郭亞瑞,周偉強

(沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，也是女性癌癥相關(guān)死亡的重要原因。目前，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率仍在逐年上升，其發(fā)生發(fā)展的分子機制需要深入地探索[1-2]。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)，由于其侵襲性和缺乏治療靶點，且雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體2型(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)都是陰性，無特異性治療靶點，是乳腺癌中一類高度異質(zhì)性的亞型[3-4]。

近年來，組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACi)在體內(nèi)、外對實體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤顯示出良好的抗腫瘤活性[2]。西達苯胺(chidamide)是一種新型口服活性苯甲酰胺類HDACi，選擇性抑制組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)1、2、3和10的活性，HDAC 1、2、3和10是參與腫瘤細胞及其周圍微環(huán)境中腫瘤起始和發(fā)展并在其中發(fā)揮重要作用的酶。作為一種表觀遺傳調(diào)節(jié)劑，Chidamide誘導(dǎo)腫瘤細胞生長停滯和凋亡，并增強細胞抗腫瘤免疫[5]。

越來越多的研究表明，長非編碼核糖核酸(long non-coding RNA，LncRNA)作為一類新的重要的細胞生物學(xué)行為調(diào)控因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[2]。LncRNA是基因組中非蛋白質(zhì)編碼區(qū)的一大類轉(zhuǎn)錄物，長度超過200個核苷酸。最近的研究表明，LncRNA調(diào)節(jié)許多重要的癌癥病理過程，如腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥性[6-8]。LncRNA主要通過與關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白相互作用來調(diào)節(jié)其功能或表達[8]。本文將Chidamide作用于三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞，研究相關(guān)LncRNA在Chidamide作用乳腺癌MDA-MB-231細胞中的表達情況，探討相關(guān)LncRNA在Chidamide抑制乳腺癌細胞生長中的調(diào)控機制，為進一步明確LncRNA與蛋白在乳腺癌細胞中的分子作用機制，提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)和實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞(ATCC細胞庫)；RPMI 1640培養(yǎng)基(A4192301)、胎牛血清(A3160902)、青鏈霉素(KGY0023,Thermo Scientific)；Chidamide(Chipscreen Biosciences Ltd)；Muse Count &Viability試劑盒(13-0618,Millipore)；RNA提取試劑盒(1182866500,Roche)；Power SYBR Green PCR Master mix(4367659,Life Technologies)；一抗抗體(Abcam lnc)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(B2162617,Roche)；LncRNA ENST00000448869.1小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；細胞分析儀(德國Premego)，超微量核酸檢測儀NanoDrop-2000(美國Thermo Fisher)，PCR擴增儀Mastercyler(美國Eppendorf)，實時定量PCR儀7500(美國Life Technology),電泳系統(tǒng)及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國BIO-Rad),多通道化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)MF-Chemi BIS2.0(以色列DNR)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人乳腺癌MDA-MB-231細胞使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)，置于37 ℃，5%CO2，95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞長至培養(yǎng)瓶底70%-80%時，將細胞接種至96孔板(1×107個·L-1)或6孔板(5×108個·L-1)各孔中。將已貼壁細胞更換為無血清培養(yǎng)基進行同步化處理后再進行下列實驗。

1.2.2高通量測序篩選陽性LncRNA 將Chidamide與MDA-MB-231細胞共同培養(yǎng)24 h，抽提樣品的總RNA后，利用去核糖體試劑盒將rRNA去除，并將RNA片段化(平均片段長度約為200 nt左右)，逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，再合成雙鏈cDNA并純化，接著末端修復(fù)并加接頭引物，PCR擴增并純化，然后再對文庫進行質(zhì)檢，最后上機測序。之后聯(lián)合生物信息學(xué)軟件分析篩選陽性LncRNA分子。通過蛋白互作生物學(xué)軟件推測該LncRNA分子的互作蛋白。

1.2.3MTT和細胞活力實驗 將不同濃度的Chidamide(0、20、100 μmol·L-1)與MDA-MB-231細胞共同孵育24 h，經(jīng)胰酶消化后收集細胞。進行MTT實驗，在490 nm的微孔板讀數(shù)器上測量吸光度；收集約2×105個(50 μL細胞懸液)細胞，每組細胞中加入450 μL Count &Viability reagent，混勻室溫靜置后應(yīng)用Muse自動細胞分析儀檢測細胞活力。

1.2.4LncRNA ENST00000448869.1 siRNA(1、2、3)轉(zhuǎn)染 根據(jù)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑使用說明，先將無血清培養(yǎng)基與適量lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫放置5 min。再將無血清培養(yǎng)基分別與適量的LncRNA ENST00000448869.1 siRNA1、2、3混合，室溫放置5 min。然后將兩種混合液移到1.5 mL離心管中混勻后靜置5 min，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物分別與六孔板中的MDA-MB-231細胞混合，培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。LncRNA ENST00000448869.1 siRNA的靶序列為，siRNA1：5′-GCTCTCCTGATCA ATACAT-3′；siRNA2：5′-CCAAAGTCTCCCAGTCAAT-3′；siRNA3：5′-GGCTGGAACTTAACGCTGT-3′。

1.2.5RNA提取和Real-time PCR 將Chidamide與MDA-MB-231細胞共同孵育24 h，按照RNA提取試劑盒說明進行，合成第一鏈cDNA后應(yīng)用SYBR Green方法進行Real-time PCR，以GAPDH為內(nèi)參進行反應(yīng)，檢測mRNA水平。LncRNA ENST0000044 8869.1引物序列Forward為5′-AGGCCTCGTTCAC CTTGACG-3′，Reverse為5′-CCCTTGCCACGTCCAC TACC-3′；Nestin引物序列Forward為5′-GCTGA AGCCCTGGGGAAAGT-3′，Reverse為5′-CCAGGGGAGTGGAGTCTGGA-3′。

1.2.6Western blot檢測 將Chidamide與MDA-MB-231細胞共同孵育24 h，收集細胞提取總蛋白，并用BCA法測定蛋白含量。取等量蛋白樣品煮沸10 min，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，4 ℃封閉過夜，洗膜，然后經(jīng)過一抗孵育、洗膜、二抗孵育、ECL化學(xué)發(fā)光、凝膠成像系統(tǒng)成像。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA ENST00000448869.1分子的表達水平在Chidamide處理后增高如Fig 1 LncRNA差異表達火山圖和熱圖分析結(jié)果顯示，用Chidamide處理乳腺癌MDA-MB-231細胞后提取RNA，通過18 s/28 s RNA比率質(zhì)控后合成cDNA。應(yīng)用高通量測序發(fā)現(xiàn)LncRNA ENST00000448869.1豐度比對照組明顯增高。在Chidamide處理乳腺癌MDA-MB-231細胞前后LncRNA ENST00000448869.1出現(xiàn)差異表達，Chidamide處理使ENST00000448869.1表達水平升高。結(jié)果表明，LncRNA ENST00000448869.1可能參與Chidamide作用乳腺癌細胞后細胞生長的調(diào)控。

Fig 1 The volcano map and heat map of LncRNA differential expression (MDA-MB-231Basal—MDA-MB-231CHid)The abscissa represented the change of expression multipleof LncRNA in different samples;the ordinate represented the statistical significance of the difference in gene expression,the red dot indicated that LncRNA was significantly up-regulated and the green dot indicated that LncRNA was significantly down-regulated.

Fig 2 Assay for Chidamide concentration-response effect by MTT and cell viability assay by Muse cell analyzer in MDA-MB-231 cells

2.2 LncRNA ENST00000448869.1分子與Nestin蛋白之間存在互作關(guān)系通過選取LncRNA ENST00000448869.1，可以繪制該LncRNA與其靶基因互相作用的網(wǎng)絡(luò)圖，從而為整體性地分析LncRNA在樣品中發(fā)揮的功能提供參考與幫助。蛋白互作生物學(xué)軟件推測LncRNA ENST00000448869.1分子與Nestin存在蛋白互作關(guān)系。因此，我們可以認為Chidamide作用乳腺癌細胞后，可能存在LncRNA ENST00000448869.1與Nestin蛋白的相互作用而影響細胞生長。

2.3 Chidamide抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞生長我們將0、20、100 μmol·L-1的Chidamide與乳腺癌MDA-MB-231細胞共同孵育24 h，進行MTT檢測和細胞活力實驗，F(xiàn)ig 2結(jié)果顯示，20 μmol·L-1的Chidamide作用乳腺癌細胞，在490 nm處吸光度明顯降低，100 μmol·L-1的吸光度明顯降低，說明Chidamide作用后降低乳腺癌細胞的細胞活力；與對照組相比，低劑量(20 μmol·L-1)的Chidamide對乳腺癌細胞有抑制作用；高劑量(100 μmol·L-1)的Chidamide作用MDA-MB-231后，細胞活率為57.1%，明顯低于對照組細胞活率71.0%，抑制效果更明顯。

2.4 Chidamide作用乳腺癌MDA-MB-231細胞后LncRNA ENST00000448869.1和Nestin表達都增高為了驗證LncRNA的分析結(jié)果，我們應(yīng)用QPCR檢測了乳腺癌MDA-MB-231細胞系中ENST00000448869.1片段的表達情況。同時為了明確Chidamide誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖中LncRNA ENST00000448869.1以及Nestin的表達水平，我們測定了0、20、100 μmol·L-1的Chidamide作用乳腺癌細胞后其LncRNA ENST00000448869.1和Nestin的mRNA表達水平，F(xiàn)ig 3結(jié)果顯示，乳腺癌MDA-MB-231細胞中LncRNA ENST0000044 8869.1含量在低劑量(20 μmol·L-1)和高劑量(100 μmol·L-1)Chidamide處理后都明顯上升，而Nestin的表達也在低劑量和高劑量Chidamide處理后比對照組明顯增加。該結(jié)果表明，Chidamide可以促進LncRNA ENST00000448869.1和其互作蛋白Nestin的mRNA表達水平，說明Chidamide處理乳腺癌細胞后可能存在LncRNA ENST00000448869.1和Nestin之間的調(diào)控機制。具體的分子機制有待進一步探索。

Fig 3 The mRNA expression of LncRNA ENST00000448869.1 and Nestin induced by Chidamide in breast cancer cells n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs Basal.

2.5 LncRNA ENST00000448869.1 siRNA轉(zhuǎn)染降低乳腺癌細胞中LncRNA ENST00000448869.1和Nestin的mRNA和蛋白水平針對LncRNA ENST00000448869.1分子序列設(shè)計3對特異siRNA片段用以靜默相關(guān)LncRNA的表達，LncRNA ENST00000448869.1 siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞后，與Chidamide共同孵育24 h，進行細胞活力檢測；Real-time PCR測定LncRNA ENST00000448869.1的mRNA表達水平；Western blot實驗檢測Nestin的蛋白表達水平。Fig 4結(jié)果顯示：siRNA靜默LncRNA ENST00000448869.1后可明顯增強Chidamide對MDA-MB-231細胞的藥理殺傷作用，其中siRNA3作用活細胞比率為19.1%，抑制效果最明顯。Fig 5結(jié)果顯示：siRNA可明顯抑制LncRNA分子ENST00000448869.1 mRNA分子的表達；Western blot結(jié)果顯示：siRNA轉(zhuǎn)染細胞后，受Chidamide激活的Nestin的表達被明顯抑制。這些結(jié)果可以說明，siRNA有效靜默LncRNA ENST00000448869.1分子后，乳腺癌細胞活力比對照組和Chidamide處理組明顯降低，Nestin的表達也受到抑制，表明，LncRNA ENST00000448869.1分子可以靶向調(diào)控Nestin的表達，從而增加Chidamide對乳腺癌MDA-MB-231細胞的藥理作用，抑制細胞生長。

Fig 4 Muse cell analysis for LncRNA-siRNA:siRNA 1,2,3 transfected into breast cancer cells respectively and incubated with Chidamide for 24 hours (n=3)

Fig 5 Assay for LncRNA mRNA expression induced by LncRNA siRNA1,2,3 transfected into breast cancer cells respectively and Nestin expression n=3)*P<0.05 vs Basal,##P<0.01 vs Chidamide.

3 討論

乳腺癌在全球范圍內(nèi)女性癌癥中發(fā)病率和死亡率都很高，乳腺癌的發(fā)生不僅與遺傳和內(nèi)分泌因素有關(guān)，還與LncRNA、miRNAs和蛋白質(zhì)表達不當(dāng)有關(guān)[9-10]。HDACi是一組有前景的抗癌藥物，通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達，在誘導(dǎo)癌細胞凋亡和細胞周期停滯中具有潛在作用[11]。Chidamide作為新一代的HDACi，不會明顯增加化療的副作用[12]。我們將Chidamide與乳腺癌MDA-MB-231細胞共同孵育，利用Muse自動細胞分析儀發(fā)現(xiàn)，Chidamide可以降低MDA-MB-231細胞活力，抑制細胞生長。

LncRNA被認為是最敏感和特異的癌癥生物標志物之一，在不同水平上參與各種癌癥的發(fā)展和進展，包括表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[13]。有研究表明，LncRNA是乳腺癌發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與控制自噬有關(guān)，因此識別與自噬相關(guān)的具有乳腺癌預(yù)后價值的LncRNA是至關(guān)重要的[13]。雖然已經(jīng)報道了LncRNA通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)前轉(zhuǎn)移作用和調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)來調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移，并且有些LncRNA轉(zhuǎn)錄物參與乳腺癌的發(fā)生，但是LncRNA在乳腺癌治療中的生物學(xué)作用還沒有得到很好的研究[14]。我們通過高通量測序聯(lián)合生物信息學(xué)軟件分析篩選出LncRNA ENST00000448869.1分子在經(jīng)Chidamide作用后表達增高，我們進一步通過實時熒光定量PCR驗證了ENST00000448869.1的準確性。進一步的后續(xù)實驗可以檢測LncRNA ENST00000448869.1是否與細胞自噬相關(guān)。

Nestin是第VI型中間絲蛋白，實驗?zāi)Ｐ秃腿祟悩颖径急砻鱊estin在許多類型的腫瘤和一些其他的組織中的表達上調(diào)[15]。Nestin與腫瘤發(fā)生相關(guān)，因為它在癌癥組織中的表達高于正常組織，尤其在小腫瘤血管和基質(zhì)癌細胞中Nestin出現(xiàn)高表達[16]。因此Nestin可以作為乳腺癌新血管生成的重要標志物。我們通過蛋白互作分析軟件的結(jié)果，說明LncRNA ENST00000448869.1分子與Nestin存在蛋白互作關(guān)系。我們通過Real-time PCR驗證了在Chidamide作用乳腺癌細胞后Nestin的mRNA表達增高。為了進一步驗證LncRNA ENST00000448869.1和Nestin在乳腺癌MDA-MB-231細胞中的調(diào)控作用，我們設(shè)計了特異siRNA來靜默相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。我們利用siRNA抑制LncRNA ENST0000044 8869.1分子的轉(zhuǎn)錄后，在Chidamide作用細胞時，siRNA明顯抑制了LncRNA的表達，同時在siRNA的作用下Nestin的mRNA和蛋白表達量也呈下降趨勢，與此同時細胞死亡率也隨之下降。這些結(jié)果說明了LncRNA ENST00000448869.1分子靶向調(diào)控Nestin的表達降低，可以抑制乳腺癌MDA-MB-231的細胞生長。

總之，我們的實驗只是初步證實了在Chidamide作用乳腺癌MDA-MB-231細胞后，可能存在LncRNA ENST00000448869.1和Nestin之間的調(diào)控機制抑制乳腺癌細胞生長。LncRNA ENST0000044 8869.1和Nestin之間具體的作用機制需要進一步的實驗驗證。本研究為進一步的探索LncRNA ENST00000448869.1在乳腺癌細胞生長作用中的機制提供了實驗基礎(chǔ)。

(致謝：衷心感謝沈陽醫(yī)學(xué)院遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室為本實驗提供的實驗設(shè)備，感謝實驗室全體工作人員對本實驗的大力協(xié)助。)