王 鋒,張 超,鄭 栓
具有線粒體靶向性的雷公藤甲素TPP-PEG-PCL脂質(zhì)體的制備及其促肝腫瘤細(xì)胞凋亡研究
王 鋒1,張 超2*,鄭 栓1
1. 駐馬店中心醫(yī)院,河南 駐馬店 463000 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院,河南 鄭州 450046
成功制備雷公藤甲素(3-丙羧基)三苯基溴化膦(TPP)-聚乙二醇-b-聚己內(nèi)脂(PEG-PCL)脂質(zhì)體(Tr@TPP/Lip),評(píng)價(jià)其靶向性及促肝腫瘤細(xì)胞凋亡效果。采用正交試驗(yàn)優(yōu)選Tr@TPP/Lip的制備工藝,再研究該載藥系統(tǒng)的粒徑、Zeta電位、載藥量、包封率和多分散系數(shù)及透射電鏡微觀形態(tài),評(píng)價(jià)Tr@TPP/Lip的穩(wěn)定性、溶血性、釋放情況;采用熒光試驗(yàn),研究脂質(zhì)體與肝腫瘤細(xì)胞的融合情況、線粒體靶向性和肝臟靶向性;在等劑量給藥條件下,評(píng)價(jià)Tr@TPP/Lip促肝癌細(xì)胞凋亡效果。正交試驗(yàn)優(yōu)選的Tr@TPP/Lip粒徑為(113.5±17.6)nm,Zeta電位(12.6±0.7)mV,包封率為(71.3±3.2)%,載藥量為(3.9±1.1)%,多分散系數(shù)為0.12±0.04;透射電子顯微鏡圖片顯示Tr@TPP/Lip呈規(guī)則圓球形,該脂質(zhì)體穩(wěn)定性良好,具有較小的溶血率和良好的緩釋藥物性能;熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示,TPP陽(yáng)離子能促進(jìn)脂質(zhì)體與腫瘤細(xì)胞的融合,并靶向線粒體,還能提高藥物在肝腫瘤部位的靶向和滯留效果;細(xì)胞藥效結(jié)果顯示,Tr@TPP/Lip具有良好的促肝腫瘤細(xì)胞凋亡效果,能明顯降低線粒體膜Zeta電位、增加細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和Caspase-3的釋放,顯著增加促凋亡蛋白Bcl-2、減少抗凋亡Bax蛋白的表達(dá),這些細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)果均明顯優(yōu)于雷公藤甲素普通脂質(zhì)體和雷公藤甲素。Tr@TPP/Lip具有較好的線粒體靶向功能,能增強(qiáng)藥物促肝腫瘤細(xì)胞凋亡效果。
雷公藤甲素;正交試驗(yàn);細(xì)胞凋亡;TPP-PEG-PCL;線粒體靶向;脂質(zhì)體;肝腫瘤;溶血性;緩釋;活性氧;Caspase-3;Bcl-2;Bax
肝癌是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,死亡率在惡性腫瘤中位居第3位,目前開(kāi)展的治療策略有手術(shù)切除、肝動(dòng)脈栓塞、肝移植、化療及中藥聯(lián)合治療等[1-2]。傳統(tǒng)的化療容易帶來(lái)高復(fù)發(fā)、多藥耐藥和嚴(yán)重的不良反應(yīng)等,故很多晚期肝癌患者治療效果并不滿意[3]。
中藥具有多成分、多靶點(diǎn)聯(lián)合治療的優(yōu)勢(shì),目前正逐漸成為治療肝癌新的研究方向[4-5]。雷公藤甲素(triptolide,Tr)是從衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤Hook. f.中分離得到的二萜三環(huán)氧化物,目前,發(fā)現(xiàn)它對(duì)肝癌、胰腺癌、子宮癌和膽管癌等多種惡性腫瘤均具有很好的療效[6-7]。大量研究證實(shí),Tr可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞線粒體相關(guān)因子,引起線粒體生物功能改變,升高細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平[8-9],誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[10-11]。但該藥物分子存在水溶性差和毒性大等問(wèn)題[12],嚴(yán)重限制了該藥物在臨床上的應(yīng)用。因此,有必要構(gòu)建一種新型藥物載體,增強(qiáng)Tr的水溶性,降低該藥物的毒副作用,同時(shí)精準(zhǔn)將藥物遞送到腫瘤部位的線粒體,充分發(fā)揮制劑減毒增效的優(yōu)勢(shì),將來(lái)更好的用于肝癌的治療。
脂質(zhì)體可將藥物包載于磷脂雙分子層內(nèi)而形成微型泡囊體,不僅能明顯增強(qiáng)藥物的水溶性,改善藥物的生物相容性,還能通過(guò)高分子材料的進(jìn)一步修飾,增強(qiáng)脂質(zhì)體的靶向性,目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤藥物的靶向遞送[13]。(3-丙羧基)三苯基溴化膦[(3-carboxypropyl) triphenylphosphonium bromide,TPP]屬于陽(yáng)離子,容易被帶負(fù)電荷線粒體膜所吸引,常用來(lái)介導(dǎo)腫瘤藥物載體靶向遞送至線粒體,提高藥物的選擇性,發(fā)揮細(xì)胞器靶向給藥的優(yōu)勢(shì),增強(qiáng)藥物的抗腫瘤效果[14-15]。因此,本研究在文獻(xiàn)報(bào)道[16]的基礎(chǔ)上,擬采用TPP陽(yáng)離子修飾脂質(zhì)體,預(yù)設(shè)計(jì)將Tr遞送到肝癌細(xì)胞線粒體的雷公藤甲素TPP-PEG-PCL脂質(zhì)體(Tr@TPP/Lip),精確調(diào)節(jié)線粒體功能,增強(qiáng)藥物促腫瘤細(xì)胞凋亡效果。
Tr原料藥,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,批號(hào)20201107,成都德思特生物科技有限公司;大豆磷脂,批號(hào)20200711,德國(guó)Lipoid公司;膽固醇,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%,批號(hào)20201108,北京百靈威科技有限公司;氨基聚乙二醇聚己內(nèi)酯高分子聚合物(PCL-PEG- NH2),PEG相對(duì)分子質(zhì)量2000,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%,批號(hào)20191205,西安瑞禧生物科技有限公司;香豆素6熒光染料(coumarin 6,C6),質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%,批號(hào)20200917,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;DIR熒光染料,批號(hào)20201022,蘇州宇恒生物科技有限公司;線粒體熒光染料(MitoTracker? Red),批號(hào)20201009,上海聯(lián)邁生物工程有限公司;細(xì)胞核Hoechst 33258染料,批號(hào)20201117,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;TPP(批號(hào)20201022)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC?HCl,批號(hào)20200917),上海麥克林生化科技有限公司;-羥基丁二酰亞胺(NHS),批號(hào)20201106,上海共價(jià)化學(xué)科技有限公司;甲醇、乙腈,色譜級(jí),美國(guó)Fisher化學(xué)試劑公司。
人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721,中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;美國(guó)Gibco 16000-044胎牛血清,特級(jí)FBS,上海聯(lián)碩生物科技有限公司;BALB/c nude(裸鼠),河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循河南中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定,均符合3R原則。
Zetasizer Nano ZSP納米粒度Zeta電位儀,英國(guó)馬爾文公司;OLS5000型激光共聚焦顯微鏡,奧林巴斯北京銷售有限公司;JEM-2100型透射電子顯微鏡(TEM),日本電子株式會(huì)社;TG19型臺(tái)式高速離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;ESJ60-5A型電子分析天平,上海精密儀器有限公司;Aglient 1200高效液相色譜儀,安捷倫科技(中國(guó))有限公司;Multiskan SkyHigh型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技公司。
精密稱取80 mg TPP、75 mg EDC、70 mg NHS置于10 mL二孔圓底燒瓶中,加入3 mL二氯甲烷促使三者溶解,添加30 μL三乙胺,向其中一孔通入氬氣,然后再用塞子堵住另一孔,室溫下攪拌5 h,然后加入120 mg PCL-PEG-NH2,再添加2 mL二氯甲烷,室溫繼續(xù)攪拌過(guò)夜,然后將其轉(zhuǎn)移到透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量3000)中透析12 h,純化樣品,最后將透析袋中內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至燒杯中,進(jìn)行冷凍干燥,即可獲得TPP-PEG-PCL。經(jīng)1H-NMR(圖1)驗(yàn)證,化學(xué)位移7~8的為T(mén)PP陽(yáng)離子的3個(gè)聯(lián)苯峰,化學(xué)位移3.5為PEG的單甲醚特征峰,化學(xué)位移1.2為PCL烷基氫特征峰,由此表明,TPP-PEG-PCL已經(jīng)成功合成。
圖1 1H-NMR驗(yàn)證TPP-PEG-PCL的合成
精密稱取Tr 30 mg、大豆磷脂和膽固醇適量,TPP-PEG-PCL 20 mg,置于茄型瓶中,加入20 mL色譜甲醇促進(jìn)溶解,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀設(shè)置適量轉(zhuǎn)速減壓濃縮成膜除去有機(jī)溶劑,然后再冷凍干燥過(guò)夜,盡量除去殘留有機(jī)溶劑,加入適量的蒸餾水或磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS),于適量溫度水浴輕微振搖30 min進(jìn)行水化,再超聲處理5 min,促進(jìn)脂質(zhì)體分散,然后過(guò)0.22 μm微孔濾膜,再轉(zhuǎn)移到Avanti脂質(zhì)體擠壓器中,以100 nm的膜來(lái)回?cái)D壓20次左右,即可獲得粒徑均勻分布的Tr@TPP/Lip溶液。
吸取Tr@TPP/Lip,采用蒸餾水稀釋10倍左右,以Zetasizer Nano ZS納米粒度Zeta電位儀測(cè)定粒徑、Zeta電位分布;采用移液槍吸取大約100 μL Tr@TPP/Lip,滴加在200目銅網(wǎng)上,采用洗耳球吹干,再滴加微量0.5%磷鎢酸進(jìn)行復(fù)染,低溫吹干溶液,在TEM下觀察脂質(zhì)體的微觀形態(tài)。
2.4.1 色譜條件[17]Phenomenex Hyper Clore BDS C18分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫為30 ℃;流動(dòng)相為乙腈-水(33∶67);體積流量為1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為218 nm;進(jìn)樣體積為10 μL。
2.4.2 包封率和載藥量測(cè)定 吸取Tr@TPP/Lip溶液500 μL,置于超濾離心管(截留相對(duì)分子質(zhì)量3000)中,以15 000 r/min高速離心10 min,將離心管外游離的藥物定容到5 mL,即為外,將最初吸取的500 μL Tr@TPP/Lip溶液也定容到5 mL,即為總,采用HPLC測(cè)定以上樣品中Tr的含量,按照公式計(jì)算包封率。
將離心管內(nèi)的藥物進(jìn)行冷凍干燥成粉末,精密稱定質(zhì)量,再采用HPLC測(cè)定凍干后脂質(zhì)體中Tr含量,計(jì)算載藥量。
包封率=(總-外)/總
載藥量=內(nèi)/
外為離心后游離Tr質(zhì)量,總為脂質(zhì)體中Tr質(zhì)量,內(nèi)為離心后脂質(zhì)體中Tr質(zhì)量,為T(mén)r@TPP/Lip質(zhì)量
按表1設(shè)定的因素、水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),考察脂質(zhì)體制備工藝研究中大豆卵磷脂和膽固醇投料比(A)、旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速(B)、水化溫度(C)這3個(gè)因素,以脂質(zhì)體粒徑、包封率和載藥量為指標(biāo),參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行綜合評(píng)分[11],滿分為100分,粒徑占50%,以最小粒徑者為滿分50分,包封率和載藥量各占25%,以最高包封率和載藥量為滿分25分,優(yōu)選Tr@TPP/Lip制備過(guò)程中的上述考察因素,結(jié)果如表1顯示,方差分析結(jié)果見(jiàn)表2,極差結(jié)果提示,3個(gè)因素對(duì)結(jié)果影響的大小順序?yàn)锳>C>B,最終優(yōu)選的條件為A2B3C2,即大豆卵磷脂和膽固醇投料比例為80∶35,轉(zhuǎn)速為110 r/min,水化溫度為40 ℃。
綜合評(píng)分=粒徑最小值/粒徑×50+載藥量/載藥量最大值×25+包封率/包封率最大值×25
采用上述優(yōu)選的工藝條件,制備3批Tr@TPP/ Lip,按照“2.3”項(xiàng)方法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖2。Tr@ TPP/Lip的平均粒徑為(113.5±17.6)nm,Zeta電位為(12.6±0.7)mV;TEM圖顯示,Tr@TPP/Lip呈規(guī)則圓球形,分散性良好。Tr@TPP/Lip包封率為(71.3±3.2)%,載藥量為(3.9±1.1)%,多分散系數(shù)(PDI)為0.12±0.04。采用同樣質(zhì)量的Tr、大豆磷脂和膽固醇,以薄膜水化法制備Tr普通脂質(zhì)體(Tr@Lip)[18],經(jīng)測(cè)定Tr@Lip的平均粒徑為(108.4±15.6)nm,Zeta電位為(?10.8±0.6)mV,包封率為(79.6±4.5)%,載藥量為(4.1±1.2)%,PDI為0.11±0.05。
表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
表2 方差分析結(jié)果
0.01(2, 2)=99.00
圖2 Tr@TPP/Lip的粒徑分布(a)、Zeta電位(b) 和TEM圖(c)
2.7.1 存儲(chǔ)穩(wěn)定性試驗(yàn) 將Tr@TPP/Lip于4 ℃冰箱中保存60 d,然后每隔10 d檢測(cè)該脂質(zhì)體的粒徑、Zeta電位、載藥量和包封率。由表3可知,Tr@TPP/ Lip在放置60 d的粒徑、Zeta電位載藥量和包封率波動(dòng)不大,基本與最初保持一致,由此表明,Tr@ TPP/Lip在4 ℃冰箱中穩(wěn)定性良好。
表3 Tr@TPP/Lip的存儲(chǔ)穩(wěn)定性
2.7.2 血清穩(wěn)定性 將Tr@TPP/Lip與10%胎牛血清于37 ℃條件下進(jìn)行孵育24 h,然后每隔4 h將其取出,采用15 000 r/min離心5 min,除去胎牛血清的干擾,吸取上清液檢測(cè)脂質(zhì)體的粒徑、Zeta電位、載藥量和包封率。由表4可知,Tr@TPP/Lip在與血清孵育24 h期間,粒徑和Zeta電位變化也不明顯,粒徑比未孵育前的脂質(zhì)體稍微增大,可能在檢測(cè)過(guò)程中有少量血清蛋白吸附所致,載藥量和包封率也未見(jiàn)明顯變化,由此提示,Tr@TPP/Lip在與血清孵育過(guò)程中能基本上保持固有的脂質(zhì)體結(jié)果,穩(wěn)定性良好。
表4 Tr@TPP/Lip血清穩(wěn)定性
吸取Tr@TPP/Lip適量體積,依次用PBS稀釋成質(zhì)量濃度為800、400、200、100、50、25 ng/mL的系列溶液,將其等體積的10%紅細(xì)胞懸液混合,以生理鹽水為陰性對(duì)照,蒸餾水為陽(yáng)性對(duì)照,放置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中孵育2 h,然后將其取出,以2500 r/min離心5 min,下層為血細(xì)胞,采用移液槍吸取上層,轉(zhuǎn)移到96孔酶標(biāo)板,于540 nm采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(),計(jì)算溶血率,平行3份。結(jié)果見(jiàn)圖3,Tr@TPP/Lip和Tr@Lip溶血率都保持在5%以下。由此表明,Tr@TPP/Lip具有很好的血液相容性,溶血率相對(duì)較小。
溶血率=(樣品管值-陰性對(duì)照管值)/(陽(yáng)性對(duì)照管值-陰性對(duì)照管值)
取Tr、Tr@Lip、Tr@TPP/Lip(三者均含200 μg Tr)分別置于Spectrum Labs透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量為3000)中,兩端以塑料夾封閉,將透析袋置于50 mL pH 7.4 PBS和pH 5 PBS緩沖液中,添加0.1%聚山梨酯80作為表面活性劑促進(jìn)釋放出Tr的溶解,攪拌快速分散。設(shè)置水溫為37 ℃,采用磁力攪拌器,設(shè)置轉(zhuǎn)速為150 r/min,于預(yù)定時(shí)間點(diǎn)(2、4、8、10、12、24、36、48 h),采用移液槍吸取200 μL至進(jìn)樣瓶中內(nèi)襯管中,同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)體積的PBS,檢測(cè)釋放的Tr含量,計(jì)算累積釋放率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,pH 7.4 PBS條件下,游離Tr表現(xiàn)為快速釋放狀態(tài),12 h釋放量達(dá)86%以上,Tr@TPP/ Lip和Tr@Lip最初釋放較快,后面釋放緩慢,由此表明,Tr@TPP/Lip具有較好的緩釋性能;pH 5.0 PBS條件下,Tr@TPP/Lip和Tr@Lip也表現(xiàn)為緩釋趨勢(shì),但釋放速率明顯快于pH 7.4條件,鑒于腫瘤部位的酸性環(huán)境,有助于藥物在腫瘤部位的快速釋放,發(fā)揮藥物達(dá)到抗腫瘤效果。
圖3 Tr@TPP/Lip和Tr@Lip的溶血率
r=(eC+0C)/
r為藥物累積釋放率,e為PBS的置換體積,0為釋放介質(zhì)總體積,C為第次置換取樣時(shí)釋放液的濃度,為納米粒子所載藥物總質(zhì)量,為置換PBS的次數(shù)
考慮到Tr無(wú)熒光,本研究采用帶綠色熒光的C6作為表征藥物,按照上述方法載入脂質(zhì)體中,獲得C6@Lip和C6@TPP/Lip。人肝癌細(xì)胞SMMC- 7721接種于12孔培養(yǎng)板中,將細(xì)胞在胎牛血清中進(jìn)行培養(yǎng)24 h,然后與C6@Lip和C6@TPP/Lip共同孵育,其中C6在細(xì)胞培養(yǎng)液中的質(zhì)量濃度為100 ng/mL,孵育時(shí)間為1、2 h,收集細(xì)胞,采用PBS多次洗滌除去吸附在細(xì)胞外的C6,然后吸取少量轉(zhuǎn)移至載玻片上,采用5%多聚甲醇進(jìn)行固定,以1 mg/mL Hoechst 33342染細(xì)胞核(藍(lán)色)5 min,再置激光共聚焦顯微鏡下,觀察帶綠色的脂質(zhì)體與細(xì)胞核的重合情況,以Image J數(shù)據(jù)軟件計(jì)算各組的泊桑分布值,由此判斷脂質(zhì)體是否被細(xì)胞攝取。結(jié)果見(jiàn)圖5和表5。熒光結(jié)果(圖5)顯示,C6@TPP/Lip進(jìn)入細(xì)胞后,能快速聚集在細(xì)胞核周圍,細(xì)胞核周圍呈明亮的綠色,明顯強(qiáng)于C6@Lip;表5泊桑分布數(shù)值結(jié)果也表明,C6@TPP/Lip顯著高于C6@ Lip,兩者存在顯著性差異。由此推斷,TPP陽(yáng)離子能促進(jìn)脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取,促進(jìn)藥物載體與腫瘤細(xì)胞的融合,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面取決于脂質(zhì)體的磷脂雙分子層能與細(xì)胞膜很好的融合,另一方面借助于TPP陽(yáng)離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[15],有助于增強(qiáng)藥物載體的細(xì)胞攝取。
圖4 Tr@TPP/Lip、Tr@Lip和Tr的體外釋放對(duì)比研究(,n = 3)
按照以上處理程序?qū)⑷烁伟㏒MMC-7721細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),采用C6@Lip和C6@TPP/Lip共同孵育2 h,然后將細(xì)胞取出,以5%多聚甲醇進(jìn)行固定細(xì)胞,添加50 nmol/L MitoTracker?RED染線粒體(紅色)5 min,1 mg/mL Hoechst 33342染細(xì)胞核(藍(lán)色)5 min,然后置激光共聚焦顯微鏡下,觀察脂質(zhì)體在細(xì)胞內(nèi)的定位及分布情況,結(jié)果見(jiàn)圖6。帶綠色熒光的脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞后,與紅色線粒體重合后,變?yōu)辄S色,C6@TPP/Lip的黃色面積明顯高于C6@Lip。采用Image J數(shù)據(jù)軟件計(jì)算2組的泊桑分布值,C6@ TPP/Lip(0.727±0.028)顯著高于C6@Lip(0.412±0.032),2組比較具有顯著性差異(<0.01)。據(jù)此推斷,TPP陽(yáng)離子可以促進(jìn)脂質(zhì)體靶向線粒體。
圖5 不同時(shí)間點(diǎn)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721與脂質(zhì)體的融合情況
表5 C6@Lip和C6@TPP/Lip的泊桑分布值(,n = 3)
與C6@Lip組比較:**<0.01
**< 0.01C6@Lip group
采用熒光染料DIR包載于脂質(zhì)體中,制成DIR@TPP/Lip和DIR@Lip 2種脂質(zhì)體,將人肝癌細(xì)胞SMMC-7721接種在裸鼠肝臟部位制成肝腫瘤模型,然后將DIR@TPP/Lip和DIR@Lip以尾靜脈的形式注射肝腫瘤模型裸鼠,采用小動(dòng)物活體成像儀觀察給藥后8、24 h時(shí)肝臟部位的熒光強(qiáng)度,結(jié)果見(jiàn)圖7,DIR@TPP/Lip肝臟部位平均熒光強(qiáng)度明顯高于DIR@TPP/Lip,兩者存在顯著性差異,DIR@ TPP/Lip在24 h時(shí),肝臟部位還有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度,具有一定的滯留效應(yīng)。由此表明,TPP陽(yáng)離子可以促進(jìn)脂質(zhì)體靶向聚集在肝臟部位,并且消除也相對(duì)較慢。
圖6 C6@TPP/Lip與C6@Lip的線粒體靶向性和泊桑分布系數(shù)
圖7 DIR@TPP/Lip與DIR@Lip在腫瘤模型體內(nèi)的肝靶向性
2.13.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞SMMC-7721接種于24孔培養(yǎng)皿中,(密度約為1×106個(gè)/mL),在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
表6 DIR@TPP/Lip與DIR@Lip肝臟平均熒光強(qiáng)度(,n = 3)
與DIR@Lip組比較:##<0.01
##< 0.01DIR@Lip group
2.13.2 細(xì)胞存活率測(cè)定 將藥物組Tr、Tr@Lip、Tr@TPP/Lip與人肝癌細(xì)胞SMMC-772共同孵育,并設(shè)定系列藥物濃度分別為10、30、50、70、90、130、170、210 nmol/L,平行3份樣品。孵育24 h,加入5 mg/mL MTT 100 μL,繼續(xù)避光孵育4 h,隨后加入150 μL二甲基亞砜,輕微振蕩10 min,采用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組的值,以PBS作為空白對(duì)照,按公式計(jì)算各組的細(xì)胞存活率,根據(jù)存活率擬合公式計(jì)算各組的計(jì)算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。
細(xì)胞存活率=加藥組值/空白對(duì)照組值
試驗(yàn)結(jié)果如表7所示,Tr@TPP/Lip對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抑制效果最顯著,明顯優(yōu)于Tr、Tr@Lip,尤其在高濃度下表現(xiàn)最為突出,經(jīng)計(jì)算給藥組中Tr@ TPP/Lip的IC50最小,與其他2組比較存在顯著性差異,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TPP-PEG-PCL脂質(zhì)體能明顯增強(qiáng)藥物的抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用。
2.13.3 細(xì)胞凋亡率 將Tr、Tr@Lip、Tr@TPP/Lip與人肝癌細(xì)胞SMMC-772共同孵育,設(shè)定給藥劑量為80 nmol/L,孵育24 h后,采用流式細(xì)胞儀以Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡率。以添加PBS(不含藥物)作為對(duì)照,其余同以上處理,通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件處理,計(jì)算各組的腫瘤細(xì)胞凋亡率(早期凋亡率和晚期凋亡率之和),結(jié)果見(jiàn)表8,Tr@TPP/Lip的腫瘤細(xì)胞凋亡率最高,與其余2組比較,均存在顯著性差異,由此表明,Tr@TPP/Lip具有很好的促腫瘤細(xì)胞凋亡效果。
表7 Tr@TPP/Lip、Tr@Lip與Tr的細(xì)胞存活率和IC50(,n = 3)
與Tr@Lip組比較:**<0.01;與Tr組比較:##<0.01
**< 0.01Tr@Lip group;##< 0.01Tr group
表8 Tr@TPP/Lip、Tr@Lip與Tr的腫瘤細(xì)胞凋亡率(,n = 3)
與Tr@Lip組比較:*<0.05;與Tr組比較:#<0.05
*< 0.05Tr@Lip group;#< 0.05Tr group
2.13.4 線粒體膜電位 將Tr、Tr@Lip、Tr@TPP/Lip與人肝癌細(xì)胞SMMC-772共同孵育,設(shè)定給藥劑量為80 nmol/L,孵育24 h后,加入2 μL JC-1(5 μg/mL)染色液,與細(xì)胞懸液均勻懸浮,繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min,再以1500 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min,收集細(xì)胞,用PBS洗滌2次,采用移液槍吸取200 μL細(xì)胞懸液,JC-1檢測(cè)試劑在正常細(xì)胞中發(fā)紅色熒光,在凋亡細(xì)胞中發(fā)綠色熒光,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅/綠熒光強(qiáng)度的比值可以定量檢測(cè)病變線粒體的比例。以添加PBS(不含藥物)作為對(duì)照,其余同以上處理。結(jié)果見(jiàn)表9,以對(duì)照組紅/綠熒光強(qiáng)度比值為基準(zhǔn),給藥組的該比值與對(duì)照組進(jìn)行比較,Tr@TPP/Lip組的熒光比值最小,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡效果最顯著。
表9 Tr@TPP/Lip、Tr@Lip與Tr促肝腫瘤細(xì)胞凋亡的線粒體膜電位比值(,n = 3)
與Tr@Lip組比較:*<0.05;與Tr組比較:#<0.05,表10同
*< 0.05Tr@Lip group;#< 0.05Tr group, same as table 10
2.13.5 DCFH-DA染色檢測(cè)胞內(nèi)ROS水平 將Tr、Tr@Lip、Tr@TPP/Lip與人肝癌細(xì)胞SMMC-772共同孵育,設(shè)定給藥劑量為80 nmol/L,孵育24 h后,加入濃度為10 μmol/L的2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)孵育30 min,然后以PBS洗滌3次,除去細(xì)胞表面殘留的DCFH-DA,以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組DCF熒光的強(qiáng)度值,體現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。以添加PBS(不含藥物)作為對(duì)照,其余同以上處理。結(jié)果見(jiàn)表10,雷公藤甲素TPP-PEG-PCL預(yù)處理后,可以明顯提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平,激活線粒體信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的大量凋亡。
表10 Tr@TPP/Lip、Tr@Lip與Tr促肝腫瘤細(xì)胞凋亡的DCF熒光強(qiáng)度和Caspase-3活性(,n = 3)
2.13.6 Caspase-3活性 將Tr、Tr@Lip、Tr@TPP/ Lip與人肝癌細(xì)胞SMMC-772共同孵育,設(shè)定每孔中藥物濃度為80 nmol/L,孵育24 h后,棄去培養(yǎng)液。采用0.25%胰蛋白酶消化后并收集于離心管中,以5000 r/min離心5 min,除去上清液,然后加入60 μL裂解液混勻,冰浴30 min,再以12 000 r/min離心15 min,采用移液槍將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中,加入50 μL檢測(cè)緩沖液,10 μL Ac-DEVD-pNA孵育12 h,以酶標(biāo)儀于405 nm處測(cè)定值,體現(xiàn)Caspase-3活性。以添加PBS(不含藥物)作為對(duì)照,其余同以上處理。結(jié)果見(jiàn)表10,Tr@TPP/Lip干預(yù)腫瘤細(xì)胞后的Caspase活性最高,可推測(cè)TPP-PEG-PCL脂質(zhì)體將較多的Tr遞送到線粒體,從而激活Caspase家族依賴細(xì)胞凋亡通路。
2.13.7 Western blotting分析 將人肝癌細(xì)胞SMMC-772接種于6孔板中(密度約為1×106個(gè)/mL)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h,待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期,采用Tr、Tr@Lip、Tr@TPP/Lip與人肝癌SMMC-772細(xì)胞共同孵育,每孔中藥物濃度為80 nmol/L,對(duì)照組為含10%胎牛血清培養(yǎng)基取代藥物。
收集細(xì)胞,提取蛋白,以12% SDS-PAGE分離膠溶液進(jìn)行電泳,100 V濕轉(zhuǎn)50 min,以5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)/三(羥甲基)氨基甲烷緩沖鹽溶液+聚山梨酯(Triethanolamine buffer saline + Tween,TBST)封閉液室溫下封閉1 h,TBST洗10 min,重復(fù)3次,加入一抗,采用TBST按照稀釋至適當(dāng)濃度[B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)稀釋比例均為1∶1000)]孵育一抗,以β-actin(稀釋比例為1∶1000)作為內(nèi)參,于4 ℃振蕩過(guò)夜,添加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋比例為 1∶2000),再采用TBST每隔5 min清洗,重復(fù)3次,采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行各組的光密度。以添加PBS(不含藥物)作為對(duì)照,其余同以上處理。結(jié)果如圖8所示,Tr@TPP/Lip可以顯著提高促凋亡蛋白Bax表達(dá),降低抗凋亡蛋白BCl-2表達(dá),與其他2組比較,存在顯著性差異。根據(jù)該結(jié)果推測(cè),Tr@TPP/Lip有助于將大量藥物遞送到腫瘤線粒體,激活細(xì)胞凋亡通路,從而引起凋亡蛋白Bax和BCl-2表達(dá)的改變。
與Tr@Lip組比較:**P<0.01;與Tr組比較:##P<0.01
肝癌是我國(guó)發(fā)病率和致死率較高的惡性腫瘤之一,目前臨床上主要以手術(shù)切除、介入、射頻消融等,這些治療手段最終嚴(yán)重?fù)p傷患者的生理機(jī)能,5年生存率仍低于20%[19]。中醫(yī)藥基于“扶正驅(qū)邪”理念,不僅關(guān)注腫瘤生長(zhǎng)抑制,還提高機(jī)體的免疫力,目前已成為腫瘤治療的新方向,目前已成為腫瘤治療的新方向[20]。雷公藤在中醫(yī)藥領(lǐng)域用藥歷史悠久,如常用的雷公藤片、雷公藤多苷片等。Tr是該藥用植物中提取的活性成分,在抗腫瘤方面相關(guān)分子機(jī)制較為成熟,以線粒體為中心,提高線粒體膜通透性,引起線粒體生物功能紊亂,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。故構(gòu)建一種線粒體靶向給藥系統(tǒng),對(duì)于提高該藥抗腫瘤效果具有重大研究?jī)r(jià)值。
本研究采用生物相容性好的脂質(zhì)體包載Tr,并以具有線粒體靶向功能的TPP陽(yáng)離子進(jìn)行修飾,成功制備了Tr@TPP/Lip,粒徑約為(113.5±17.6)nm,Zeta電位為(12.6±0.7)mV,透射電鏡圖片清晰直觀的發(fā)現(xiàn)Tr@TPP/Lip呈現(xiàn)規(guī)則圓球形,粒子大小與馬爾文粒徑檢測(cè)結(jié)果基本保持一致。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示,Tr@TPP/Lip在4 ℃放置60 d和37 ℃胎牛血清孵育過(guò)程中,納米粒子均能保持較好的粒子形態(tài),載藥量和包封率也基本與最初差不多,由此表明Tr@TPP/Lip具有較好的穩(wěn)定性。從Tr@TPP/ Lip制備的材料分析,大豆磷脂屬于天然磷脂,可自發(fā)形成良好的磷脂雙分子層,膽固醇還可以加強(qiáng)脂質(zhì)體的流動(dòng)性,TPP-PEG-PCL屬于雙親性高分子材料,恰好嵌合在磷脂雙分子層的親水和親脂層中,借助于高分子鏈狀結(jié)構(gòu)加強(qiáng)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性;磷脂雙分子層具有較強(qiáng)的電負(fù)性,能中和正電荷TPP陽(yáng)離子,很大程度上減少TPP陽(yáng)離子吸附電負(fù)性物質(zhì),加強(qiáng)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。另外,TPP陽(yáng)離子具有較強(qiáng)的正電性,采用TPP-PEG-PCL修飾脂質(zhì)體后,TPP陽(yáng)離子鏈接的PEG鑲嵌在磷脂雙分子層親水層,PCL屬于親脂性材料則與脂質(zhì)體的疏水層能較好的融合,而TPP陽(yáng)離子類似靶標(biāo)穿插于脂質(zhì)體親水層表面,故Tr@TPP/Lip仍可保持正電勢(shì),與文獻(xiàn)報(bào)道的一樣具有較強(qiáng)的靶向性[17]。紅細(xì)胞溶血結(jié)果顯示,Tr@TPP/Lip的溶血率基本5%以下,具有很好的血液相容性,可能是脂質(zhì)體具有較好的生物相容性,包載藥物后能掩蓋藥物的免疫原性,減少藥物與紅細(xì)胞的直接接觸;體外釋放結(jié)果表明,Tr@TPP/Lip釋藥緩慢,有助于延長(zhǎng)藥物的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間,將更多的藥物輸送到效應(yīng)部位;細(xì)胞熒光試驗(yàn)結(jié)果表明,TPP陽(yáng)離子可促進(jìn)TPP-PEG-PCL脂質(zhì)體與腫瘤細(xì)胞的融合,還能有助于脂質(zhì)體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),突破線粒體膜的阻礙,靶向聚集在線粒體周圍,從而實(shí)現(xiàn)了藥物的線粒體靶向傳輸。目前大量文獻(xiàn)表明,鑒于細(xì)胞膜和線粒體膜均帶負(fù)電荷,故可吸引到正電荷的TPP陽(yáng)離子,提高納米粒子靶向線粒體的能力達(dá)100~150倍,很大程度上克服高黏度細(xì)胞液的阻礙,促進(jìn)藥物進(jìn)入線粒體的效率,從而增強(qiáng)藥物的抗腫瘤效果[21-22]。小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示,TPP陽(yáng)離子能明顯提高脂質(zhì)體的肝靶性效果,有助于將大部分藥物聚集在肝細(xì)胞部位,且具有良好的滯留效應(yīng),可能的原因是帶正電荷的Tr@TPP/Lip被帶負(fù)電荷的肝細(xì)胞膜所吸引,增強(qiáng)了藥物載體在肝臟部位的滯留。細(xì)胞藥效結(jié)果表明,Tr@TPP/Lip促肝腫瘤細(xì)胞凋亡的IC50濃度最小,等濃度下腫瘤細(xì)胞凋亡率最高,明顯優(yōu)于Tr普通脂質(zhì)體和Tr,存在顯著性差異;另外,Tr@TPP/Lip還可以顯著升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平和Caspase-3活性,降低線粒體膜Zeta電位,提高促凋亡蛋白Bax表達(dá),明顯降低抗凋亡蛋白BCl-2表達(dá),據(jù)此推測(cè),TPP-PEG-PCL脂質(zhì)體能促進(jìn)藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),并靶向腫瘤線粒體部位,故能很大程度上提高藥物促肝腫瘤細(xì)胞凋亡效果。盡管如此,文獻(xiàn)報(bào)告TPP陽(yáng)離子修飾的靶向給藥系統(tǒng)在體內(nèi)代謝過(guò)程中,容易被帶負(fù)電荷的血漿蛋白吸附的問(wèn)題,從而影響藥物的靶向行為[23]。
本實(shí)驗(yàn)成功制備了Tr@TPP/Lip,穩(wěn)定性較好,具有良好的肝癌細(xì)胞線粒體靶向性,能明顯增強(qiáng)藥物促肝癌細(xì)胞凋亡效果。
利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
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Preparation of triptolide TPP-PEG-PCL liposomes with mitochondrial targeting and its promotion apoptosis of hepatic tumor cells
WANG Feng1, ZHANG Chao2, ZHENG Shuan1
1. Zhumadian Central Hospital, Zhumadian 463000, China 2. Graduate School of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China
To prepare triptolide TPP-PEG-PCL liposomes and evaluate its mitochondrial targeting and hepatic tumor cell apoptosis promoting effect.Orthogonal test was used to optimize the preparation process of triptolide TPP-PEG-PCL liposomes, and the particle size, Zeta potential, drug loading capacity, encapsulation rate, polydispersion coefficient and transmission electron microscope morphology of the drug delivery system were studied. The stability, hemolysis and release of triptolide TPP-PEG-PCL liposomes were evaluated. Fluorescence test was used to study the fusion of liver tumor cells and liposomes, mitochondrial targeting andliver targeting. Under the conditions of equal dose administration, the effect of triptolide TPP-PEG-PCL liposomes on promoting apoptosis of liver cancer cells was evaluated.The particle size of triptolide TPP-PEG-PCL liposomes was (113.5 ± 17.6) nm, Zeta potential was (12.6 ± 0.7) mV, encapsulation rate was (71.3 ± 3.2)%, drug loading was (3.9 ± 1.1)% and polydispersity index was 0.12 ± 0.04. Transmission electron microscopy pictures showed that triptolide TPP-PEG-PCL liposomes were in regular round spheres. The liposomes had good stability, low hemolysis rate and good sustained-release drug properties; Fluorescence test results showed that TPP cations could promote the fusion of liposomes and tumor cells, and target mitochondria, and could also improve the targeting and retention of drugs in liver tumors. The cell efficacy results showed that triptolide TPP-PEG-PCL liposomes had a good effect on promoting liver tumor cell apoptosis, and significantly reduced the mitochondrial membrane potential, increased the level of intracellular ROS and the release of Caspase-3 significantly, increased the expression of pro-apoptotic protein Bcl-2 and decreased the expression of anti-apoptotic Bax protein. The results of these apoptosis tests were significantly better than that of triptolide liposomes and triptolide.Triptolide TPP-PEG-PCL liposomes had a good mitochondrial targeting function and can enhance the effect of drugs on promoting liver tumor cell apoptosis.
triptolide; orthogonal experiment; cell apoptosis; TPP-PEG-PCL; mitochondrial targeting; liposomes; hepatic tumor; hemolysis; sustained release; active oxygen; Caspase-3; Bcl-2; Bax
R283.6
A
0253 - 2670(2021)24 - 7473 - 11
10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.009
2021-06-01
河南中醫(yī)藥大學(xué)博士科研基金資助項(xiàng)目(2017023);2017年全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目(豫中醫(yī)科教[2018]19)
王 鋒,主治中醫(yī)師,研究方向中藥分子的靶向構(gòu)建與評(píng)價(jià)。E-mail: 15978863102@163.com
張 超,副教授,博士。E-mail: 378745364@qq.com
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