研究選取對接結(jié)果較好的化合物香草酸、對乙基苯酚、丁香醛、二氫丁香酚、對乙烯基愈創(chuàng)木酚與金屬基質(zhì)蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、前列腺素內(nèi)過氧化物酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）的對接情況進(jìn)行展示（圖7），對接結(jié)果表明小分子均能進(jìn)入靶蛋白的活性中心，小分子與這2個(gè)靶基因的結(jié)合能最低，表明小分子與這2個(gè)蛋白的結(jié)合能力最強(qiáng)；香草醛與MMP9的Arg249形成氫鍵，氫鍵的長度分別為0.288 nm；對乙基苯酚未形成氫鍵，與MMP9的GLU227、Leu188、MET247、Tyr245、His226、Pro246、Tyr248、Va1223殘基形成了較強(qiáng)的疏水作用；丁香醛與PTGS2的Gln461、His39、Arg44 3個(gè)殘基分別形成4個(gè)氫鍵，氫鍵的長度分別為0.304、0.381、0.308、0.398 nm；二氫丁香酚與His207殘基形成了氫鍵，長度為0.293 nm；對乙烯基愈創(chuàng)木酚對接未形成氫鍵，與MMP9的Glu227、Leu188、Tyr248、Lcu243、Leu222、Tyr245、Val223、Met247、His226形成較強(qiáng)疏水作用。

3.8 鮮竹瀝治療“咳、喘、痰”的Q-Marker的預(yù)測分析

根據(jù)經(jīng)典的2種竹瀝炮制工藝進(jìn)行制備，先采用指紋圖譜研究其物質(zhì)基礎(chǔ)，根據(jù)鮮竹瀝對“咳喘痰”的治療作用，通過“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析，獲得鮮竹瀝治療“咳、喘、痰”的關(guān)鍵活性成分，并推測潛在治療靶點(diǎn)15個(gè)如VEGFA、多巴胺受體D2（dopamine receptor D2，DRD2）、細(xì)胞色素P450 1B1（cytochrome P450 family 1 subfamily B member 1，CYP1B1）、雌性激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）等[19-20]，通過調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝、TRP通道、炎癥反應(yīng)相關(guān)酶抗炎；通過激活cAMP信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、調(diào)控MAP激酶活性及cAMP反應(yīng)控制機(jī)體血管平滑肌收縮重構(gòu)、氧化還原[21-23]等，綜合上述過程，發(fā)揮對咳嗽、痰喘病癥的治療作用。預(yù)測度值較高的化合物二氫丁香酚、香草酸、對乙烯基愈創(chuàng)木酚、丁香醛、對乙基苯酚可能是鮮竹瀝治療“咳、喘、痰”病癥的關(guān)鍵化合物，預(yù)測為鮮竹瀝的Q-Marker。其中酚酸類香草酸能夠抑制花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集作用，具有抗炎、抗氧化的藥理作用，通過調(diào)控脂多糖刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抑制炎癥[24-25]。丁香醛具有抗氧化、抗炎作用，對心臟有一定的保護(hù)作用[26]。二氫丁香酚、對乙烯基愈創(chuàng)木酚及對乙基苯酚為天然酚類抗氧化劑，對清除自由基有重要作用[27]。其中丁香醛、二氫丁香酚、香草酸、對乙基苯酚為干餾法的特有成分。

A-香草酸-MMP9 B-對乙基苯酚-MMP9 C-丁香醛-PTGS2 D-二氫丁香酚-MMP9 E-對乙烯基愈創(chuàng)木酚-MMP9

3.9 Q-Marker的有效性佐證

預(yù)測的Q-Marker通過分子對接佐證其生物活性，通過文獻(xiàn)佐證其有效性，通過文獻(xiàn)檢索對鮮竹瀝中的成分的藥效靶向組織、作用、應(yīng)用見表6。

核心靶點(diǎn)VEGFA可通過調(diào)節(jié)產(chǎn)生前列環(huán)素、增加超氧化物歧化酶的表達(dá)等維持和保護(hù)肺血管的正常結(jié)構(gòu)，在維持肺臟正常發(fā)育和生理功能以及修復(fù)損傷方面起著關(guān)鍵作用[28-29]。雄性激素受體（androgen receptor，AR）及其受體水平高低可能是其治療慢性支氣管炎的作用機(jī)制之一[30-31]。ESR1對ESR1抑癌基因的失活與啟動(dòng)子病變甲基化有關(guān)[32]。同時(shí)ESR1、VEGF作為哮喘候選基因可能會(huì)導(dǎo)致肺功能下降[33]。DRD2可以減少腫瘤細(xì)胞的生長，DRD2的激動(dòng)劑能以劑量和時(shí)間相關(guān)性的方式抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖，被認(rèn)為可能是肺癌患者的潛在治療靶點(diǎn)[34-35]。VEGF能夠通過抑制炎癥及CD133+祖細(xì)胞調(diào)節(jié)保護(hù)肺部免受炎癥損傷[36]，通過刺激肺細(xì)胞增殖和遷移防止肺細(xì)胞死亡，是肺氣腫的肺泡結(jié)構(gòu)恢復(fù)劑[37]。PTGS2為前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶，與氣道炎癥與慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病有關(guān)[38-39]。MMP9能使白細(xì)胞介素-8向中性粒細(xì)胞的趨化活性增加，并通過釋放VEGF以參與血管生成，加劇呼吸道纖維化從而氣道重建[40-41]。

表6 鮮竹瀝Q-Marker文獻(xiàn)相關(guān)信息

3.10 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法可靠性評(píng)價(jià)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中醫(yī)藥學(xué)研究新技術(shù)和新方法[58]，根據(jù)世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)2021年發(fā)布的《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》[59]以及李梢教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表的“《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》解讀”[60]，對本研究所涉及的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法進(jìn)行可靠性評(píng)價(jià)，表明本研究雖預(yù)測了鮮竹瀝的Q-Marker，但對成分的有效性缺乏相關(guān)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；數(shù)據(jù)來源如相關(guān)文獻(xiàn)、各類數(shù)據(jù)庫收集的數(shù)據(jù)也尚需擴(kuò)充，藥物的成分僅由GC-MS檢測，后續(xù)還需采用液質(zhì)儀器、核磁共振等擴(kuò)充鮮竹瀝的物質(zhì)基礎(chǔ)庫；針對研究的具體疾病，綜合考慮因素較為簡單，中醫(yī)病證與西醫(yī)的癥狀不完全等同，存在遺漏個(gè)別靶標(biāo)的可能性；分子對接方法通過簡單的模擬化合物與靶點(diǎn)自由結(jié)合能相比較，此結(jié)果能為后續(xù)的研究提供參考依據(jù)，因此后期將繼續(xù)對鮮竹瀝的不同炮制方法及其物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)一步擴(kuò)充，對Q-Marker的“咳、喘、痰”藥效活性及作用機(jī)制采用組學(xué)、生物芯片等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法進(jìn)一步驗(yàn)證和闡釋。

4 討論

鮮竹瀝載于《本草綱目》，主治病癥為肺熱咳嗽痰多、氣喘胸悶。其中“咳”用現(xiàn)代藥理解釋為咳嗽，“喘”解釋為喘息、哮喘，“痰”多數(shù)表現(xiàn)在氣道的分泌物增多。本研究從Q-Marker的“五原則”出發(fā)，采用經(jīng)典火烤法及干餾法制備鮮竹瀝，GC-MS方法檢測8批鮮竹瀝中的揮發(fā)性、小分子成分，獲得鮮竹瀝指紋圖譜并確定火烤法共15個(gè)共有峰，干餾法共51個(gè)共有峰，并篩選出的14個(gè)特征成分峰。以特征成分作為Q-Marker備選成分，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測二氫丁香酚、香草酸、對乙烯基愈創(chuàng)木酚、丁香醛、對乙基苯酚為鮮竹瀝揮發(fā)性成分的Q-Marker成分。并用文獻(xiàn)檢索出二氫丁香酚及丁香醛具有較強(qiáng)的抗炎及自由基清除活性；香草酸有抑制氧化應(yīng)激和預(yù)防肺部氣道炎癥有關(guān)與肺部腫瘤細(xì)胞具有相關(guān)性；對乙烯基愈創(chuàng)木酚具有抗氧化、護(hù)肝以及改善神經(jīng)功能有較強(qiáng)的藥理作用；丁香醛具有抑制沙門氏菌的致病力；對乙基苯酚作為酚類成分，具有較強(qiáng)抗炎、抗氧化作用。

核心靶點(diǎn)VEGFA、AR、ESR1、DRD2、VEGF、PTGS2、MMP9、鄰苯二酚--甲基轉(zhuǎn)移酶（catechol--methyltransferase，COMT）與鮮竹瀝Q-Marker抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗肺部腫瘤等相關(guān)，其主要通路為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、激活cAMP信號(hào)通路、調(diào)節(jié)血管平滑肌收縮、缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路，激活炎癥反應(yīng)相關(guān)酶、cAMP反應(yīng)。BP主要富集在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、MAP酶的調(diào)控、cAMP的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等過程；CC主要富集在細(xì)胞核、細(xì)胞膜及外泌體周圍區(qū)域；MF主要富集在Zn離子結(jié)合、氧化還原酶活性、類固醇結(jié)合等功能上，核心靶點(diǎn)主要分布于腦、心血管、腫瘤細(xì)胞（尤其是肺腫瘤細(xì)胞）、肺、肝臟、神經(jīng)、脾臟、盲腸，并有較高表達(dá)量，分子對接則表明Q-Marker與核心靶點(diǎn)有較好的結(jié)合能力，理論上表明核心靶點(diǎn)與Q-Marker之間有一定的生物活性。文獻(xiàn)報(bào)道及臨床使用鮮竹瀝多用于治療咳、喘、痰，作用多在大腦，肺部、心血管、肝臟，與核心靶點(diǎn)組織分布基本一致，表明核心靶點(diǎn)、通路、Q-Marker具有相關(guān)性。

中藥質(zhì)量是中藥臨床安全有效的基礎(chǔ)，從中藥的治療作用著手，找到影響治療作用的成分，并進(jìn)行質(zhì)量控制，體現(xiàn)了Q-Marker的整體觀，為鮮竹瀝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升及全程質(zhì)量控制提供參考[61-62]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，表明鮮竹瀝的治療是通過多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮起效，僅掌握單一成分尚不能全面客觀的評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，通過多成分-多靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法得到的成分可以為分析預(yù)測鮮竹瀝的Q-Marker提供了有力的證據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Predictive analysis of mechanism and quality marker of fresh bamboo sap on “cough, asthma, sputum” based on network pharmacology and molecular docking technology

ZHANG Yu-tian1, 2, WU Zhen-feng1, HUANG Yi3, ZHANG Jun4, ZHANG Xun1, LIN rui-hua1, WAN Na3, YANG Ming1

1. Key Laboratory of Modern Preparations of Chinese Medicine, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 2. Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 3. School of Pharmacy, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 4. The First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China

To predict and analyze the mechanism and potential quality marker (Q-Marker) of fresh bamboo sap in the treatment of “cough, asthma, sputum” based on network pharmacology and molecular docking methods.Fresh bamboo sap was prepared by dry distillation and fire roasting. The fingerprint of fresh bamboo sap was studied, and the potential targets and pathways of 14 components were screened and predicted. Target genes of “cough, asthma, sputum” disease were determined by combining literature database. Intersection genes of drug and disease were taken, protein-protein interaction (PPI) analysis was performed by String database, gene ontology (GO) functions and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis on intersection genes were performed by clusterProfiler function of Rstudio. Q-Markers of fresh bamboo sap were predicted, and molecular docking software was used to perform molecular docking on key targets and its corresponding components to verify the network analysis results.Eight batches of main active ingredients of fresh bamboo sap which prepared by dry distillation and fire roasting were obtained by fingerprint study. The therapeutic effects of fresh bamboo sap on “cough, asthma, sputum” symptoms were analyzed by network pharmacology and molecular docking. Q-Markers were vanillic acid,-ethylphenol, syringaldehyde, dihydroeugenol and-vinylguaiacol, which mainly regulated inflammation, cyclic adenosine monophosphate (cAMP) signaling pathway, hypoxia-inducible factor hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) signaling pathway, vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway and other important biological pathways to play the role of relieving cough, asthma and phlegm.By predicting the Q-Markers of fresh bamboo sap, it has laid a research foundation for improving its quality control standards, and provides a reference for study of related substances of fresh bamboo sap and explanation of mechanism. It provides a reference basis for its secondary development and the potential to expand the scope of clinical use.

fresh bamboo sap; network pharmacology; quality marker; molecular docking; relieving cough; resolving phlegm; relieving asthma; vanillic acid;-ethylphenol; syringaldehyde; dihydroeugenol;-vinylguaiacol

R285

A

0253 - 2670(2021)24 - 7538 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.016

2021-08-05

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1707203）；江西省科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)項(xiàng)目（贛科協(xié)字[2018]117號(hào)）；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目（202010412011）；江西省中醫(yī)藥管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2019A031）；江西省教育廳科學(xué)研究青年項(xiàng)目（GJJ180692）

張雨恬（1990—），女，博士，研究方向?yàn)橹兴幩巹┘爸兴庂|(zhì)量分析研究。Tel: (0791)87118658 E-mail: rainyzyt@163.com

萬 娜，講師，從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。E-mail: wanna988@163.com

楊 明，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥藥劑及炮制技術(shù)研究。E-mail: lab215@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]