李紹林，段 啟，趙珍東，沈小鐘，夏 黎，潘穎珊

β-細辛醚脂質(zhì)立方液晶納米粒的Bottom-up法制備工藝優(yōu)化及處方篩選

李紹林，段 啟*，趙珍東，沈小鐘，夏 黎，潘穎珊

廣東食品藥品職業(yè)學院，廣東 廣州 510520

以β-細辛醚為模型藥物，制備β-細辛醚脂質(zhì)立方液晶納米粒（β-asarone lipid cubic liquid crystal nanoparticles，β-A@LCNPs）載藥系統(tǒng)。采用Bottom-up法，以β-A@LCNPs的包封率、載藥量、穩(wěn)定性常數(shù)的歸一化綜合評分為質(zhì)量考察指標，分別通過單因素考察立方液晶制備工藝，優(yōu)化工藝參數(shù)，并通過星點設計響應面法，優(yōu)選β-A@LCNPs最佳處方。優(yōu)選的β-A@LCNPs制備工藝參數(shù)為60 ℃條件下，配置β-A@LCNPs懸濁液，而后1000 r/min勻速攪拌1.5 h，最后置于細胞超聲儀，200 W超聲15次，每次5 s，間隔10 s；優(yōu)選的β-A@LCNPs處方為單油酸甘油酯300 mg、β-細辛醚20 mg、聚乙烯醇27000 25 mg、水40 mL。β-A@LCNPs制備工藝簡單易行，重復性好；所得β-A@LCNPs立方結構形態(tài)完整，均一穩(wěn)定。

β-細辛醚；脂質(zhì)立方液晶；響應面法；納米粒；Bottom-up法；包封率；載藥量；穩(wěn)定性常數(shù)

立方液晶納米粒（cubic liquid crystalline nanoparticles，LCNPs），又稱脂質(zhì)立方液晶納米?；蚣{米立方體，是兩親性脂質(zhì)和表面活性劑在水中自發(fā)形成的雙連續(xù)的立方液晶納米分散體系，即脂質(zhì)和表面活性劑結合水形成立方液晶相[1-2]，再以類似固體納米粒的形式分散在過量的水中形成分散體系，是一種新型納米載藥系統(tǒng)，其中水溶性藥物可以包封在類脂立方液晶的水道中，脂溶性的藥物包封在脂質(zhì)雙分子層中，兩親性分子可貫穿其中[3-4]。立方液晶介于層狀液晶、六角液晶之間的一種相態(tài)，具有更好的熱力學穩(wěn)定性、生物黏附性、生物可降解性、多樣性包載藥物能力等特點[5]，作為新型納米載藥系統(tǒng)在化學藥、生物藥、中藥領域都有廣泛應用研究，已成為國內(nèi)外制劑研究的熱點之一[6-8]。

LCNPs制備方法有Top-down法、Bottom-up法、熱處理法、注入法、噴霧干燥法等。上述方法中，Bottom-up法是目前制備LCNPs常用的方法[9]。Bottom-up法是將脂質(zhì)材料和穩(wěn)定劑溶于有機溶劑中得到有機相，然后將有機相緩慢滴加到過量水相中，在攪拌、超聲等外界機械力分散作用下即可形成納米級粒子[10]。Bottom-up法更容易在較小能量輸出條件下產(chǎn)生粒子均勻、粒徑較小的LCNPs。Bottom-up法制備納米粒過程中因穩(wěn)定劑加入，納米粒分散體有較好的穩(wěn)定性[11-12]。

β-細辛醚為天南星科菖蒲屬植物石菖蒲Schott有效成分，藥理研究表明β-細辛醚藥理作用廣泛，具有保護神經(jīng)系統(tǒng)、保護心血管、抗哮喘、抗腫瘤、驅(qū)蟲等功效，具有極大的臨床運用價值[13-14]，但β-細辛醚水溶性差，不穩(wěn)定，且體內(nèi)吸收、代謝速度極快，藥物濃度起伏大，難以維持足夠長的有效血藥濃度，生物利用度低，制約了藥物的臨床應用[15]。采用新劑型改進藥物，是解決藥物存在問題的有效方法。本實驗選取β-細辛醚為模型藥物，采用Bottom-up法優(yōu)化β-細辛醚脂質(zhì)立方液晶納米粒（β-asarone lipid cubic liquid crystal nanoparticles，β-A@LCNPs）的制備工藝，并通過星點設計響應面法篩選β-A@LCNPs處方。

1 儀器與試藥

丹東百特BT-90納米激光粒度儀，丹東百特儀器有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括四元泵洗脫系統(tǒng)、自動進樣器、在線脫氣裝置、柱溫箱及光電二極管矩陣檢測器，美國Agilent公司；VORTEX 4渦旋振蕩器，上海達姆實業(yè)有限公司；DDS-307A電導率儀，上海儀電科學儀器公司；G220透射電子顯微鏡（TEM），荷蘭FEI公司；TG16.5離心機，上海盧湘儀離心機公司；KQ-50TDB高頻數(shù)控超聲儀，昆山超聲儀器公司；TK-12B型透皮擴散儀，上海凱鍇科貿(mào)有限公司。

β-細辛醚對照品，廣東食品藥品職業(yè)學院自制，HPLC峰面積歸一化法測得質(zhì)量分數(shù)為99.21%；石菖蒲，批號201909160810，購自廣州致信藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣東食品藥品職業(yè)學院梁永樞副主任中藥師鑒定為天南星科菖蒲屬植物石菖蒲Schott的干燥根莖；聚氧乙烯蓖麻油（cremephor EL，CEL）、泊洛沙姆407（polyethylene-polypropylene glycol，F(xiàn)127）、單油酸甘油酯（glyceryl monoolein，GMO），德國BASF公司；聚乙烯醇15000（polyvinyl alcohol，PVA150）、聚乙烯醇27000（PVA）、烷基酚聚氧乙烯醚（OP10乳化劑），上海麥克林生化科技有限公司；液相用甲醇、乙腈、乙醇為色譜純；聚乙二醇200（PEG200）、PEG400、異丙醇、丙二醇、丙三醇、去氧膽酸鈉、無水乙醇均為分析純，購于廣州化學試劑廠；水為雙蒸水。

2 方法與結果

2.1 β-A@LCNPs的制備

采用Bottom-up法制備β-A@LCNPs，精密稱取適量GMO于50 mL燒杯中，取處方量β-細辛醚滴加無水乙醇至完全溶解，倒入上述燒杯中混勻，水浴至60 ℃，作為A相；精密稱取適量PVA于100 mL燒杯中，加入適量蒸餾水，水浴至60 ℃，使PVA完全溶解，作為B相；將A相緩慢倒入B相中，60 ℃恒溫條件下，以800 r/min磁粒攪拌1.5 h，再于細胞超聲破碎儀上超聲5 min（超聲功率為150 W，5 s/次，每次間隔5 s），即得β-A@LCNPs。

2.2 β-細辛醚的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（65∶35）；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；檢測波長253 nm；進樣量10 μL；理論塔板數(shù)以β-細辛醚計不少于3400。色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取β-細辛醚對照品適量，至棕色量瓶中，加甲醇定容，制成β-細辛醚濃度為32.27 μg/mL的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 精密吸取β-A@LCNPs懸濁液樣品1 mL至10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

圖1 β-細辛醚對照品(A)、β-A@LCNPs樣品(B)的HPLC圖

2.2.4 線性關系考察 精密吸取β-細辛醚對照品溶液1、2、4、6、8 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，備用。精密吸取上述對照品溶液各10 μL，進樣，記錄色譜圖，測定峰面積，以峰面積（）對進樣量（）進行線性回歸，得回歸方程＝72 859.93－560.6，＝0.999 99，結果表明β-細辛醚在32.27～258.16 ng，峰面積與進樣量呈良好線性關系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取上述對照品溶液各10 μL，按“2.2.1”項色譜條件，重復進樣6次。結果β-細辛醚峰面積的RSD為0.15%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 分別于制備后0、0.5、1.0、3.0、6.0、12.0 h精密吸取10 μL供試品溶液進樣測定，結果β-細辛醚峰面積的RSD為1.23%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)測定穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復性試驗 分別取6份β-A@LCNPs懸濁液樣品，照“2.2.3”項方法制得6份供試品溶液，照“2.2.1”項色譜條件分別進樣10 μL進行測定，結果β-細辛醚質(zhì)量分數(shù)的RSD為0.93%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取1 mL已測定β-細辛醚含量的β-A@LCNPs懸濁液至10 mL棕色量瓶中，共6份，分別加入2 mL已知質(zhì)量濃度的對照品溶液，照“2.2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件測定β-細辛醚含量，計算回收率，結果β-細辛醚的平均加樣回收率為99.81%，RSD為0.75%，表明本方法β-細辛醚具有較好的加樣回收率。

2.2.9 樣品定量測定 按“2.2.3”項方法制備供試品進樣液，依照“2.2.1”項色譜條件進樣，測定β-細辛醚峰面積，代入線性方程，計算出樣品中β-細辛醚的含量。

2.3 β-A@LCNPs質(zhì)量考察指標測定

2.3.1 β-A@LCNPs包封率及載藥量的測定 稱取一定量β-細辛醚（td），按“2.1”項方法制備得β-A@LCNPs溶液，將β-A@LCNPs溶液采用高速離心法，13 485×離心10 min，分離得到上清液和β-A@LCNPs沉淀。吸取上清液，按照“2.2.1”項色譜條件檢測分析上清液中游離的β-細辛醚含量，測定游離β-細辛醚質(zhì)量（fd）；取下層沉淀，采用冷凍干燥法將其干燥得β-A@LCNPs，并精密稱定，得納米?？傎|(zhì)量（LCNPs）。根據(jù)公式（1）、（2）分別計算β-A@LCNPs包封率和載藥量。

包封率＝(td－fd)/td（1）

載藥量＝(td－fd)/LCNPs（2）

2.3.2 穩(wěn)定性常數(shù)（e）的測定 采用離心-可見光分光光度法測定β-A@LCNPs的e。具體測定方法為量取β-A@LCNPs，檢測波長450 nm，采用可見光分光光度法測定其濁度為0；900×離心30 min，吸取上層液，可見光分光光度法同波長測定離心后上層液的濁度為，根據(jù)公式（3）計算e。

e＝(0－)/0（3）

2.3.3 歸一化總評值（）計算[16]綜合考量β-A@LCNPs的包封率、載藥量及e值，作為制劑質(zhì)量評價因素，因而采用Derringer’s法將包封率、載藥量和e轉換為值。根據(jù)Hassan法分別求Partial期望值（d），其中包封率及載藥量值越大，表示β-A@LCNPs質(zhì)量越好，而e值越小，則說明β-A@LCNPs質(zhì)量越好，根據(jù)公式（4）分別將包封率及載藥量歸一化為Partial期望值，記為1、2；根據(jù)公式（5）將e歸一化為Partial期望值，記為3，再根據(jù)公式（6）將1、2、3轉化為值。

d＝(x－)/(－) （4）

d＝(－x)/(－) （5）

＝(123)1/3（6）

為響應值中的最小值，為響應值中的最大值，d為每個因素Partial期望值，x為參數(shù)實測值

2.4 單因素法考察β-A@LCNPs制備工藝及處方

經(jīng)前期預試驗，采用Bottom-up法制備β-A@ LCNPs，以載藥量、包封率及e的值為β-A@ LCNPs質(zhì)量評價指標，保持其他條件等同，考察單個因素變化對值的影響，初選工藝及處方。

2.4.1 攪拌時間考察 采用Bottom-up法制備β-A@LCNPs，取β-細辛醚20 mg滴加無水乙醇至完全溶解，加入裝有0.20 g GMO的燒杯中，水浴至60 ℃，作為A相；稱取20 mg PVA加入裝有40 mL蒸餾水中水浴至60 ℃，使PVA完全溶解，作為B相；將A相緩慢倒入B相中，重復上述操作，平行制備5份樣品，備用；60 ℃恒溫條件下，以1000 r/min勻速攪拌，分別攪拌0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，考察不同攪拌時間對制備β-A@LCNPs值的影響。測定各樣品包封率、載藥量、e值，并計算值，結果見表1?？芍?，攪拌時間在1.5 h內(nèi)，隨著攪拌時間增長，β-A@LCNPs的值增加，當攪拌時間超過1.5 h，β-A@LCNPs的值反而呈下降趨勢，這可能由于攪拌時間過長，攪拌剪切力破壞已形成納米粒的系統(tǒng)結構，致使藥物溶出，載藥量及包封率下降，因此，選擇攪拌時間1.5 h。

表1 攪拌時間對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

2.4.2 攪拌速率考察 參照“2.3.1”項方法平行配置5份β-A@LCNPs懸濁液，60 ℃恒溫條件下，分別以500、800、1000、1200、1500 r/min不同攪拌速度，攪拌1.5 h，考察不同攪拌速度對制備β-A@LCNPs值的影響。測定各樣品包封率、載藥量、e值，并計算值，結果見表2?？芍瑪嚢杷俣仍?000 r/min內(nèi)，隨著攪拌速度增加，β-A@LCNPs的值增加，當攪拌速度超過1000 r/min時，β-A@LCNPs的值反而呈下降趨勢，這可能由于攪拌速度小，納米粒子不容易分散開，易沉；而速度過快，納米粒子間碰撞加劇，粒子聚集而析出，值較小，因此，選擇攪拌速度1000 r/min。

表2 攪拌速率對包封率、載藥量、Ke、D值的影響

2.4.3 超聲功率考察 參照“2.3.1”項方法平行配置5份β-A@LCNPs懸濁液，60 ℃恒溫條件下，1000 r/min轉速，勻速攪拌1.5 h，而后分別置于細胞超聲儀，分別以100、150、200、250、300 W超聲處理10次，每次5 s，間隔10 s，測定各樣品包封率、載藥量、e，并計算值，結果見表3?？芍暪β蕦悠返闹涤绊戄^大，當超聲功率＞200 W時，隨著超聲功率的增加，包封率及載藥量下降，值減小，這可能由于超聲功率過大對納米粒子結構造成破壞，因而確定超聲功率為200 W。

表3 超聲功率對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

2.4.4 超聲次數(shù)考察 參照“2.3.1”項方法平行配置5份β-A@LCNPs懸濁液，60 ℃恒溫條件下，1000 r/min轉速，勻速攪拌1.5 h，而后分別置于細胞超聲儀，設定超聲功率為200 W，分別超聲5、10、15、20、25次，每次5 s，間隔10 s，測定各樣品包封率、載藥量、e，并計算值，結果見表4?？芍?，當超聲次數(shù)超過15次時，β-A@LCNPs的值減小，說明超聲次數(shù)過多導致晶型發(fā)生改變，藥物滲漏，包封率下降，載藥量下降。所以，綜合考慮選擇超聲次數(shù)為15次。

表4 超聲次數(shù)對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

2.4.5 GMO用量考察 參照“2.3.1”項方法平行配置GMO量分別為0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 g，其余各量等同（PVA 20 mg、β-細辛醚20 mg、水40 mL）β-A@LCNPs懸濁液，60 ℃恒溫條件下，1000 r/min轉速，勻速攪拌1.5 h，而后置細胞超聲儀，200 W，超聲15次，每次5 s，間隔10 s，測定各樣品包封率、載藥量、e值，并計算值，結果見表5?？芍?，GMO加入量對該載藥系統(tǒng)的值具有明顯影響，當GMO用量為0.25 g時，值最大，這與GMO用量對納米粒子結構穩(wěn)定有關，需進一步優(yōu)選用量。

2.4.6 投藥量考察 保持其他條件等同（GMO 0.25 g、PVA 20 mg、水40 mL），分別配置不同投藥量（10、15、20、25、30 mg），同等制備工藝（參照“2.3.5”項），制備β-A@LCNPs，分別測定各樣品包封率、載藥量、e值，并計算值，結果見表6?？芍?，投藥量＜20 mg，隨著投藥量增加值增大，當投藥量＞20 mg，隨著投藥量增加值減小，說明投藥量對β-A@LCNPs制備的值有較大影響，需做進一步考察優(yōu)化。

表5 GMO用量對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

表6 投藥量對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

2.4.7 穩(wěn)定劑種類篩選 保持其它條件等同（GMO 0.25 g、β-細辛醚20 mg、水40 mL），分別稱取你20 mg不同穩(wěn)定劑（F127、PVA150、PVA），同等制備工藝（參照“2.3.5”項），制備β-A@LCNPs，分別測定各樣品包封率、載藥量、e值，并計算值，結果見表7?？芍?，PVA作穩(wěn)定劑時，包封率、載藥量、e及值最大，故選擇PVA作為β-細辛醚LCNPs載藥系統(tǒng)穩(wěn)定劑。

2.4.8 穩(wěn)定劑PVA用量考察 保持其他條件等同（GMO 0.25 g、β-細辛醚20 mg、水40 mL），分別稱取不同劑量PVA（10、15、20、25、30 mg），同等制備工藝（參照“2.3.5”項），制備β-A@LCNPs，分別測定各樣品包封率、載藥量、e值，并計算值，結果見表8?？芍?，投藥量＜20 mg，隨著投藥量增加值增大，當投藥量＞20 mg，隨著投藥量增加值減小，說明說明PVA在一定范圍內(nèi)可以參與脂質(zhì)立方液晶結構的組裝并能支撐整個骨架，但是當用量超過20 mg，其又可能會導致結構的破壞或者晶型結構的轉變，導致包封率、載藥量、e及值下降，需做進一步考察優(yōu)化。

表7 不同穩(wěn)定劑對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

表8 PVA用量對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

2.4.9 分散相水量考察 保持其它條件等同（GMO 0.25 g、PVA 20 mg、β-細辛醚20 mg），分別量取不同體積分散水相（20、30、40、50、60 mL），同等制備工藝（參照“2.3.5”項），制備β-A@LCNPs，分別測定各樣品包封率、載藥量、e值，并計算值，結果見表9?？芍S著水相體積增加，該遞釋系統(tǒng)值增加，當水相體積＞30 mL時，值幾乎不變。原因可能當水含量少，β-A@LCNPs的濃度大，納米粒易相互黏合，藥物易析出；水相體積大，納米粒能較好的分散，不聚集，載藥量、包封率較高，e較小，值變大?？紤]該載藥系統(tǒng)的藥物濃度，需對水相用量進一步優(yōu)選。

2.5 星點設計響應面法優(yōu)化β-A@LCNPs處方

通過單因素法考察發(fā)現(xiàn)GMO量、β-細辛醚量、PVA量及水相對β-A@LCNPs質(zhì)量綜合評分影響較大，并采用星點設計響應面法對β-A@LCNPs處方進一步優(yōu)化。

表9 分散相水量對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

2.5.1 試驗設計 選取GMO量（1）、β-細辛醚量（2）、PVA量（3）、水相（4）4個因素作為自變量，每個因素設5水平，用代碼值?、?1、0、+1、+來表示（4因素星點設計的＝1.682）。代碼值所代表的實際操作物理量見因素水平表10。分別測定各試驗樣品的包封率、載藥量和e，參照“2.2.3”項下方法，計算值，作為β-A@LCNPs綜合評價考察指標，采用星點設計優(yōu)化處方，試驗安排及結果見表10。

表10 星點設計試驗安排及結果

2.5.2 模型擬合 將所得數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.5b軟件進行響應面試驗分析[17]，以各考察指標的值為響應值，對各因素進行多元線性回歸和二項式擬合。多元線性回歸方程＝0.71－0.009 51－0.032－0.0433＋0.007 74，＝0.245 1，＞0.05；二項式擬合方程＝0.0121－0.0072－0.0433＋0.0234＋0.02612＋0.09413＋0.03814＋0.02323－0.01824－0.0234－0.002 812＋0.008 722－0.02632－0.08842，＝0.997 5，＜0.01。

從擬合方程的相關系數(shù)可見，多元線性回歸方程的相關系數(shù)較低，表示自變量與因變量之間線性相關性較差，可見多元線性回歸擬合度不佳，預測性較差，因此該數(shù)學模型不合適。而多元二項式擬合方程相關系數(shù)較高，擬合效果較好。其中，1、2、3、4、12、22、32及42項為4因素對指標的單獨作用，而12、23、13、24、14和34項為因素的交互作用，方程從整體上反映了各因素及其相互作用對指標值的影響。

2.5.3 方差分析 采用ANOVA分析響應面的回歸參數(shù)。表11中統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)顯示給出了線性項、二次項、以及交互項對各考察指標綜合得分的影響，其中GMO量（1）、PVA量（3），對響應值（綜合評分值）的曲面效應顯著（＜0.05）；GMO量（1）與PVA量（3）的交互項（13）、水量的二次項（42）對響應值（值）的曲面效應極顯著（＜0.01）；在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對響應值（值）的影響排序：PVA量（3）＞GMO量（1）＞水（4）＞β-細辛醚（2）。二項式回歸方程失擬檢驗不顯著，說明未知因素對試驗結果干擾很小。擬合檢驗極顯著，說明該方程與實際情況擬合很好，較好地反應了β-A@LCNPs綜合得分（值）與GMO、β-細辛醚、PVA、水不同配方用量的關系，可以對條件范圍內(nèi)不同配方的β-A@LCNPs進行質(zhì)量評價（綜合評分值）進行預測。

表11 響應面二次模型的方差分析結果

2.5.4 響應面優(yōu)化、預測與驗證 根據(jù)二次多項式模型，應用Design-Expert 8.0.5b軟件繪制各考察指標綜合得分與各自變量間的三維響應曲面圖及等高線圖，結果見圖2。

結合二次回歸模型進行預測分析，β-A@LCNPs值最大值為0.745 5，此時最優(yōu)處方GMO 300 mg、β-細辛醚20 mg、PVA 25 mg、水40 mL。

圖2 各因素間對β-A@LCNPs D值的影響

按最優(yōu)處方，配制3份β-A@LCNPs，對每份樣品進行質(zhì)量綜合評價得分進行實驗驗證，結果β-A@LCNPs包封率平均值為90.78%、載藥量平均值為5.31%、e平均值為7.21%，值平均為0.72，實際值與預測值相比偏差率為?2.91%，RSD為1.36%，表明所建立的數(shù)學模型具有良好的預測性，所選處方重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定。

2.6 β-A@LCNPs粒徑分布測試

按β-A@LCNPs最優(yōu)處方及工藝平行制備3份樣品，用蒸餾水稀釋10倍，分別測定其粒徑分布，結果顯示，β-A@LCNPs粒徑分布成正態(tài)分布，平均粒徑為（85.28±3.26）nm，多分散系數(shù)（PDI）為0.190±0.003。

2.7 β-A@LCNPs TEM觀察

按β-A@LCNPs最優(yōu)處方及工藝制備β-A@ LCNPs樣品，稀釋100倍，滴在樣品臺上，放置于干燥皿中自然干燥。樣品干燥后放入離子濺射儀中鍍金膜，再將樣品置于透射電鏡中觀察[18]，結果見圖3。由圖3可見，β-A@LCNPs在水中分散較好，且粒徑大小差異較小。通過放大電鏡倍數(shù)發(fā)現(xiàn)，β-A@LCNPs為立方體結構，外觀完整，且存在空間結構堆積。

圖3 β-A@LCNPs的TEM圖

2.8 體外經(jīng)皮滲透考察

分別配制相同藥物濃度（載藥量5.31%）的β-A@LCNPs（按最優(yōu)處方與制備工藝制備）與β-細辛醚乳液（精密稱取20 mg β-細辛醚，滴加無水乙醇至完全溶解，再加入10 mL聚氧乙烯蓖麻油，攪拌均勻，而后逐滴加入30 mL蒸餾水，邊滴邊攪拌均勻，即得[19]）進行體外經(jīng)皮滲透考察。

取β-A@LCNPs和β-細辛醚乳液各5 mL，分別加入Franz擴散池[20]，滲透膜為小鼠腹部脫毛全皮，所用鼠皮的厚度均一，有效擴散面積為4.50 cm2，接收池體積為18 mL，接收介質(zhì)為32 ℃生理鹽水，200 r/min勻速磁力攪拌，以β-細辛醚為考察指標，分別于1、2、4、6、8、10、12 h抽取5 mL接收液（同時補加5 mL空白接收液），過0.45 μm微孔，參照“2.2.1”項下方法，測定接收液中β-細辛醚含量，以上試驗，β-A@LCNPs和普通乳分別平行做3組試驗，取均值，繪制滲透曲線，擬合參數(shù)，得藥物體外經(jīng)皮滲透動力學曲線方程見表12，通過比較體外經(jīng)皮滲透動力學參數(shù)穩(wěn)態(tài)透皮速率（s）和單位面積累積滲透量（Q），可以看出β-A@LCNPs較β-細辛醚乳液透皮速率提升了3倍，制劑透皮性能得到顯著提升。

Q＝C/

s＝d/d

C＝C＋0/ps

C為時間藥物的校正質(zhì)量濃度，C為時間藥物的測定質(zhì)量濃度，ps為時前藥物的測定質(zhì)量濃度，0為每次取樣體積，為接收液的總體積，Q為時間單位面積累積滲透量，為有效擴散面積

3 討論

本研究采用Bottom-up法將模型藥物β-細辛醚制備為LCNPs載藥體系，通過單因素方法分別考察攪拌時間、攪拌速率、超聲功率、超聲次數(shù)、對β-A@LCNPs制備工藝進行考察優(yōu)化，確立最佳制備工藝。并在單因素考察處方劑量對β-A@LCNPs質(zhì)量影響的基礎上，采用星點設計響應面法，以β-A@LCNPs各組分為考察因素，結合Design-Expert 4因素5水平設計安排試驗，以β-A@LCNPs質(zhì)量綜合評分（值）為評價指標，優(yōu)選出最佳β-A@LCNPs處方，優(yōu)選的β-A@LCNPs制備工藝、處方穩(wěn)定可行。

表12 β-A@LCNPs與β-細辛醚乳液體外經(jīng)皮滲透動力學參數(shù)(n = 3)

目前國內(nèi)多采用繪制三元相圖液晶區(qū)篩選立方液晶處方，但往往存在可選擇區(qū)域范圍廣，考察指標相對主觀，最終確立的處方多是預設的考察參數(shù)優(yōu)選，無法動態(tài)連續(xù)篩選指標，精確度不高。本實驗LCNPs最佳處方篩選，在單因素考察指標參數(shù)范圍的基礎上，采用星點設計響應面法，各因素對效應的影響并非線性，且考慮到多因素間的交互作用，區(qū)別于線性設計的正交設計或均勻設計篩選處方，星點設計通過多次試驗結果參數(shù)進行模型擬合優(yōu)化，找到擬合度最佳方程，指標參數(shù)具有連續(xù)性，多元高次方程綜合考量單因素及因素間的協(xié)同效應，推算出最佳配方，驗證及重復性好，工藝穩(wěn)定。星點設計響應面法篩選立方液晶處方，預測指導性更強，具有較好的推廣應用價值，為β-A@LCNPs制備工藝提供了科學、合理的理論和實驗依據(jù)。

立方液晶載藥系統(tǒng)制備方法有熱融法、噴霧干燥法、Top-down法、Bottom-up法，其中熱融法、噴霧干燥法所需溫度高，對溫度敏感性藥物不適宜[21]，Top-down法在制備過程需要更高能量，系統(tǒng)溫度高，納米粒在高溫條件下容易碰撞引起絮凝[3]，本文選用Bottom-up法加入有機溶劑有助β-細辛醚溶解，制備方法簡單，制備工藝穩(wěn)定可靠，制備的β-A@LCNPs質(zhì)量以包封率、載藥量、穩(wěn)定性為評價指標的綜合評分高、質(zhì)量好。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 阮世發(fā), 鄉(xiāng)世健, 洪軍輝, 等. 積雪草苷立方液晶制備工藝與含量測定方法研究 [J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報, 2017, 19(6): 54-56.

[2] 李紹林. 脂質(zhì)立方液晶納米粒載藥系統(tǒng)的研究進展 [J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2020, 36(20): 3261-3264.

[3] 芶子杰, 鄧盛齊, 陶靜, 等. 適于規(guī)模放大的姜黃素脂質(zhì)立方液晶制備工藝探討 [J]. 中國新藥雜志, 2017, 26(8): 946-951.

[4] 楊杰, 田蘭, 柴東坤, 等. 脂質(zhì)立方液晶作為藥物載體的靶向作用研究進展 [J]. 中國獸藥雜志, 2019, 53(7): 79-85.

[5] 田勇, 李見春, 李婷婷, 等. 富馬酸喹硫平脂質(zhì)立方液晶制備工藝研究 [J]. 中國藥業(yè), 2020, 29(17): 25-28.

[6] 劉麗麗, 史畑女, 方蕾, 等. 馬錢子總堿-白芍總苷脂質(zhì)立方液晶納米粒制備及體外評價 [J]. 中草藥, 2019, 50(17): 4076-4083.

[7] 單倩倩, 蔣曉靜, 桂雙英,等.雷公藤甲素立方液晶的制備及體外評價. 中國藥學雜志, 2019, 54(9): 726-733.

[8] 岳鵬飛, 劉陽, 謝錦, 等. 藥物納米晶體制備技術30年發(fā)展回顧與展望 [J]. 藥學學報, 2018, 53(4): 529-537.

[9] 郝秀華, 孫悅, 王蕾, 等. 星點設計優(yōu)化野黃芩素制備工藝 [J]. 特產(chǎn)研究, 2019, 41(2): 6-10.

[10] 房盛楠. 鹽酸普萘洛爾立方液晶凝膠的制備與評價 [D]. 福州: 福建醫(yī)科大學, 2017.

[11] 王清清, 陳明龍, 胡霞, 等. 馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒眼用制劑的制備和表征 [J]. 藥學學報, 2018, 53(11): 1894-1900.

[12] 徐玲霞, 馮文珍, 申寶德, 等. 吳茱萸次堿脂質(zhì)立方液晶納米粒包封率的測定方法研究 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2018, 33(10): 4373-4376.

[13] 楊雪鷗, 唐智勇, 黃雪梅, 等. 石菖蒲β-細辛醚研究進展 [J]. 中藥材, 2016, 39(3): 686-690.

[14] 蘭燁榮, 劉素香, 張鐵軍, 等. 細辛醚的研究進展 [J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2013, 28(2): 252-257.

[15] 劉春玲, 侯廣玉, 孫艷, 等. β-細辛醚對AD大鼠海馬神經(jīng)元蛋白質(zhì)組圖譜的影響 [J]. 全科口腔醫(yī)學電子雜志, 2019, 6(24): 187-188.

[16] Sug H. A method for normalization of relation schema based on data to abide by the third normal form [J]., 2020, 19(8): 216-225.

[17] 祝露佳, 陳禮迎, 鄭爽, 等. 星點設計-效應面法優(yōu)化銀杏內(nèi)酯B納米凍干制劑的制備工藝及其體外釋放研究[J]. 中草藥, 2019, 50(22): 5439-5447.

[18] 唐明華, 郭軍, 陳木子. 透射電鏡三維重構確定金納米粒子的立體結構 [J]. 分析科學學報, 2017, 33(4): 499-502.

[19] 趙瑛, 王莉. β-細辛醚鼻用微乳凝膠的制備及其釋放度考察 [J]. 抗感染藥學, 2019, 16(5): 743-747.

[20] 周剛, 付曉婷, 潘靜茹, 等. 他克莫司軟膏透皮一致性的體外Franz擴散池測定比較研究 [J]. 藥物分析雜志, 2020, 40(12): 2126-2133.

[21] 曾令軍, 房盛楠, 張靈娜, 等. 鹽酸普萘洛爾立方液晶納米粒的制備及體外評價[J]. 中國藥師, 2020, 23(6): 1094-1101.

Bottom-up preparation process optimization and prescription screening for β-asarone lipid cubic liquid crystal nanoparticles

LI Shao-lin, DUAN Qi, ZHAO Zhen-dong, SHEN Xiao-zhong, XIA Li, PAN Ying-shan

Guang Dong Food and Drug Vocational College, Guangzhou 510520, China

To prepare β-asarone lipid cubic liquid crystal nanoparticles (β-A@LCNPs) drug delivery system with β-asarone as model drug.The quality of β-A@LCNPs was evaluated by the normalized comprehensive score of encapsulation rate, drug loading capacity and stability constant. The preparation process of cubic liquid crystal was investigated by single factor, and the process parameters were optimized. The optimal formulation of β-A@LCNPs was optimized by response surface method of centroid design.The optimal preparation process parameters of β-A@LCNPs were as follows: Bottom-up method, 60 ℃, β-A@LCNPs suspension was prepared, then 1000 r/min uniform stirring for 1.5 h, finally placed in the cell ultrasound instrument, 200 watt ultrasonic power, ultrasonic 15 times, 5 s each time, 10 s interval; The optimal prescription for β-A@LCNPs was glycerin monoleate 300 mg, β-asarone 20 mg, polyvinyl alcohol 27000 25 mg and water 40 mL.The preparation process of β-A@LCNPs is simple, easy to perform and has good repeatability. The β-A@LCNPs were homogeneous and stable.

β-asarone; lipid cubic liquid crystal; response surface method; nanoparticles; Bottom-up method; encapsulation rate; drug loading capacity; stability constant

R283.6

A

0253 - 2670(2021)24 - 7464 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.008

2021-07-31

廣東省教育廳自然科學基金項目（2017GKQNCX037）；廣州市科技計劃項目（202102080588）；廣東省醫(yī)學基金項目（B2021236）；廣東省中醫(yī)藥局項目（20211280）

李紹林（1983—），男，博士，主要從事中藥新藥與新技術研究。Tel: (020)28854910 E-mail: lisl@gdyzy.edu.cn

段 啟（1969—），男，教授，主要從事中藥制劑與炮制研究。Tel: (020)28854910 E-mail: duanq@gdyzy.edu.cn

[責任編輯 鄭禮勝]