孫 志，周 霖，禹明洋，王振輝，喬高星，薛 鵬，趙紅宇，康 建，張曉堅(jiān)，左莉華*

基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)的6-姜酚在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定及代謝途徑的分析

孫 志1, 2, 3，周 霖1, 2, 3，禹明洋1，王振輝5，喬高星1，薛 鵬4，趙紅宇4，康 建1, 2, 3，張曉堅(jiān)1, 2, 3，左莉華1, 2, 3*

1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450052 2. 河南省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)臨床質(zhì)譜工程研究中心，河南 鄭州 450052 3. 鄭州市臨床質(zhì)譜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052 4. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 口腔急診科，河南 鄭州 450052 5. 河南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南 焦作 454000

采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Quadrupole-Orbitrap high resolution mass spectrometry，UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）技術(shù)對(duì)6-姜酚在大鼠血漿、尿液和糞便中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定分析。SD大鼠ig給藥6-姜酚羧甲基纖維素鈉混懸液后，收集其血漿、尿液、糞便以及膽汁樣品。樣品前處理后，采用Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫。在電噴霧電離源（ESI源）正、負(fù)離子模式下采集生物樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。對(duì)代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定分析，檢測(cè)到大鼠體內(nèi)6-姜酚相關(guān)代謝產(chǎn)物共21個(gè)，其中血漿樣品中5個(gè)代謝產(chǎn)物，尿液樣品中9個(gè)代謝物，糞便樣品中12個(gè)代謝產(chǎn)物，膽汁樣品中8個(gè)代謝產(chǎn)物。通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)闡明了6-姜酚在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物及其代謝途徑，為今后相關(guān)研究提供重要的理論依據(jù)，同時(shí)也為藥物代謝鑒定研究提供一種綜合研究方法。

6-姜酚；UHPLC-Q-Orbitrap HRMS；代謝產(chǎn)物；代謝途徑；血漿；尿液；糞便；膽汁

姜為姜科（Zingiberaceae）植物姜Rosc. 的干燥根莖。株高0.5～1.0 m，根莖肥厚，多分枝，有芳香及辛辣味。根莖供藥用，鮮品或干品可作烹調(diào)配料或制成醬菜、糖姜。莖、葉、根莖均可提取芳香油，用于食品、飲料及化妝品香料中。其中藥性表現(xiàn)為發(fā)散風(fēng)寒、化痰止咳，又能溫中止嘔、解毒等，常常用于外感風(fēng)寒及胃寒嘔逆等癥的治療[1-2]。

姜的化學(xué)成分繁雜，主要?dú)w屬3大類：揮發(fā)油類（萜類化合物）、二苯基庚烷類（1,7-二取代苯基庚烷骨架）和姜辣素類。姜辣素是姜中辣味成分的總稱，其中6-姜酚在姜的辣味成分中含量最高，也是姜的主要活性成分[2-5]。6-姜酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、強(qiáng)心、降壓、調(diào)血脂、降血糖、抗凝等多種生物學(xué)活性。其中6-姜酚在抗腫瘤方面具有良好的應(yīng)用前景[6]，還具有保肝利膽、消炎、鎮(zhèn)咳、防暈止吐、抑制中樞神經(jīng)等多種功效，殺蟲、抗病原微生物和殺菌防腐作用[7-9]。目前，對(duì)于6-姜酚的提取分離方法、分析測(cè)定方法和生物活性研究較為全面，而且藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示，6-姜酚在機(jī)體內(nèi)快速吸收并迅速消除，且這一變化規(guī)律與給藥途徑及給藥劑量沒(méi)有顯著的關(guān)聯(lián)性[10]，但對(duì)6-姜酚的體內(nèi)代謝過(guò)程和代謝產(chǎn)物尚不明確[11-13]，亟需進(jìn)一步研究。本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）建立了一種靈敏度高、準(zhǔn)確性好的鑒定藥物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究方法，對(duì)大鼠血漿、尿液和糞便中6-姜酚的主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定分析，為6-姜酚的進(jìn)一步藥用開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

6-姜酚對(duì)照品（批號(hào)MUST-18090710，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器

UHPLC-Q-Orbitrap液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)：Ultimate 3000超高效液相色譜儀（美國(guó)Dionex公司），Q Exactive型高分辨質(zhì)譜（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；BX7200HP臺(tái)式超聲波清洗器（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；AL104型萬(wàn)分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo上海有限公司）。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠18只，雄性，體質(zhì)量（230±20）g，購(gòu)于鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。合格證號(hào)SCXK（豫）2019-0002。動(dòng)物于恒溫恒濕房飼養(yǎng)，保持12 h光照循環(huán)，期間自由飲水進(jìn)食，提供實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料，所有實(shí)驗(yàn)操作按照河南省鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求進(jìn)行。給藥前禁食12 h，自由飲水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～2.0 min，5% B；2.0～2.5 min，5%～10% B；2.5～20 min，10%～25% B；20～35 min，25%～65% B；35～45 min，65%～100% B；45～50 min，100% B；體積流量0.2 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫40 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件

UHPLC-Q-Exactive液質(zhì)聯(lián)用儀：離子源采用HESI源（heated ESI），輔助氣體積流量為10 μL/min，輔助氣溫度為300 ℃，離子傳輸管溫度320 ℃；正離子模式：鞘氣體積流量40 μL/min，噴霧電壓3.50 kV；負(fù)離子模式：鞘氣體積流量38 μL/min，噴霧電壓2.80 kV。掃描方式采用正、負(fù)離子Full MS/dd-MS2模式，其中包括1次一級(jí)全掃描（分辨率為70 000 FWHM）和1次數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描（分辨率為17 500 FWHM）2個(gè)事件，質(zhì)荷比窗口寬度設(shè)置為2，碰撞能梯度為20、40、60 eV，掃描范圍/80～1200。

2.3 樣品的制備

稱取250 mg 6-姜酚的對(duì)照品，加入25 mL 0.5% CMC-Na，搖勻，制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的混懸液[14-15]，作為給藥樣品。

2.4 給藥及樣品采集

實(shí)驗(yàn)前，將SD大鼠隨機(jī)分為3組（采血組、集尿組、膽汁組），每組6只，再將各組分為空白組（3只）和6-姜酚給藥組（3只），在動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在20 ℃。

受試前1天，將大鼠置于代謝籠中，禁食不禁水12 h。給藥組以10 mg/kg的劑量大鼠ig給予6-姜酚CMC-Na混懸液，空白組大鼠ig等體積0.5% CMC-Na溶液。分別于ig給藥前和給藥后5、10、15、30 min和1、2、4、6、10 h眼眶取血300 μL，置于1.5 mL肝素鈉抗凝EP管中，輕搖3下，4 ℃、3000 r/min離心10 min，取上清液，?20 ℃保存，備用；收集0～24 h 2組大鼠的尿液，濾過(guò)，置于EP管中，?20 ℃保存，備用；收集0～24 h 2組大鼠的糞便，置于EP管中，?20 ℃保存，備用。膽汁組大鼠采用5 mg/kg ip烏拉坦（20%）進(jìn)行麻醉，對(duì)大鼠實(shí)施膽管插管手術(shù)。給藥組大鼠以10 mg/kg的劑量ig給予6-姜酚CMC-Na混懸液，收集0～24 h膽汁樣品，?20 ℃保存，備用。若實(shí)驗(yàn)過(guò)程取血不足，則可在給藥1 h后ig適量生理鹽水[14-15]。

2.5 樣品前處理

精密稱定6-姜酚對(duì)照品適量，置10 mL量瓶，甲醇定容，配制成0.1 mg/mL儲(chǔ)備液。稀釋100倍后，取200 μL置進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣；甲醇、乙腈、水按1∶1∶1各取100 μL，渦旋混合30 s，作為空白溶劑，取200 μL置進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣。

取所有不同采血點(diǎn)血漿各100 μL均勻混合，進(jìn)行甲醇沉淀（1∶3），渦旋3 min，4 ℃、13 000 r/min離心10 min。取上清，濃縮至干；用50%甲醇水80 μL復(fù)溶，渦旋30 s，超聲10 s，4 ℃、13 000 r/min離心5 min，上清液置進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣[16]；取尿液200 μL和200 μL甲醇置EP管，渦旋2 min，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取上清液，濃縮至干；取50%甲醇水80 μL復(fù)溶，渦旋30 s，超聲10 s，4 ℃、13 000 r/min，離心5 min，取上清液置進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣；取膽汁樣品100 μL，甲醇（1∶3）沉淀蛋白，渦旋3 min，4 ℃、13 000 r/min離心10 min。取上清，濃縮至干，用50%甲醇80 μL復(fù)溶，渦旋30 s，超聲10 s，4 ℃、 13 000 r/min離心5 min，上清液置進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣；取糞便樣品，晾干，研磨，精密稱定0.15 g，加入1.5 mL的80%甲醇水，超聲提取20 min，4 ℃、5000 r/min離心10 min，取上清，經(jīng)0.22微孔濾膜濾過(guò)，取200 μL置進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣。

2.6 質(zhì)譜分析

對(duì)處理后的血漿、尿液、糞便樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，扣除空白背景后，依據(jù)質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子和加荷離子等信息推測(cè)并得到一級(jí)質(zhì)譜的精確相對(duì)分子質(zhì)量，經(jīng)Xcalibar 2.0軟件擬合分子式，誤差范圍在1×10?5并與數(shù)據(jù)庫(kù)信息對(duì)比，對(duì)代謝物結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步推測(cè)，再依據(jù)對(duì)照品的ESI-MS2譜和相關(guān)參考文獻(xiàn)[3,13,16]，進(jìn)一步推斷代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果與分析

3.1 6-姜酚對(duì)照品的質(zhì)譜裂解途徑分析

在正離子模式下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中未提取到6-姜酚對(duì)照品（C17H26O4）的離子流色譜圖，僅能提取到C17H24O3的離子流色譜圖，其產(chǎn)生/277.179 32 [M＋H]+的準(zhǔn)分子離子峰（R＝17.87 min）。推測(cè)6-姜酚對(duì)照品在未受到粒子沖撞前已經(jīng)發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化，丟失了1分子H2O，見(jiàn)圖1。M0的R＝17.87 min，/277.179 32，將M0準(zhǔn)確鑒定為6-姜酚原型丟失1分子H2O。在其ESI-MS2譜中，/277經(jīng)碰撞誘導(dǎo)裂解后產(chǎn)生一系列二級(jí)碎片離子/259、189、177、162、145等。其中，/277中性丟失1分子H2O形成的/259，繼續(xù)丟失長(zhǎng)鏈烷基（C5H10）形成/189；/189脫掉1個(gè)甲基形成的/177，繼續(xù)脫甲基形成/163；/145由/162中性丟失1分子H2O而形成。由此，可推測(cè)6-姜酚經(jīng)碰撞誘導(dǎo)裂解易脫水，并且易產(chǎn)生脫烷基的碎片離子峰，尤其易產(chǎn)生丟失甲基的碎片離子峰。這可能與6-姜酚母核中存在烷基長(zhǎng)鏈有關(guān)[16]。

A-一級(jí)譜圖 B-二級(jí)碎片離子圖

3.2 6-姜酚在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的分析鑒定

基于UHPLC-Q-Orbitrap技術(shù)分析給藥后的大鼠血漿、尿液和糞便，通過(guò)對(duì)比給藥前后的生物樣品圖譜，結(jié)合色譜保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量、多級(jí)碎片離子等信息的分析，共鑒定了原型在內(nèi)的22個(gè)代謝產(chǎn)物，其中大鼠血漿中鑒定代謝產(chǎn)物5個(gè)、尿液中鑒定代謝產(chǎn)物9個(gè)、糞便中鑒定代謝產(chǎn)物12個(gè)、膽汁中鑒定代謝產(chǎn)物8個(gè)，具體代謝產(chǎn)物質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。

3.2.1 大鼠血漿中代謝產(chǎn)物的鑒定 大鼠血漿中共鑒定代謝產(chǎn)物5個(gè)，分別為M1～M5。M1的相對(duì)分子質(zhì)量比6-姜酚母核少34，其準(zhǔn)分子離子峰為/261.147 98 [M＋H]+（C16H20O3）。其分子式較6-姜酚母核少1個(gè)C、1個(gè)O和6個(gè)H，對(duì)比M0的裂解規(guī)律，推測(cè)其脫去了苯環(huán)上的甲氧基（CH2O），但實(shí)際相對(duì)分子質(zhì)量又缺少4，推測(cè)同時(shí)又脫去長(zhǎng)鏈上H形成2個(gè)雙建。因此，M1可鑒定為6-姜酚的去甲氧基和雙脫飽和（脫H）代謝產(chǎn)物。

在正離子模式下，檢測(cè)到2個(gè)色譜峰M2（C17H24O3，R＝18.23 min）、M3（C17H24O3，R＝14.86 min）。兩者的實(shí)驗(yàn)相對(duì)分子質(zhì)量均與M0相同，推測(cè)二者同樣由6-姜酚母核中性丟失1分子H2O而得到，且都產(chǎn)生了/259、189、177、163等碎片離子，得到的碎片離子與M0裂解產(chǎn)生的碎片離子基本相同，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述推斷。因此，可將兩者鑒定為6-姜酚的脫水產(chǎn)物。

M4的準(zhǔn)分子離子峰為/281.246 86 [M＋H]+（C18H32O2），其分子式較6-姜酚少2個(gè)O、多1個(gè)C和6個(gè)H。在ESI-MS2譜中，得到了6-姜酚對(duì)照品的/295、249、177碎片離子，而M4在二級(jí)裂解過(guò)程中產(chǎn)生的/263較/249多14，推測(cè)母核發(fā)生甲基化；產(chǎn)生的/263較/295少32，推測(cè)母核發(fā)生硝基還原；產(chǎn)生的/179較/177多2，推測(cè)母核發(fā)生還原（雙建加H）。因此，推測(cè)M4是由6-姜酚母核發(fā)生還原（雙建加H）、硝基還原、甲基化得到的代謝產(chǎn)物。

M5的準(zhǔn)分子離子峰為/289.215 18 [M＋H]+（C19H28O2）。對(duì)比其與M15、M16的實(shí)驗(yàn)相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)譜圖，發(fā)現(xiàn)M5在發(fā)生乙?；拖趸€原反應(yīng)的同時(shí)又脫去1分子H2O。由此，推測(cè)M5是由6-姜酚乙?；⑾趸€原和脫水而得到的代謝產(chǎn)物。

3.2.2 大鼠尿液中代謝產(chǎn)物的鑒定 大鼠尿液中共鑒定代謝產(chǎn)物9個(gè)，分別為M1、M2、M3和M6～M11。代謝產(chǎn)物M6～M11的鑒定結(jié)果如下。

在正離子模式下，M6的準(zhǔn)分子離子峰為/493.203 34 [M＋Na]+（C23H34O10）。其相對(duì)分子質(zhì)量較6-姜酚多176，推測(cè)是6-姜酚葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物。由其二級(jí)裂解產(chǎn)生的/317產(chǎn)物離子（丟失了1分子葡萄糖醛酸），可進(jìn)一步確認(rèn)上述推斷[14]。M7的準(zhǔn)分子離子峰為/463.192 84 [M＋Na]+（C22H32O9）。其相對(duì)分子質(zhì)量較M6少30，并且其二級(jí)裂解產(chǎn)生的碎片離子/287，是由/463脫去1分子葡萄糖醛酸產(chǎn)生的。因此，可將M7鑒定為6-姜酚單去甲氧基和葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。

M8的準(zhǔn)分子離子峰為/259.168 61 [M＋H]+，其分子式為C17H22O2。其相對(duì)分子質(zhì)量比M0少18，推測(cè)其由6-姜酚母核中性丟失2分子H2O形成。因此，可將M8鑒定為6-姜酚的雙脫水產(chǎn)物。

M9的準(zhǔn)分子離子峰為/261.184 48 [M＋H]+（C17H24O2）。M9比6-姜酚母核的相對(duì)分子質(zhì)量同樣少34，對(duì)比其分子式較6-姜酚母核少2個(gè)O和2個(gè)H，并且在其二級(jí)裂解過(guò)程中產(chǎn)生了/229的碎片離子，推測(cè)該碎片離子為/243丟失甲氧基上的甲基（-CH2）形成，進(jìn)而推測(cè)M9未脫去苯環(huán)上的甲氧基，而是脫去2分子H2O，但由于其實(shí)際相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)并未減少36，推測(cè)是6-姜酚母核長(zhǎng)鏈上的羰基還原后以羥基形式脫去。由此，推測(cè)M9是由6-姜酚發(fā)生還原反應(yīng)（還原羰基）、雙脫水反應(yīng)而得到的代謝產(chǎn)物。

M10的準(zhǔn)分子離子峰為/423.248 14 [M＋H]+（C22H34N2O6）。依據(jù)其分子式C22H34N2O6，初步推測(cè)6-姜酚母核發(fā)生了谷氨酰胺結(jié)合，在其ESI-MS2譜中產(chǎn)生的/362由6-姜酚母核脫去基團(tuán)CH9NO2得到，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了M10中含有谷氨酰胺結(jié)構(gòu)。再對(duì)比M10與6-姜酚母核的分子式，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)還缺少1個(gè)O，推測(cè)6-姜酚母核還發(fā)生了單去羥基化反應(yīng)。由此，推測(cè)M10是6-姜酚的谷氨酰胺結(jié)合和單去羥基化產(chǎn)物。

M11的準(zhǔn)分子離子峰為/495.218 72 [M＋Na]+（C23H36O10）。依據(jù)其分子式，初步推測(cè)6-姜酚母核發(fā)生了葡萄糖苷結(jié)合和氧化反應(yīng)。在其二級(jí)裂解的過(guò)程中，M11產(chǎn)生了/319的碎片離子，其由/495脫去C6H8O6大基團(tuán)而得到，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了上述推測(cè)，并且推測(cè)6-姜酚氧化部位在葡萄糖苷部分。由此，推測(cè)M11是6-姜酚的葡萄糖苷結(jié)合和氧化反應(yīng)產(chǎn)物。

表1 大鼠血漿、尿液和糞便中6-姜酚的代謝產(chǎn)物質(zhì)譜信息

“+”代表樣品中檢測(cè)到，“?”代表樣品中未檢測(cè)到

"+" means detected in the sample, and "?" means not detected in the sample

3.2.3 大鼠糞便中代謝產(chǎn)物的鑒定 大鼠糞便中共鑒定代謝產(chǎn)物12個(gè)，分別為M1、M4、M5、M9、M11和M12～M18。代謝產(chǎn)物M12～M18的鑒定結(jié)果如下。

在正離子模式下，M12的準(zhǔn)分子離子峰為/297.241 73 [M＋H]+（C18H32O3）。在其二級(jí)裂解過(guò)程中，得到/279、261碎片離子，與M4的碎片離子/281、263對(duì)比推測(cè)出M12在6-姜酚母核的結(jié)構(gòu)上同樣發(fā)生了硝基還原和甲基化反應(yīng)，但未發(fā)生還原反應(yīng)（雙建加H）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)相對(duì)分子質(zhì)量計(jì)算，在進(jìn)行上述反應(yīng)后得實(shí)驗(yàn)相對(duì)分子質(zhì)量仍較6-姜酚母核多18，推測(cè)M12又發(fā)生了水合反應(yīng)，在M12的二級(jí)裂解過(guò)程中/279 由/297脫去1分子H2O得到，進(jìn)一步證明了上述推測(cè)。由此，推測(cè)M12是6-姜酚的甲基化、硝基還原、水合作用的代謝產(chǎn)物。

M13的準(zhǔn)分子離子峰為/289.179 17 [M＋H]+（C18H24O3）。其分子式較6-姜酚母核多1個(gè)C，少1個(gè)O和2個(gè)H。推測(cè)6-姜酚在大鼠體內(nèi)發(fā)生了甲基化反應(yīng)和脫水反應(yīng)，在M13的ESI-MS2譜中，/289較6-姜酚甲基化產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)相對(duì)分子質(zhì)量少20，再推測(cè)6-姜酚在大鼠體內(nèi)發(fā)生甲基化和脫水反應(yīng)，并且脫去2個(gè)H形成1個(gè)雙鍵。由此，推測(cè)M13為6-姜酚的甲基化、脫水、脫飽和產(chǎn)物。

M14的準(zhǔn)分子離子峰為/329.171 54 [M＋Na]+（C18H26O4）。M14的實(shí)驗(yàn)相對(duì)分子質(zhì)量較6-姜酚母核多12，分子式較6-姜酚多1個(gè)甲基，推測(cè)M14是由6-姜酚母核甲基化和脫飽和（脫去2個(gè)H）而得到的產(chǎn)物。

M15的準(zhǔn)分子離子峰為/329.210 33 [M＋Na]+（C19H30O3）。其分子式較6姜酚母核多2個(gè)C、少1個(gè)O，并依據(jù)其一級(jí)譜圖、二級(jí)譜圖初步推測(cè)M15是由6-姜酚母核發(fā)生乙?；拖趸€原得到的代謝產(chǎn)物，在其ESI-MS2譜中，/285可能為M15脫落乙酰基得到的離子碎片，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述推測(cè)。由此，推測(cè)M15是6-姜酚乙?；拖趸€原而得到的代謝產(chǎn)物。同理，M16的準(zhǔn)分子離子峰為/331.225 77 [M＋Na]+（C19H32O3）。M16的實(shí)驗(yàn)相對(duì)分子質(zhì)量?jī)H比M15多2，并結(jié)合其分子式以及一級(jí)譜圖和二級(jí)譜圖推測(cè)M16是由6-姜酚發(fā)生乙?；?、硝基還原和還原反應(yīng)而得到代謝產(chǎn)物。M17的準(zhǔn)分子離子峰為/411.249 66 [M＋H]+（C21H34N2O6）。依據(jù)其分子式C21H34N2O6，初步推測(cè)6-姜酚母核發(fā)生了谷氨酰胺結(jié)合，在其ESI-MS2譜中產(chǎn)生的/352由6-姜酚母核脫去基團(tuán)CH9NO2得到，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了M17中含有谷氨酰胺結(jié)構(gòu)。再對(duì)比M17與6-姜酚母核的分子式，發(fā)現(xiàn)還缺少1個(gè)C和1個(gè)O，推測(cè)6-姜酚母核還發(fā)生了去甲基和還原反應(yīng)（還原羰基）。由此，推測(cè)M17是6-姜酚發(fā)生谷氨酰胺結(jié)合、去甲基化反應(yīng)和還原反應(yīng)得來(lái)的代謝產(chǎn)物。M18的準(zhǔn)分子離子峰為/356.260 99 [M＋H]+（C20H37NO2S）。依據(jù)其分子式C20H37NO2S，初步推測(cè)6-姜酚母核發(fā)生了半胱氨酸結(jié)合，在其二級(jí)裂解過(guò)程中得到了/121離子碎片，從而驗(yàn)證了上述推測(cè)；得到了/339離子碎片，/339由/356脫去1分子NH3得到的，進(jìn)一步說(shuō)明了半胱氨酸羧基端與6-姜酚結(jié)合，并且進(jìn)一步對(duì)比M18與6-姜酚的分子式發(fā)現(xiàn)，M18較6-姜酚母核缺少3個(gè)O，推測(cè)其又進(jìn)行了硝基還原和還原反應(yīng)（還原羰基）。由此，推測(cè)M18是6-姜酚在大鼠體內(nèi)發(fā)生半胱氨酸結(jié)合、硝基還原和還原反應(yīng)（羰基還原）的代謝產(chǎn)物。

3.2.4 大鼠膽汁中代謝產(chǎn)物的鑒定 大鼠膽汁中共鑒定代謝產(chǎn)物8個(gè)，分別為M3、M6、M8、M11、M14和M19～M21。代謝產(chǎn)物M19～M21的鑒定結(jié)果如下。

在正離子模式下，M19的準(zhǔn)分子離子峰為/299.127 44 [M＋Na]+（C16H20O4）。其分子式較6-姜酚母核少1個(gè)C，6個(gè)H，初步推測(cè)6-姜酚母核脫去了亞甲基基團(tuán)（CH2），但其分子式又缺少4個(gè)H，進(jìn)一步推測(cè)6-姜酚母核又發(fā)生了2次脫飽和反應(yīng)（脫H）。因此，可將M19鑒定為6-姜酚母核發(fā)生去甲基化反應(yīng)和雙脫和反應(yīng)（脫H）而得到的代謝產(chǎn)物。

M20的準(zhǔn)分子離子峰為/365.192 47 [M＋Na]+（C18H30O6）。其分子式較6-姜酚母核多1個(gè)C、2個(gè)O、4個(gè)H。對(duì)比其與6-姜酚母核的二級(jí)裂解碎片，推測(cè)M20由6-姜酚母核脫去甲基基團(tuán)（CH2）并進(jìn)行2次氧化反應(yīng)而得到。M21的準(zhǔn)分子離子峰為/365.192 47 [M＋Na]+（C19H30O5）。在M21的ESI-MS2譜中，得到了/285碎片離子，推測(cè)由/327脫去乙?；鶊F(tuán)而得到，初步推測(cè)6-姜酚母核發(fā)生了乙?；Y(jié)合反應(yīng)。但M21的分子式又較6-姜酚母核多2個(gè)H，因此可將M21鑒定為6-姜酚的乙酰基結(jié)合反應(yīng)和還原反應(yīng)的代謝產(chǎn)物。

3.3 5-姜酚在大鼠體內(nèi)的代謝位置及途徑分析

從大鼠的血漿、尿液、糞便和膽汁中共鑒定了6-姜酚原型在內(nèi)的22個(gè)代謝產(chǎn)物，其主要的體內(nèi)代謝反應(yīng)有脫水、去甲氧基、去甲基化、乙?；⑾趸€原、葡萄糖醛酸化以及它們的復(fù)合反應(yīng)等。其中少數(shù)代謝產(chǎn)物發(fā)生了谷氨酰胺結(jié)合、半胱氨酸結(jié)合等結(jié)合反應(yīng)。6-姜酚較容易較易發(fā)生去甲氧基、去甲基化、乙?；拖趸€原等反應(yīng)。其主要代謝途徑見(jiàn)圖2。

圖2 6-姜酚在大鼠體內(nèi)的主要代謝途徑

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對(duì)6-姜酚在正常SD大鼠血漿、尿液、糞便和膽汁中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定分析。結(jié)果表明，6-姜酚在大鼠體內(nèi)的主要代謝反應(yīng)有脫水、去甲氧基、乙?；⑾趸€原、葡萄糖醛酸化、去羥基化以及相關(guān)的復(fù)合反應(yīng)等。通過(guò)分析這些代謝產(chǎn)物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜裂解規(guī)律以及特征碎片離子等，篩選鑒定了包括6-姜酚原型在內(nèi)的22個(gè)代謝產(chǎn)物，探討了6-姜酚的在大鼠體內(nèi)的代謝途徑和裂解規(guī)律，為進(jìn)一步研究6-姜酚的代謝產(chǎn)物及作用機(jī)制提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Metabolites and metabolic pathway analysis of 6-gingerol in rats based on UHPLC-Q-Orbitrap HRMS

SUN Zhi1, 2, 3, ZHOU Lin1, 2, 3, YU Ming-yang1, WANG Zhen-hui5, QIAO Gao-xing1, XUE Peng4, ZHAO Hong-yu4, KANG Jian1, 2, 3, ZHANG Xiao-jian1, 2, 3,ZUO Li-hua1, 2, 3

1. Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China 2. Henan Engineering Research Center of Clinical Mass Spectrometry for Precision Medicine, Zhengzhou 450052, China 3.Zhengzhou Key Laboratory of Clinical Mass Spectrometry, Zhengzhou 450052, China 4. Oral Emergency Department, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China 5. College of Medicine, Henan Polytechnic University, Jiaozuo 454000, China

To identify the metabolites of 6-gingerol in plasma, urine, feces and bile in rats by using UHPLC-Q-Orbitrap HRMS method.The plasma, urine, fecal and bile samples were collected and processed after ig administration of 6-gingerol CMC-Na suspension. A Waters ACQUITY UPLC BEH C18column (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) was applied and 0.1% formic acid (A)-acetonitrile (B) solution were as the mobile phase for gradient elution. The mass spectrometry data of biological samples was acquired under the both positive and negative electrospray ion mode.A total of 21 metabolites of 6-gingerol were identified in rats by analyzing the mass spectrometry data, including five metabolites in plasma, nine metabolites in urine, 12 metabolites products in feces, eight metabolites in bile samples.The study expounded metabolites and metabolic pathways of 6-gingerol in rats based on UHPLC-Q-Orbitrap HRMS method and provided an important basic for future studies. In addition, this paper could offer a comprehensive research method for drug metabolism identification.

6-gingerol; UHPLC-Q-Orbitrap HRMS; metabolites; metabolic pathway; plasma; urine; feces; bile

R284.1

A

0253 - 2670(2021)24 - 7420 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.003

2021-05-16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81703666）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目基礎(chǔ)研究計(jì)劃（18A310036，19A360008，19A320070）

孫 志，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幬锎x。Tel: (0371)66862570 E-mail: sunzhi2013@163.com

左莉華，博士，副主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。Tel: (0371)66862570 E-mail: zuolihua2013@126.com

[責(zé)任編輯 王文倩]