段 軍，周萍萍，張立倩，馬 琳，喻 文，朱美琦，莊敏艷，楊鳳磊，曹昌盛，張 鵬，史延慧

（1.江蘇師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,2.生命科學(xué)學(xué)院,徐州221116）

鉑（Pt）金屬類抗癌藥物是主要的化療藥物之一，廣泛應(yīng)用于50%以上的各類癌癥的治療，對睪丸癌、膀胱癌及卵巢癌等有良好的治療效果［1］.但這類抗癌藥物也存在一些局限性，如水溶性差、有多種毒副作用以及抗癌譜狹窄等［2~4］.為了解決鉑類抗癌藥物所存在的問題，在過去的幾十年中，研究人員不斷努力開發(fā)不同結(jié)構(gòu)和不同類型的過渡金屬抗癌化合物，其中釕（Ru）基金屬抗癌化合物是最有前途的抗癌化合物之一［5~7］.比較有代表性的是Ru（Ⅲ）基金屬抗癌化合物NAMI-A［8］，在1999年進(jìn)入臨床I期實驗，2003年進(jìn)入臨床II期實驗.與鉑類抗癌化合物相比，釕金屬抗癌化合物具有良好的抗癌活性、低的健康組織毒性及抗轉(zhuǎn)移特性，極有潛力成為鉑類化合物抗癌藥物的替代物［8~10］.研究發(fā)現(xiàn)，釕基化合物主要起抗癌作用的是二價Ru，這可能是由于腫瘤組織為還原環(huán)境，可使三價Ru還原成二價［11］.由于腫瘤組織通透性增加，導(dǎo)致癌細(xì)胞更容易攝入大分子，且癌組織受損的淋巴通道致使大分子化合物不容易排出，滯留在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，這就是大分子的EPR效應(yīng)（Enhanced permeability and retention effect），因此大分子的藥物具有潛在的應(yīng)用價值［12，13］.

通過配位驅(qū)動的自組裝策略可以將Ru（II）接受體與特定角度的配體組裝，從而構(gòu)建不同構(gòu)型的環(huán)狀或籠狀超分子化合物［14，15］.金屬大環(huán)化合物在分子識別［16~18］、分離材料［19~21］、催化反應(yīng)［22~24］、主客體化學(xué)［25~27］和生物學(xué)［28~30］等領(lǐng)域備受關(guān)注.前文［31］報道了以［Ru2（donq）（η6-p-cymene）2］（O3SCF3）2（donq=5，8-dioxido-1，4-naphtoquinonato）與1，4-雙咪唑基苯和1，3-雙咪唑基苯組裝得到的四核矩形金屬大環(huán)，與1，3，5-三咪唑基苯組裝得到的六核三棱柱金屬籠子，并對其體外抗癌活性進(jìn)行了評估，這些組裝體均表現(xiàn)出較好的抗癌活性.此外，較大結(jié)構(gòu)的籠狀化合物比較小的矩形表現(xiàn)出更高的活性.鑒于這些組裝體分子表現(xiàn)出類大分子的EPR效應(yīng)，為了增加組裝體的分子量和改善組裝體的溶解度，本文合成了帶有不同長度烷氧基的1，3-雙咪唑苯基配體（1~3）及相應(yīng)的組裝體.配體通過配位自組裝的方式與半三明治釕（Ⅱ）（Ru1~Ru3）組裝得到了組裝體4~12，測定了這些組裝體對人癌細(xì)胞系的體外抗癌活性，并對抗癌機(jī)理進(jìn)行了探究.以斑馬魚卵以及斑馬魚的體內(nèi)腫瘤為生物模型，初步探究了組裝體的生物毒性和體內(nèi)抗腫瘤活性.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氯化鈉、碳酸鉀、無水硫酸鈉、三乙胺、甲醇、乙醚、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯和二甲基甲酰胺，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3，5-二溴苯酚、碘甲烷、咪唑、對甲基苯磺酰氯、二乙二醇甲醚、二縮三乙二醇、草酸銨、三氟甲磺酸銀、乙酸鈉和二氯雙（4-甲基異丙基苯基）釕（Ⅱ），上海安耐吉化學(xué)試劑公司；1，4-二羥基苯醌和5，8-二羥基-1，4-萘醌，日本東京化成工業(yè)株式會社；小牛胸腺DNA（CT-DNA）和溴化乙錠，北京百靈威科技有限公司；胰蛋白酶和胎牛血清，上海玉博生物科技有限公司；A549（人肺癌細(xì)胞）、MDA-MB-231（人乳腺癌細(xì)胞）、HepG-2（人肝癌細(xì)胞）和MCF-7（人乳腺癌細(xì)胞），賽百康（上海）生物技術(shù)股份有限公司；HBE（人支氣管上皮細(xì)胞）和THLE-2（人肝細(xì)胞），武漢普諾賽生命科技有限公司；野生AB型斑馬魚，南京-樹梨花生物科技有限公司；所用試劑均為分析純.

AVANCEⅢ400 MHz型核磁共振波譜儀（NMR）和MicroToF-QⅡ型電Ⅱ噴霧飛行時間質(zhì)譜儀，德國布魯克公司；vario MACRO cube CHNS型微量元素分析儀，德國元素分析系統(tǒng)公司；F-4600型熒光分光光度計，日本日立公司；OPTIMA 3300DV型ICP電感耦合等離子體光譜儀（ICP-MS）和LAMBDA 365型紫外-可見分光光度計（UV-Vis），美國鉑金埃爾默有限公司；Synergy H4 Hybrid Re型酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；BM-37XCC型倒置生物顯微鏡，上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司.

1.2 組裝體的合成

1.2.1 組裝體4~12合成的通用方法參照文獻(xiàn)［32~34］方法制備半三明治釕（Ⅱ）（Ru1~Ru3）和配體1~3.將配體1~3分別與相應(yīng)的半三明治釕（Ⅱ）Ru1~Ru3以摩爾比1∶1加入到8 mL催化瓶中；再加入6 mL甲醇/二氯甲烷（體積比為1∶1混合溶液），室溫下反應(yīng)24 h后，將溶劑濃縮至0.5 mL以下，加入6 mL乙醚后析出沉淀，離心得到固體樣品，將固體真空減壓干燥，得到組裝體4~12（Scheme 1）.

Scheme 1 Synthetic routes for assemblies of 4—12

1.2.2 組裝體4的合成及表征Ru1（4 μmol，3.4269 mg）與配體1（4 μmol，0.9610 mg）反應(yīng)得到組裝體4，黃色固體粉末，產(chǎn)率為81%.1H NMR（400 MHz，CD3OD），δ：8.34（s，2H），7.75（s，2H），7.05~6.97（m，6H），6.60（s，8H），5.96（d，J=6.2 Hz，8H），5.80（d，J=6.2 Hz，8H），3.94（s，6H），2.82（p，J=6.9 Hz，4H），2.23（s，12H），1.34（d，J=6.9 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3OD），δ：172.4，163.3，139.1，138.6，130.6，121.2，106.3，104.2，102.7，99.3，83.7，81.8，56.8，32.4，22.5，18.2；元素分析實驗值（%，C74H80O22N8S4F12Ru4理論值）：C 40.51（40.65），H 3.68（3.45），N 5.11（5.06）.

1.2.3組裝體5的合成及表征Ru1（4 μmol，3.4269 mg）與配體2（4 μmol，1.3134 mg）反應(yīng)得到組裝體5，黃色固體粉末，產(chǎn)率為75%.1H NMR（400 MHz，CD3OD），δ：8.33（t，J=1.4 Hz，4H），7.75（t，J=1.6 Hz，4H），7.01（s，6H），6.59（t，J=1.4 Hz，4H），5.96（d，J=6.1 Hz，8H），5.80（d，J=6.1 Hz，8H），4.27~4.24（m，4H），3.95~3.88（m，4H），3.76~3.71（m，4H），3.63~3.57（m，4H），2.82（p，J=6.9 Hz，4H），2.23（s，12H），1.34（d，J=6.9 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3OD），δ：172.4，162.7，139.2，138.6，130.7，121.3，107.1，104.4，102.6，99.4，83.8，81.8，73.0，71.6，70.7，69.9，59.1，32.5，22.8，18.2.元素分析實驗值（%，C78H96O26N8S4F12Ru4理論值）：C 40.34（41.57），H 4.17（3.78），N 4.83（4.71）.

1.2.4 組裝體6的合成及表征Ru1（4 μmol，3.4269 mg）與配體3（4 μmol，1.4897 mg）反應(yīng)得到組裝體6，黃色固體粉末，產(chǎn)率為70%.1H NMR（400 MHz，CD3OD），δ：8.34（s，4H），7.75（s，4H），7.02（s，6H），6.59（s，4H），5.96（d，J=6.3 Hz，8H），5.80（d，J=6.3 Hz，8H），4.31~4.23（m，4H），3.95~3.90（m，4H），3.77~3.75（m，4H），3.71~3.69（m，4H），3.67~3.65（m，0H），3.34（s，6H），2.85~2.79（m，4H），2.23（s，12H），1.34（d，J=7.0 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3OD），δ：172.4，162.7，139.1，138.5，130.6，121.2，107.2，104.3，102.6，99.3，83.8，81.7，72.9，71.7，71.5，71.3，70.6，69.9，59.1，32.4，22.6，18.2；ESI-MS實驗值（［M?2OTf］2+理論值），m/z：1081.14398（1081.13924）；元素分析實驗值（%，C86H104O28N8S4F12Ru4理論值）：C 42.02（39.85），H 4.26（3.72），N 4.56（4.41）.

1.2.5 組裝體7的合成及表征Ru2（4 μmol，3.6271 mg）與配體1（4 μmol，0.9610 mg）反應(yīng)得到組裝體7，紅色固體粉末，產(chǎn)率為76%.1H NMR（400 MHz，CD3CN），δ：8.06（d，J=2.1 Hz，4H），7.53（d，J=1.7 Hz，4H），7.03（t，J=1.9 Hz，2H），6.80（d，J=1.8 Hz，4H），6.76（s，4H），5.91（d，J=6.0 Hz，8H），5.76（s，4H），5.73（d，J=6.0 Hz，8H），3.84（s，6H），2.80（p，J=6.9 Hz，4H），2.18（s，12H），1.29（d，J=6.9 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3CN），δ：184.0，161.4，138.2，137.4，130.1，120.1，106.4，105.2，102.5，101.4，99.1，83.6，80.9，56.2，31.1，21.5，17.5；元素分析實驗值（%，C82H96O22N8S4F12Ru4理論值）：C 42.71（40.77），H 4.20（3.34），N 4.86（4.68）.

1.2.6 組裝體8的合成及表征Ru2（4 μmol，3.6271 mg）與配體2（4 μmol，1.3134 mg）反應(yīng)得到組裝體8，紅色固體粉末，產(chǎn)率為70%.1H NMR（400 MHz，CD3CN），δ：7.94（d，J=1.9 Hz，4H），7.58~7.53（m，4H），7.10（d，J=2.0 Hz，2H），6.76（d，J=1.6 Hz，4H），6.54（d，J=1.8 Hz，4H），5.92（d，J=6.1 Hz，8H），5.82（s，4H），5.74（d，J=6.1 Hz，8H），4.03~3.98（m，4H），3.90（dd，J=5.5，2.6 Hz，4H），3.80~3.74（m，4H），3.59~3.53（m，4H），3.24（s，6H），2.83~2.74（m，4H），2.19（s，12H），1.27（d，J=6.9 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3CN），δ：183.9，160.0，138.2，137.2，130.1，120.3，107.2，106.0，102.1，101.4，99.2，83.8，80.7，71.7，70.4，69.1，68.6，58.0，31.2，21.5，17.6；元素分析實驗值（%，C90H112O26N8S4F12Ru4理論值）：C，43.54（43.03），H 4.55（3.90），N 4.51（4.80）.

1.2.7 組裝體9的合成及表征Ru2（4 μmol，3.6271 mg）與配體3（4 μmol，1.4897 mg）反應(yīng)得到組裝體9，紅色固體粉末，產(chǎn)率為55%.1H NMR（400 MHz，CD3CN），δ：7.94~7.89（m，4H），7.56（s，4H），7.11（d，J=1.9 Hz，2H），6.74（d，J=1.4 Hz，4H），6.47（d，J=1.8 Hz，8H），5.93（d，J=6.1 Hz，8H），5.84（s，4H），5.74（d，J=6.1 Hz，4H），4.04~3.95（m，4H），3.93~3.91（m，4H），3.85~3.79（m，4H），3.71~3.63（m，4H），3.55~3.48（m，4H），3.38~3.31（m，4H），3.03（s，4H），2.78（p，J=6.9 Hz，4H），2.21（s，12H），1.27（d，J=6.9 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3CN），δ：183.9，159.9，138.4，137.2，130.0，122.8，120.4，119.6，107.3，106.3，101.9，101.4，99.4，84.1，80.7，71.3，70.2，70.1，57.8，31.2，21.6，17.6；ESI-MS實驗值（［M?2OTf］2+理論值），m/z：1131.15576（1131.15489）；元素分析實驗值（%，C94H120O28N8S4F12Ru4理論值）：C 43.92（43.05），H 4.71（3.95），N 4.36（4.41）.

1.2.8 組裝體10的合成及表征Ru3（4 μmol，3.8274 mg）與配體1（4 μmol，0.9610 mg）反應(yīng)得到組裝體10，墨綠色固體粉末，產(chǎn)率為67%.1H NMR（400 MHz，CD3OD），δ：8.42（s，2H），7.52（s，4H），7.19（s，8H），7.15（d，J=3.4 Hz，4H），6.85（s，4H），5.85（d，J=5.9 Hz，8H），5.63（d，J=5.9 Hz，8H），3.85（s，6H），2.82（p，J=6.8 Hz，4H），2.12（s，12H），1.31（d，J=6.9 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3OD），δ：170.9，137.8，137.1，129.1，119.7，111.5，106.1，102.6，100.0，99.7，84.9，84.7，81.4，55.5，30.7，21.1，16.2，14.0；元素分析實驗值（%，C90H100O22N8S4F12Ru4理論值）：C 44.92（45.93），H 4.19（3.71），N 4.66（4.35）.

1.2.9 組裝體11的合成及表征Ru3（4 μmol，3.8274 mg）與配體2（4 μmol，1.3134 mg）反應(yīng)得到組裝體11，墨綠色固體粉末，產(chǎn)率為61%.1H NMR（400 MHz，CD3OD），δ：8.24（s，4H），7.54（d，J=1.6 Hz，4H），7.19（s，8H），7.14（s，4H），6.90（s，4H），6.49（d，J=1.8 Hz，4H），5.84（d，J=6.1 Hz，8H），5.61（d，J=6.1 Hz，8H），3.97（d，J=5.4 Hz，4H），3.93（d，J=4.9 Hz，4H），3.81~3.77（m，4H），3.60~3.56（m，4H），3.27（s，6H），2.87~2.71（m，4H），2.13（s，12H），1.29（d，J=6.9 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3OD），δ：170.8，160.3，137.9，137.5，137.2，129.8，120.0，111.4，107.1，102.5，99.9，84.6，81.4，71.7，71.5，70.2，69.0，68.4，57.7，30.7，21.1，16.2；元素分析實驗值（%，C98H116O26N8S4F12Ru4理論值）：C 45.58（45.04），H 4.53（3.87），N 4.34（4.48）.

1.2.10 組裝體12的合成及表征Ru3（4 μmol，3.8274 mg）與配體3（4 μmol，1.4897 mg）反應(yīng)得到組裝體12，墨綠色固體粉末，產(chǎn)率為55%.1H NMR（400 MHz，CD3OD），δ：8.19（s，4H），7.54（s，4H），7.21（s，8H），6.89（s，4H），6.36（s，4H），5.86（d，J=6.0 Hz，8H），5.63（d，J=6.0 Hz，8H），3.95（d，J=3.4 Hz，4H），3.86（q，J=4.6 Hz，4H），3.70（t，J=4.5 Hz，4H），3.63（dd，J=5.6，3.3 Hz，4H），3.57（q，J=4.5 Hz，4H），3.40（dd，J=5.7，3.3 Hz，4H），3.08（d，J=0.9 Hz，4H），2.81（p，J=7.0 Hz，4H），2.15（s，12H），1.30（d，J=6.8 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3OD），δ：170.8，160.0，138.2，137.5，137.3，129.9，122.0，120.1，118.8，111.5，107.2，102.4，100.1，84.8，81.3，71.3，70.5，70.2，69.9，68.4，57.5，30.7，21.1，16.2；ESI-MS實驗值（［M?2OTf］2+理論值），m/z：1181.16891（1181.67445）；元素分析實驗值（%，C106H124O28N8S4F12Ru4理論值）：C 46.82（44.06），H 4.60（3.82），N 4.12（4.25）.

1.3 組裝體晶體的生長

將5 mg組裝體4溶于1 mL甲醇溶液中，過濾，用移液槍將溶液轉(zhuǎn)移到核磁管中，緩慢地加入1 mL乙醚，用封口膜將核磁管密封，然后放到穩(wěn)定的環(huán)境中待晶體的生長，5 d后核磁管內(nèi)壁上出現(xiàn)黃色晶體4.

1.4 組裝體的紫外?可見吸收光譜測定

在室溫下，分別將配體1~3，半三明治釕（Ⅱ）Ru1~Ru3及組裝體4~12溶解在甲醇中（溶液的濃度為1×10?5mol/L），采用紫外-可見分光光度計測其吸收光譜.

1.5 組裝體的脂水分配系數(shù)測定

采用“搖瓶法”測定組裝體的脂水分配系數(shù).將組裝體以不同的濃度溶解在超純水中，通過紫外-可見光譜測其吸光度，然后根據(jù)濃度和吸光度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.將組裝體分別溶于水相、有機(jī)相（正辛醇）中，在振蕩器上振蕩24 h，然后離心測定水相的吸光度.通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對比計算出組裝體在水相濃度（cw，mol/L），然后計算組裝體在有機(jī)相濃度（co，mol/L），將實驗重復(fù)3次取平均值，組裝體的脂水分配系數(shù)（Po/w）根據(jù)公式lgPo/w=lg（co/cw）計算.

1.6 細(xì)胞毒性測試

利用噻唑藍(lán)（MTT）比色法，對A549，MDA-MB-231，HepG-2，MCF-7，HBE和THLE-2細(xì)胞進(jìn)行體外抑制活性測試.將組裝體4~12、半三明治釕（Ⅱ）Ru1~Ru3、配體1~3，及商品化的順鉑和阿霉素（作為陽性對照組）以2倍梯度濃度加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，樣品的濃度范圍為0.10~100.00 μmol/L.將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入MTT溶液培養(yǎng)4 h，然后用DMSO溶解細(xì)胞代謝產(chǎn)物，通過酶標(biāo)儀測試溶液的吸光度，通過吸光度值可以計算出各化合物的半抑制濃度（IC50，μmol/L）和半數(shù)毒性濃度（TC50，μmol/L）值.

1.7 金屬Ru的細(xì)胞攝取測定

將密度為1×106cell/mL的A549和HBE細(xì)胞分別接種到培養(yǎng)皿中，將組裝體10~12分別加入到培養(yǎng)皿中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.培養(yǎng)結(jié)束后的細(xì)胞用PBS緩沖溶液洗滌3次，添加胰蛋白酶到培養(yǎng)皿中消化細(xì)胞，對消化過后的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù).離心后棄去上層清液，在下層細(xì)胞中加入體積分?jǐn)?shù)為60%的硝酸，硝化24 h.硝化結(jié)束后用超純水稀釋樣品，使樣品中硝酸的濃度低于5%.最后，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜測定細(xì)胞中釕離子的含量.

1.8 紫外?可見光譜測定CT?DNA與組裝體的結(jié)合實驗

制備濃度為5 mmol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽-酸鹽（Tris-HCl）緩沖液（pH≈7.2）.將組裝體溶解于DMSO中，然后用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至5×10?5mol/L.將CT-DNA溶解于緩沖溶液中，測定UV-Vis光譜，確定其在260 nm處的吸光度，通過公式計算CT-DNA的濃度，然后以2倍梯度稀釋到0~0.1 mmol/L.將不同濃度的CT-DNA溶液（0，0.0125，0.025，0.05或0.1 mmol/L）加入到濃度為5×10?5mol/L的組裝體溶液中，用紫外-可見分光光度計測其吸光度，以緩沖溶液為空白對照.結(jié)合常數(shù)（Kb）根據(jù)Benesi-Hildebrand公式A0/（A-A0）=?f/（?b-?f）+?f/Kb（?b-?f）［DNA］（其中，A0為沒有加入CT-DNA時的吸光度；A為加入CT-DNA后的吸光度）計算.

1.9 組裝體與插入溴化乙錠的CT?DNA作用的實驗

首先，配制濃度為5 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.2.配制組裝體濃度為5 mmol/L的甲醇溶液，用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至0~6 μmol/L，備用.用Tris-HCl緩沖溶液配制濃度為40 μmol/L的溴化乙錠濃度為50 μmol/L的CT-DNA溶液［根據(jù)公式A=6600 L·mol?1·cm?1×c×1 cm確定CT-DNA濃度，其中，c（μmol/L）為CT-DNA的濃度；A為CT-DNA的吸光度，A≈0.33時濃度為50 μmol/L］；將4 mL該混合溶液加入到比色皿中，加入不同濃度的組裝體溶液，在熒光分光光度計中記錄熒光強(qiáng)度.根據(jù)測得的熒光強(qiáng)度與組裝體濃度的關(guān)系計算出溴化乙錠和CT-DNA的混合溶液的猝滅關(guān)系，根據(jù)Stern-volmer方程式I0/I=1+Ksv［Complex］計算出猝滅常數(shù)（Ksv），再根據(jù)公式Kapp×［Complex］=KEtBr×［EtBr］（KEtBr=1.0×107）求出組裝體的插入常數(shù)，以上數(shù)據(jù)處理均采用Origin軟件.

1.10 組裝體對斑馬魚的急性毒性實驗

將野生AB型斑馬魚的受精卵按照每個孔板1枚卵的方式置于96孔板中，將組裝體濃度為0，6，12，24和48 μmol/L的DMSO溶液及48 μmol/L順鉑的DMSO溶液分別加入到上述帶有魚卵的孔板中，用顯微鏡觀察斑馬魚卵并分別記錄0，24，48和72 h時斑馬魚生長情況并進(jìn)行統(tǒng)計，每次觀察后再將96孔板放回溫度為28.5℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng).

1.11 組裝體對斑馬魚體內(nèi)腫瘤的抑制實驗

將野生AB型斑馬魚卵放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待斑馬魚卵孵化.向復(fù)蘇并傳代后的A549癌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入DiI（細(xì)胞膜紅色熒光探針），放入培養(yǎng)箱中染色30 min，備用.向斑馬魚的培養(yǎng)液中加入3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽，對斑馬魚進(jìn)行麻醉.將麻醉后的斑馬魚平鋪在瓊脂板上，使用微型注射器將熒光染色后的A549細(xì)胞注入斑馬魚體內(nèi)，每條魚注射量控制在0.2 nL，將處理過的斑馬魚放回培養(yǎng)液中并加入黑色素抑制劑.培養(yǎng)24 h后按照上述方法再進(jìn)行一次組裝體的注射并補(bǔ)加入一些培養(yǎng)液.將斑馬魚置于熒光顯微鏡下拍照并記錄0，24，48及72 h時的變化情況.用Image J軟件對照片的相對熒光強(qiáng)度進(jìn)行計算.

2 結(jié)果與討論

2.1 組裝體的合成與結(jié)構(gòu)表征

配體1~3的合成步驟見本文支持信息，圖S1~圖S3（見本文支持信息）給出分離提純的配體1~3的1H NMR數(shù)據(jù).通過1H NMR，13C NMR，ESI-MS和元素分析表征了組裝體4~12（Scheme 1），其1H NMR數(shù)據(jù)見本文支持信息圖S4~圖S12.

通過溶劑擴(kuò)散法得到組裝體4的單晶.圖1為其晶體結(jié)構(gòu)的熱橢球圖（ORTEP），表1列出了其晶體學(xué)數(shù)據(jù).由圖1可以看出，組裝體4是具有矩形結(jié)構(gòu)的金屬大環(huán)，晶體的最小不對稱單元見圖1（A），圖1（B）為組裝體4的完整結(jié)構(gòu)單元（對稱軸為1-x，y，1.5-z）.Ru（1）—Ru（2）之間的距離分別為0.5561和0.9244 nm，配體3號位的氮原子與3'號位的氮原子相距0.551 nm，2個配體上的氧原子相距0.332 nm.可以看出，2個配體1與接受體半三明治釕（Ⅱ）Ru1配位后2個配體1的取向一致，這樣的組裝體穩(wěn)定性較好.

Fig.1 ORTEP structure of assembly 4

Table 1 Selected crystallographic data for assembly 4

2.2 組裝體的紫外?可見吸收研究

圖2 給出配體1~3，Ru1~Ru3和組裝體4~12在甲醇中的紫外?可見吸收光譜.烷基鏈的長度對1，3-雙咪唑基苯配體1~3的吸收光譜基本沒有影響［圖2（A）］，最大吸收峰位于287 nm，可以歸屬為分子內(nèi)的π→π*電子躍遷.組裝體4~6的紫外吸收光譜與相應(yīng)的草酸型Ru1前體類似，最大吸收峰位于217 nm處；組裝體7~9的吸收光譜與相應(yīng)的苯醌型Ru2前體也非常相似，在226，400和495 nm附近有強(qiáng)的吸收峰；與相應(yīng)的苯醌型Ru3類似的組裝體10~12也有類似的3個吸收峰.不同類型的Ru前體具有不同吸收峰是由于Ru（Ⅱ）與配體之間的電子轉(zhuǎn)移難易不同而產(chǎn)生的［35］.組裝體4~12在224~298 nm處的最強(qiáng)吸收峰可以歸屬為π→π*電子躍遷，峰的強(qiáng)度比相應(yīng)的Ru單體明顯增強(qiáng)［36，37］.399~496 nm處的吸收峰可能是接受體內(nèi)部的金屬-配體之間電荷轉(zhuǎn)移（MLCT）的結(jié)果.

2.3 組裝體的體外抗癌活性研究

組裝體4~12及相應(yīng)的配體1~3和Ru1~Ru3對細(xì)胞株A549，MDA-MB-231，HepG-2及MCF-7的MTT實驗結(jié)果見表2.結(jié)果表明，配體1~3對4種腫瘤細(xì)胞基本沒有毒性（IC50＞100 μmol/L）.草酸型和苯醌型的Ru前體（Ru1和Ru2）及其組裝體4~9均未表現(xiàn)出對這些腫瘤細(xì)胞的抑制活性，而萘醌型的組裝體10~12對4種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出高的細(xì)胞毒性（IC50<2.22 μmol/L），說明Ru接受體的結(jié)構(gòu)類型對細(xì)胞的毒性有很大影響，這與文獻(xiàn)［31］實驗結(jié)果一致.雖然萘醌型的Ru前體（Ru3）也對這些腫瘤細(xì)胞有一定毒性，但其組裝體10~12的毒性明顯改變，表明組裝體的抗癌活性是由給體與接受體協(xié)同作用所致.組裝體10~12對A549細(xì)胞的毒性是順鉑的10倍以上，是阿霉素的2倍以上，說明組裝體10~12對肺癌有較好抑制作用.順鉑對MDA-MB-231的毒性較低（IC50＞50 μmol/L），組裝體10~12對MDA-MB-231有很好的抑制活性，其中組裝體12的IC50為（0.08±0.02）μmol/L，是阿霉素的3倍以上.組裝體10~12對HepG-2的抑制能力明顯優(yōu)于順鉑，對MCF-7的抑制能力接近順鉑，但均不如阿霉素.

Fig.2 UV?Vis absorption spectra of ligands 1—3(A),Ru1 and assemblies 4—6(B),Ru2 and assemblies 7—9(C)and Ru3 and assemblies 10—12(D)in methanol

Table 2 Cytotoxicity of ligands 1—3,Ru1—Ru3,assemblies 4—12,cisplatin and doxorubicin against cancer cell lines in vitro in 72 h

為了進(jìn)一步探究組裝體對癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的選擇性，選取對癌細(xì)胞有抑制作用的組裝體10~12，選擇2種癌細(xì)胞A549和HepG-2，以及對應(yīng)的2種正常細(xì)胞HBE和THLE-2進(jìn)行實驗.表3中SIa表示組裝體對HBE的半數(shù)毒性濃度比對A549的半數(shù)抑制濃度，SIb表示組裝體對THLE-2的半數(shù)毒性濃度比對HepG-2的半數(shù)抑制濃度.實驗結(jié)果表明，組裝體10~12對A549的選擇性均好于順鉑和阿霉素，其中組裝體12的選擇性指數(shù)高達(dá)2.29.在HepG-2與THLE-2對照組中，組裝體10~12與順鉑均沒有阿霉素的選擇性好，與順鉑相比，組裝體10~12對肝癌細(xì)胞的抑制效率更高.綜上所述，組裝體10~12對A549/HBE的選擇性較好，優(yōu)于順鉑和阿霉素.

Table 3 Selectivity comparison of assemblies 10—12,cisplatin and doxorubicin to A549 and HBE,HepG?2 and THLE?2*

2.4 組裝體的細(xì)胞攝取性能

為了確定抗癌活性是否與組裝體在細(xì)胞中的攝取量有關(guān)，測試了A549和HBE細(xì)胞對組裝體10~12中Ru的攝取量，結(jié)果如圖3所示.組裝體10，11和12在A549細(xì)胞中的濃度分別為0.832，0.206和0.374 nmol/106cells；它們在HBE細(xì)胞的濃度分別為0.458，0.054，0.107 nmol/106cells，即腫瘤細(xì)胞A549對各組裝體的攝取量均大于正常細(xì)胞HBE，此結(jié)果與上述組裝體對腫瘤細(xì)胞具有較好的選擇性一致.由于組裝體10~12的結(jié)構(gòu)略有差異，導(dǎo)致各組裝體在A549和HBE中攝取量略有不同，它們對Ru化合物的攝取量順序為10＞12＞11，但組裝體對A549的毒性順序為11＞12＞10，對HBE的毒性順序為11＞10＞12，說明組裝體的抗癌活性與細(xì)胞攝取有一定關(guān)系，但還與其它因素有關(guān)［38］.

Fig.3 Concentrations of Ru of assemblies 10—12 in A549 cells and HBE cells

2.5 組裝體10~12的脂水分配系數(shù)

帶有不同長度烷基鏈的組裝體（10~12）的親水性和親脂性有所不同，實驗測得10~12的脂水分配系數(shù)（lgPo/w）分別為0.176，0.41和0.549，其中組裝體10的親水性更好，而組裝體12的親脂性更好，親脂性大小順序為12＞11＞10，與A549和HBE細(xì)胞對化合物的攝取量順序略有不同（10＞12＞11），因此細(xì)胞對組裝體的吸收效率不完全取決于藥物的親脂性.組裝體10~12的lgPo/w值在?0.4~5.6之間，具有開發(fā)成臨床藥物的潛力.

2.6 組裝體10~12與CT?DNA的結(jié)合作用

了解Ru組裝體與DNA相互作用方式對于探索此類物質(zhì)的抗癌機(jī)制非常重要.利用紫外-可見吸收光譜研究了組裝體10~12與DNA的相互作用，結(jié)果見圖4.隨著CT-DNA濃度（0，0.013，0.025，0.050，0.100 mmol/L）的增加，組裝體10~12的最大吸收峰發(fā)生稍微的增色效應(yīng)和紅移（10：Δλ=7 nm，ΔI=0.02；11：Δλ=3 nm，ΔI=0.01；12：Δλ=10 nm，ΔI=0.01），說明CT-DNA與組裝體10~12是通過靜電結(jié)合模式與DNA相互作用［31］.組裝體10~12的結(jié)合常數(shù)（Kb）分別為1.45×105，3.2×104和1.8×104L/mol，組裝體10的結(jié)合常數(shù)最大.組裝體10~12是由萘醌釕（Ⅱ）Ru3與咪唑基配體1~3構(gòu)成的，因此結(jié)合常數(shù)的不同是由于咪唑配體的不同導(dǎo)致，其規(guī)律是隨著咪唑配體帶的烷氧基鏈的增長，結(jié)合常數(shù)降低，這可能是由于位阻作用造成的.

Fig.4 UV?Visible spectra of assemblies 10(A),11(B)and 12(C)upon titration of CT?DNA（0—0.1mmol/L）

EB通常被用于DNA的檢測和定位，利用熒光光譜研究了組裝體10~12與溴化乙錠對CT-DNA插入的競爭作用.結(jié)果［圖5（A），（C）和（E）］顯示，隨著加入組裝體10~12濃度的增加，插入EB的DNA溶液的熒光強(qiáng)度逐漸減弱.這是因為組裝體代替EB插入到CT-DNA中，使得插入DNA中EB的含量降低，引起熒光猝滅.組裝體的濃度與熒光猝滅具有線性關(guān)系［圖5（B），（D）和（F）］，組裝體10~12的插入常數(shù)（Kapp）分別為2.9×108，3.1×108和2.7×108L/mol，組裝體11的插入常數(shù)最大，說明其與DNA的結(jié)合力最強(qiáng).根據(jù)組裝體與熒光強(qiáng)度的關(guān)系計算出組裝體10~12的猝滅常數(shù)（Ksv）分別為3.9×105，4.0×105和3.4×105L/mol.結(jié)合前面的實驗可以發(fā)現(xiàn)，組裝體的插入常數(shù)大于相應(yīng)的靜電結(jié)合常數(shù)，說明組裝體與DNA的結(jié)合方式主要是插入作用，同時也存在部分的靜電作用.

Fig.5 Fluorescence quenching graphs(A,C,E)and Stern?Volmer graph of I0/I versus concentration(B,D,F)of the mixed solution of EB?CT?DNA with different concentrations of assemblies 10(A,B),11(C,D)and 12(E,F)

2.7 組裝體12對斑馬魚卵的毒性研究

由表4可知，48 h內(nèi)未加組裝體2的斑馬魚卵全部孵化.加入濃度為6 μmol/L的組裝體12實驗組中斑馬魚也全部孵化.當(dāng)組裝體濃度升高到12 μmol/L時，斑馬魚存活率為90%，因為所含金屬的量與48 μmol/L順鉑相當(dāng)，說明組裝體12表現(xiàn)出了較低的生物毒性.與空白對照組相比，加入藥物的實驗組出現(xiàn)了孵化減慢的情況，說明藥物進(jìn)入斑馬魚胚胎內(nèi)，對其孵化產(chǎn)生了一定的影響.這可能是因為：一方面，組裝體化合物在緩沖溶液中的溶解度較低，有部分組裝體析出附著在卵膜上（附著在卵膜上的組裝體可以通過顯微鏡觀察到），導(dǎo)致斑馬魚無法呼吸而出現(xiàn)死亡；另一方面，組裝體12進(jìn)入到卵內(nèi)與斑馬魚胚胎相互作用，抑制了斑馬魚的孵化.

Table 4 Effect of cisplatin and assembly 12 on hatchling and survival rate of zebrafish eggs

2.8 組裝體12對斑馬魚體內(nèi)腫瘤抑制的研究

Fig.6 Relative fluorescence intensity of zebrafish containing A549 tumor cells vs.time and concentration of complex 12

選取實驗結(jié)果相對較好的組裝體12進(jìn)行斑馬魚的體內(nèi)抗腫瘤實驗.分別將濃度為10和20 μmol/L的組裝體溶液注入提前植入含有熒光劑的A549細(xì)胞的斑馬魚體內(nèi)，每組30條魚，并設(shè)立空白對照組.在熒光顯微鏡下觀察并且記錄腫瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)弱（圖6）.實驗發(fā)現(xiàn)，在空白對照組中隨著時間變化腫瘤細(xì)胞逐漸增多.在實驗組中，隨著時間的推移腫瘤細(xì)胞逐漸死亡，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，而在20 μmol/L的實驗組中腫瘤細(xì)胞的熒光減弱現(xiàn)象最為明顯.綜上所述，組裝體12有較好的體內(nèi)抗腫瘤活性，而且有較低的生物毒性.

綜上所述，本文研究了配體1~3與半三明治釕（Ⅱ）Ru1~Ru3通過配位驅(qū)動的自組裝構(gòu)建的［2+2］矩形大環(huán)組裝體4~12.通過核磁氫譜、核磁碳譜、元素分析及X射線單晶衍射分析對組裝體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，證實得到了目標(biāo)產(chǎn)物.測試了組裝體的紫外?可見吸收光譜，表明MLCT效應(yīng)使組裝體的吸光度明顯增強(qiáng).評估了組裝體對A549，MDA-MB-231，HepG-2，MCF-7人癌細(xì)胞的抗腫瘤活性，且以A549/HBE與HepG-2/THLE-2為實驗組探究了組裝體對癌細(xì)胞及正常細(xì)胞的選擇性.結(jié)果表明，組裝體10~12具有較好的抑癌作用以及較好的選擇性.通過紫外-可見光光譜以及熒光光譜探究了組裝體的抗癌機(jī)理.結(jié)果表明，組裝體與DNA作用的主要方式是插入作用.脂水分配系數(shù)實驗表明，烷基鏈的長度對組裝體的親脂性有重要影響.細(xì)胞攝取實驗表明，抗癌活性與組裝體在細(xì)胞內(nèi)的攝取量有關(guān).采用斑馬魚卵對組裝體12的急性毒性進(jìn)行了評價，發(fā)現(xiàn)組裝體12對斑馬魚卵的毒性相對較小，與順鉑相當(dāng).在斑馬魚體內(nèi)腫瘤實驗中，隨著時間的推移熒光逐漸減弱，說明組裝體12在斑馬魚體內(nèi)有較好的抑癌效果.

支持信息見http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210407.