崔美娜，鐘凌云*，蘭澤倫，張大永，楊 明*

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS分析多物料多流程炮制對(duì)半夏化學(xué)成分的影響

崔美娜1，鐘凌云1*，蘭澤倫2，張大永2，楊 明1*

1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004 2. 四川新荷花中藥飲片股份有限公司，四川 成都 611731

應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）定性分析多物料多流程炮制半夏的化學(xué)成分，分階段探究不同物料和流程對(duì)其成分的影響。比較成分差異性，為闡明多物料多流程炮制對(duì)化學(xué)成分的變化規(guī)律提供參考。將通過(guò)不同物料和炮制流程得到的半夏階段產(chǎn)物分為4組，分別為浸漂半夏、石灰制半夏、甘草制半夏、法半夏，以生半夏作為對(duì)照。以5種樣品醇提液為供試品溶液，采用Waters Acquity BEH C18色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行二元梯度洗脫，質(zhì)譜采用電噴霧離子化源（ESI），正、負(fù)離子全掃描的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜信息。通過(guò)一級(jí)精確質(zhì)荷比和二級(jí)的碎片數(shù)據(jù)，參考文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫(kù)以及質(zhì)譜裂解規(guī)律，對(duì)5組樣品所含成分進(jìn)行鑒定。鑒定了101個(gè)化學(xué)成分，分別為7個(gè)生物堿類、5個(gè)氨基酸類、5個(gè)酰胺類、14個(gè)醇胺類、26個(gè)黃酮類、6個(gè)溶血磷脂酰膽堿類、14個(gè)脂肪酸甘油脂類、6個(gè)有機(jī)酸類、7個(gè)皂苷類及11個(gè)其他類型化合物。通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS/MS對(duì)5組樣品化學(xué)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)半夏炮制前后化學(xué)成分存在明顯差異，物料甘草為半夏引入了甘草黃酮、三萜皂苷類成分，而物料石灰對(duì)成分引入影響不大，推測(cè)出石灰的加入是為了在不影響藥效成分的前提下減輕半夏毒性。與生品相比，浸漂后的半夏成分減少，推測(cè)浸漂的過(guò)程中，會(huì)使成分有所損失。而經(jīng)過(guò)多物料多流程炮制的法半夏減少了刺激性毒性成分，增加了甘草黃酮類成分。該方法快速、準(zhǔn)確，為探究半夏多物料多流程炮制機(jī)制提供一種新的策略，對(duì)其藥效物質(zhì)深入研究及質(zhì)量控制具有重要意義。

半夏；法半夏；超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜；多物料多流程炮制；甘草黃酮

半夏(Thunb.) Breit為天南星科植物半夏的干燥塊莖。其性溫，味辛，有毒，歸脾、胃、肺經(jīng)。具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效。生用毒性大，一般炮制加工后使用。法半夏是半夏炮制品中最為常用的品種，采用多物料多流程炮制而成，具有燥濕化痰之功效。用于痰多咳喘、痰飲眩悸、風(fēng)痰眩暈、痰厥頭痛等[1]。多物料多流程是半夏炮制方法的核心，法半夏通過(guò)浸漂、浸泡，加入甘草、石灰進(jìn)行炮制而成，其長(zhǎng)于祛痰止咳[2-4]，在炮制過(guò)程中功效發(fā)生了改變。本研究主要探討多物料多流程炮制對(duì)半夏化學(xué)成分的影響，將法半夏的炮制分為幾個(gè)階段，將中間產(chǎn)物也作為樣品進(jìn)行研究，分別為浸漂半夏、甘草半夏、石灰半夏、法半夏。并與生品進(jìn)行比對(duì)，分析不同流程、物料炮制成分差異性，以期為闡明半夏經(jīng)多物料多流程炮制成為法半夏后功效發(fā)生變化的物質(zhì)基礎(chǔ)及其臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。

半夏中含有多種生物活性成分，如生物堿類、醇醚類、脂肪酸及酯類、多糖、揮發(fā)油、氨基酸、半夏蛋白和無(wú)機(jī)元素等[5]，具有止咳化痰、抗腫瘤、抗炎等藥理作用。而法半夏經(jīng)過(guò)炮制后增加了甘草成分，其中包括三萜皂苷類成分、黃酮類成分[6]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)半夏及其炮制品中的化學(xué)成分差異進(jìn)行了大量的研究，為半夏的現(xiàn)代應(yīng)用研究提供一定的理論依據(jù)。然而半夏不同物料不同流程分階段考察物質(zhì)基礎(chǔ)未見(jiàn)有研究報(bào)道。雖有許多學(xué)者分別對(duì)生品和炮制品做過(guò)一定的分離研究，但是單一物料、單一流程分別對(duì)化學(xué)成分的影響仍是未知的。為了明確其活性成分并闡述多物料多流程的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，其全成分分析研究十分必要。本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)，對(duì)半夏多物料多流程不同階段炮制品進(jìn)行了研究分析，根據(jù)色譜保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量、分子碎片峰和相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)主要色譜峰的來(lái)源進(jìn)行了歸屬，并對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推斷和鑒定。本研究比較全面地闡明了其化學(xué)組成，為以后藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

Triple-TOFTM5600+型質(zhì)譜儀（配有ESI源和APCI，Triple-TOFTM5600+System），AnalystTF 1.6 software數(shù)據(jù)采集軟件，Peakview 1.2 Software 數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)（美國(guó)AB Sciex）；30AD型高效液相色譜系統(tǒng)（包括DGU-30A3在線真空脫氣機(jī)，LC30AD泵，SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器，CBM-30A控制器，CTO-30A色譜柱溫箱，日本島津公司）。

生半夏購(gòu)自中國(guó)藥材市場(chǎng)，批號(hào)20180816，由江西中醫(yī)藥大學(xué)葛菲教授鑒定為天南星科植物半夏(Thunb.) Breit.的塊莖，甘草批號(hào)20181224，產(chǎn)自內(nèi)蒙古，由江西中醫(yī)藥大學(xué)葛菲教授鑒定為豆科植物甘草Fisch的干燥根和根莖。屈臣氏蒸餾水；乙腈（質(zhì)譜級(jí)，德國(guó)Merck公司），甲酸（質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)ACS公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

采用Waters Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～8 min，5%～30% B；8～12 min，30%～56% B；12～20 min，56%～58% B；20～28 min，58%～72% B；28～38 min，72%～75% B；38～41 min，75%～80% B；41～46 min，80% B；46～56 min，80%～85% B；56～60 min，85% B；60～67 min，85%～90% B；67～72 min，90% B；72～77 min，90%～95% B；77～79 min，95%B；79～79.1 min，95%～5% B；79.1～82 min，5% B～100% A）。柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL，體積流量0.25 mL/min。

2.2 質(zhì)譜條件

離子噴射電壓5500 V；去簇電壓分別為100 V；碰撞電壓分別是40 eV；去溶劑溫度500 ℃；霧化氣50 kPa；輔助加熱氣50 kPa；氣簾氣40 kPa；離子模式正離子；電噴霧離子源；質(zhì)量掃描范圍/100～1000；碰撞活化掃描15 eV。

2.3 樣品炮制方法及供試品溶液的制備

2.3.1 浸漂半夏 稱取半夏100 g，用水浸泡至內(nèi)無(wú)干心，約14 h。

2.3.2 甘草半夏 稱取半夏100 g，用水浸泡至內(nèi)無(wú)干心。另取甘草15 g，加水煎煮2 h至藥液充分煎出呈金黃色，加入半夏，浸泡5 d。

2.3.3 石灰半夏 稱取半夏100 g，用水浸泡至內(nèi)無(wú)干心。另取10 g 生石灰，加120 mL水，再加入半夏，攪勻，浸泡5 d。

2.3.4 法半夏 稱取半夏100 g，用水浸泡至內(nèi)無(wú)干心（每日換水1次）。另取甘草10 g，加1.5倍水煎煮2 h，即得甘草煎汁。加入15 g生石灰，攪勻，再加入浸透的半夏，浸泡5 d，至剖面淡黃色，口嘗微有麻舌感即可。將炮制好的法半夏至干燥箱中70 ℃干燥至干。在炮制過(guò)程中pH值保持在12以上。

2.3.5 供試品溶液的制備[5]分別稱取上述炮制品及生半夏各2 g，加入10倍量70%乙醇，浸漬30 min，微沸狀態(tài)下回流提取60 min，濾過(guò)，再加入5倍量的70%乙醇到藥渣回流30 min，濾過(guò)，合并提取液，靜置，吸取10 min，經(jīng)4000 r/min離心15 min，取上清液，稀釋，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)即得供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-TOF-MS對(duì)5種半夏中各類成分的快速鑒別

在色譜條件和質(zhì)譜條件下，對(duì)總離子流圖的色譜峰進(jìn)行分析，見(jiàn)圖1。采用Peakview 1.2軟件鑒定推斷化學(xué)成分并對(duì)其成分進(jìn)行歸類，對(duì)其主要碎片離子信息進(jìn)行歸屬，見(jiàn)表1。根據(jù)ESI離子源的工作原理可知，化合物在ESI電離過(guò)程中采用正離子模式會(huì)得到準(zhǔn)分子離子[M＋H]+；當(dāng)化合物經(jīng)過(guò)離子源轟擊后其結(jié)構(gòu)中特定的化學(xué)鍵會(huì)發(fā)生斷裂，產(chǎn)生相應(yīng)的離子碎片。由于同一類化合物具有相近的化學(xué)鍵斷裂方式，其共有的斷裂碎片就可作為一類化合物的特征碎片離子，作為這類化合物結(jié)構(gòu)鑒定的依據(jù)[6]。本研究根據(jù)化合物準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量、準(zhǔn)分子離子、特征碎片離子及其他碎片離子等信息，參考相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，初步定性101個(gè)化學(xué)成分，其中包括7個(gè)生物堿類、5個(gè)氨基酸類、5個(gè)酰胺類、14個(gè)醇胺類、26個(gè)黃酮類、6個(gè)溶血磷脂酰膽堿類、14個(gè)脂肪酸甘油脂類、6個(gè)有機(jī)酸類、7個(gè)皂苷類成分。結(jié)果見(jiàn)表1。

1-生品 2-浸漂半夏 3-甘草半夏 4-石灰半夏 5-法半夏

3.2 氨基酸類化合物的裂解規(guī)律

氨基酸為含有氨基和羧基的一類有機(jī)化合物，在正離子模式下，準(zhǔn)分子離子脫去NH3或COOH是氨基酸類化合物典型的質(zhì)譜裂解規(guī)律[7]。有些氨基酸會(huì)丟失NH3，但是此實(shí)驗(yàn)沒(méi)有檢測(cè)到此碎片離子，因此推測(cè)此類氨基酸中N為NH[5]。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析，在樣品中共鑒定出5個(gè)氨基酸類成分。如化合物oleoylglycine，軟件給出的分子式C20H37NO3，質(zhì)譜信號(hào)顯示準(zhǔn)分子離子為/340.284 6 [M＋H]+，丟失COOH后得到二級(jí)碎片/294.284 3 [M＋H－COOH]+。綜上信息，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，故推測(cè)為油酰甘氨酸質(zhì)譜信息，二級(jí)質(zhì)譜和裂解方式見(jiàn)圖2。用相同方法鑒別氨基酸類化合物。

3.3 酰胺類化合物的裂解規(guī)律

結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)查詢分析與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5]，共鑒定出半夏中酰胺類化合物5個(gè)，以化合物amide HPL為例，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配得到該成分分子式為C16H33NO，其準(zhǔn)分子離子為/256.263 5 [M＋H]+，通過(guò)Peakview 1.2對(duì)二級(jí)全掃描質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)很多二級(jí)質(zhì)譜碎片產(chǎn)生130.123 3 [M＋H－C9H17]+、116.108 4 [M＋H－CH2]+、102.093 7 [M＋H－CH2]+、88.079 3 [M＋H－CH2]+、74.063 3 [M＋H－CH2]+特征碎片離子。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，此類化合物的特征裂解途徑為酰胺鍵、酯鍵斷裂生成相應(yīng)的碎片離子[8]，故推測(cè)為酰胺質(zhì)譜信息，其二級(jí)質(zhì)譜圖與質(zhì)譜可能裂解途徑分別見(jiàn)圖3。

表1 半夏及其炮制品中化學(xué)成分UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

續(xù)表1

續(xù)表1

S-生品半夏 J-浸漂半夏 SH-石灰制半夏 GC-甘草制半夏 F-法半夏

S-J- Soaked and bleachedSH-made of lime GC-licorice pinellia F-

圖2 Oleoylglycine的二級(jí)質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑

3.4 黃酮類化合物的裂解規(guī)律

關(guān)于此類化合物，RDA裂解是其典型的質(zhì)譜裂解規(guī)律之一[9]，物料甘草引入許多甘草黃酮成分，以化合物licochalcone A為例，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配得到該成分分子式為C21H22O4，根據(jù)其裂解規(guī)律可以判斷結(jié)構(gòu)中存在糖取代基，其準(zhǔn)分子離子為/339.159 1 [M＋H]+，通過(guò)RAD裂解得到二級(jí)碎片離子/271.100 1 [M＋H－C5H7]+，107.050 6 [M＋H－C14H15O3]+，與文獻(xiàn)報(bào)道的質(zhì)譜信息相符[9]。其二級(jí)質(zhì)譜圖與質(zhì)譜可能裂解途徑分別見(jiàn)圖4。

3.5 溶血磷脂膽堿類化合物的裂解規(guī)律

溶血磷脂酰膽堿也稱溶血卵磷脂，不溶于丙酮、乙醚，有強(qiáng)溶血作用[5]。以化合物L(fēng)PC (18∶3)為例，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配得到該成分分子式為C26H48NO7P。通過(guò)Peakview 1.2對(duì)二級(jí)全掃描質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)很多二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生/184.073 5 [M＋H－C21H39O3]+特征碎片離子，如圖5所示，推測(cè)其為溶血磷脂酰膽堿類化合物。

圖3 Amide HPL的二級(jí)質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑

圖4 licochalcone A的二級(jí)質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑

圖5 LPC (18∶3) 的二級(jí)質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑

3.6 皂苷類化合物的裂解規(guī)律

三萜皂苷類化合物為甘草的主要成分[11-13]，甘草制半夏和法半夏中甘草三萜皂苷在ESI正離子源轟擊下產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子[M＋H]+。以化合物glycyrrhizic acid為例，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配得到該成分分子式為C42H62O16，其準(zhǔn)分子離子為/823.411 1 [M＋H]+，二級(jí)碎片分別為471.345 7 [M＋H－C12H15O12]+、647.375 1 [M＋H－C6H7O6]+。綜上信息，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，故推測(cè)為皂苷類質(zhì)譜信息，二級(jí)質(zhì)譜和可能的裂解方式見(jiàn)圖6。

4 討論

本研究從5組樣品中鑒定出101個(gè)化學(xué)成分，半夏炮制前后化學(xué)成分存在明顯的差異，半夏在不同物料不同流程炮制的過(guò)程中，化學(xué)成分發(fā)生改變。物料甘草增加了甘草黃酮、三萜皂苷類成分，石灰無(wú)增加。其中，甘草酸為主要的皂苷類成分，其在口服后會(huì)水解為甘草次酸，對(duì)小鼠氨水引咳、二氧化硫引咳模型均有明顯的鎮(zhèn)咳作用[13-14]。此外，黃酮類化合物中甘草苷、異甘草素[15]及芹糖甘草苷[16]均有文獻(xiàn)研究證實(shí)具有祛痰止咳平喘的功效。由此可見(jiàn)，法半夏中含有的2類甘草成分可能是其炮制后長(zhǎng)于祛痰止咳的物質(zhì)基礎(chǔ)。而浸漂對(duì)半夏成分會(huì)有損失，因此在炮制過(guò)程中，應(yīng)減少浸漂時(shí)間，即浸漂至內(nèi)無(wú)干心即可。

圖6 glycyrrhizic acid的二級(jí)質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑

石灰雖然對(duì)成分增加無(wú)影響，但其在解毒方面作用顯著。有研究發(fā)現(xiàn)，石灰水的強(qiáng)堿性可使半夏的草酸鈣針晶結(jié)合蛋白變性，不再具有刺激性作用；石灰水本身可以使半夏中部分針晶發(fā)生絮凝，使少量可能仍有刺激性的針晶混凝在大量淀粉?；蝠ひ杭?xì)胞當(dāng)中，無(wú)法釋放，從而使半夏的刺激性喪失[5]，達(dá)到減毒目的。報(bào)道認(rèn)為，半夏中含有溶血磷脂酰膽堿類物質(zhì)，可引起炎癥反應(yīng)及神經(jīng)元髓鞘脫失和不同程度變性?？赏茰y(cè)其可能與半夏的刺激性毒性相關(guān)[17]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，石灰制半夏和法半夏均無(wú)此成分，由此更確定半夏多物料多流程炮制中，加入石灰主要以解半夏毒為主。因此法半夏炮制石灰甘草共用達(dá)到減毒增效作用。

本研究通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS/MS全面分析半夏化學(xué)成分為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制奠定了一定的基礎(chǔ)。分析不同物料不同流程對(duì)半夏成分的影響，可以為闡明半夏經(jīng)炮制后功效發(fā)生變化的物質(zhì)基礎(chǔ)及其臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of multi-material and multi-process processing on chemical composition ofbased on UPLC-Q-TOF-MS/MS

CUI Mei-na1, ZHONG Ling-yun1, LAN Ze-lun2, ZHANG Da-yong2, YANG Ming1

1. Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 2. Sichuan New Lotus Chinese Herbal Medicine Co., Ltd., Chengdu 611731, China

To analyze the chemical constituents of Banxia ()processed by multi-material and multi-process by ultra-high performance liquid chromatography tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS/MS), and explore the effects of different materials and processes on its constituents. Through comparing the difference of components, to provide reference for elucidating the change rule of chemical components ofbefore and after processing.The varieties ofobtained by different materials and processing procedures were divided into four groups: soaked,made of lime,made ofetand Fabanxia ().was used as a control. The alcohol extracts of five samples were used as the donor solution, Waters Acquity BEH C18column (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) was used, acetonitrile-0.1% formic acid water was used as the mobile phase for binary gradient elution, electrospray ionization source (ESI) was used for mass spectrometry, and the primary and secondary mass spectra information of positive and negative ion full scan was used.The components contained in the five groups of samples were identified by the first order exact mass to charge ratio, the second level fragment data, references or databases, and the law of mass spectrometry fragmentation. A total of 101 chemical constituents were preliminarily characterized, including seven alkaloids, five amino acids, five amides, 14 alcoholamines, 26 flavonoids, six lysophosphatidylcholines, 14 fatty acid glycerolipids, six organic acids, seven saponins, and 11 compounds of other types.UPLC-Q-TOF-MS/MS is used to analyze the chemical constituents of different processed varieties of, and it is found that there are significant differences in the chemical constituents before and after processing of.introduces licoflavone and triterpene saponins for, while lime has little effect on the introduction of components. It is speculated that the addition of lime is to reduce the toxicity ofwithout affecting the pharmacodynamic components. Compared with raw products, the components ofdecreased after soaking, and it was speculated that the components ofmay be lost during soaking., which is processed through multiple materials and multiple processes, reduces the irritating and toxic ingredients and increases the licoflavone. This method is rapid and accurate, providing a new strategy for exploring the multi-process processing mechanism of, which is of great significance for the in-depth study of its pharmacodynamic substances and quality control.

(Thunb.) Breit;; Ultra-high performance liquid chromatography tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry; multi-material multi-process; licoflavone

R284.1；R283.6

A

0253 - 2670(2021)24 - 7428 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.004

2021-04-17

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1707201）

崔美娜，在讀碩士，主要從事中藥炮制工藝及機(jī)理研究。Tel: 13699512559 E-mail: 13699512559@163.com

鐘凌云，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制研究。E-mail: ly1638163@163.com

楊 明，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事炮制制劑研究。E-mail: yangming16@126.com

[責(zé)任編輯 王文倩]