楚 敏，閻希芮，龔永昌，劉 晴，施建蓉，董 楊

(上海中醫(yī)藥大學(xué)1.教學(xué)實驗中心、2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

老年性聾(presbycusis)又稱為年齡相關(guān)性聽力損失(age-related hearing loss，ARHL)，是指隨著年齡的增長而引起聽覺器官衰老和退變所造成的聽力損失，是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病。老年性聾的發(fā)病機制復(fù)雜，目前仍然不十分清楚，研究認為，該病與氧化應(yīng)激、細胞凋亡、線粒體功能障礙等有關(guān)[1]。近年來，微小RNA(microRNA，miRNA)與老年性聾的關(guān)系得到越來越多的關(guān)注[2]。miRNA是一類非蛋白質(zhì)編碼性RNA分子，可引起mRNA 降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯參與細胞的生理和病理過程。Zhang等[3]在C57BL/6J小鼠和CBA/J小鼠模型上檢測參與老年性聾發(fā)病過程中耳蝸螺旋器退化的miRNA，發(fā)現(xiàn)促凋亡miRNA(miR-29和miR-34家族)的上調(diào)以及促增殖、分化miRNA(miR-181和miR-183家族)的下調(diào)。ROS引起的miRNA表達變化可能引起耳蝸螺旋器的退化，參與老年性聾的發(fā)病機制[4]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是miR-34a的靶基因，參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激引起的細胞凋亡，又可以對自噬作用進行調(diào)控[5]。SIRT1可以介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白Atg9的乙?；饔?，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的自噬。微管相關(guān)輕鏈蛋白3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)是一種自噬標記物，其C端可被自噬相關(guān)蛋白Atg4分割成 LC3-Ⅰ，分布于胞質(zhì)。在自噬體形成之后，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，生成LC3-Ⅱ，并穩(wěn)定的固定在自噬體內(nèi)外膜，直到形成自噬溶酶體。因此，LC3-Ⅱ 蛋白的表達可以在一定程度上反映自噬細胞內(nèi)自噬體的多少。選擇性自噬接頭蛋白(p62/sequestosome 1，SQSTM1)是連接 LC3-Ⅱ 蛋白與待降解泛素化底物的重要橋梁。當(dāng)某些 Atg 基因突變、缺失或者自噬溶酶體形成受阻時，p62蛋白會出現(xiàn)明顯堆積[6]。

耳聾左慈丸(Erlong Zuoci Wan，ELZC)(《中國藥典》2015版)為治療耳聾、耳鳴的經(jīng)典古方，由熟地黃、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉、丹皮、柴胡、磁石八味藥組成，功效滋腎平肝，主治肝腎陰虛的耳鳴耳聾、頭暈?zāi)垦！，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，耳聾左慈丸對耳鳴、藥物性聾和老年性聾均有一定的治療作用[7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，耳聾左慈丸可以減輕 C57BL/6J 早發(fā)性老年性聾小鼠年齡相關(guān)的聽力損失和耳蝸病理損傷[8]。耳蝸毛細胞暴露于過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)會產(chǎn)生氧化損傷反應(yīng)，并表現(xiàn)出衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性增高的現(xiàn)象，常用于老年性聾離體培養(yǎng)模型的建立[9]。本研究擬在小鼠耳蝸基底膜離體培養(yǎng)模型上，進一步觀察耳聾左慈丸對H2O2損傷后miR-34a及其下游蛋白的作用，探討耳聾左慈丸防治老年性聾的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級C57BL/6J小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2017-0005，4 d齡。

1.2 藥物耳聾左慈丸由八味中藥組成：熟地(批號：200307)、山茱萸(制)(批號：191231)、山藥(批號：200218)、茯苓(批號：200121)、澤瀉(批號：200120)、牡丹皮(批號：190810)、柴胡(批號：200205)、磁石(煅)(批號：190527)，購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?。按照前期研究[7]，先將耳聾左慈丸各組分按照8 ∶4 ∶4 ∶3 ∶3 ∶3 ∶1 ∶1的比例配伍組成，稱取相應(yīng)中藥，8倍量雙蒸水浸泡2 h，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮30 min，取藥液；再加雙蒸水武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮30 min，取藥液。將兩次藥液合并，濃縮至所需生藥濃度。按體積比2 ∶3加入無水乙醇，4 ℃靜置 24 h后，2000 rpm 離心 15 min 取上清。蒸發(fā)濃縮，制備成 0.3 kg·L-1(按生藥濃度計算)的母液，經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾除菌，4 ℃保存。使用時用培養(yǎng)液稀釋至合適濃度。

1.3 試劑H2O2(美國Sigma公司)；牛血清白蛋白(美國Sigma公司)；BME培養(yǎng)基(美國Sigma 公司)；Hanks液(美國Thermo公司)；miRNeasy mini kit試劑盒(德國 QIAGEN 公司)；染料法 Hairpin-it miRNAs定量和u6校準 qRT-PCR 試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；TUNEL檢測試劑盒(美國Promega公司)；phalloidin -TRITC(美國Sigma 公司)；抗體LC3-Ⅱ、p62、SIRT1和羊抗兔 Alexa Fluor488，均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.4 儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(德國ZEISS公司)；LSM880共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)；LightCycler 96 SW熒光定量PCR儀(美國 Roche公司)；解剖顯微鏡(德國ZEISS公司)。

1.5 小鼠耳蝸組織取材及培養(yǎng)將出生4 d的C57BL/6J小鼠用75%酒精進行全身皮膚表面消毒，在解剖顯微鏡下取出耳蝸，放入盛有Hanks液的培養(yǎng)皿中，撥開耳蝸殼，將基底膜組織與蝸軸分離，去掉螺旋韌帶、血管紋等其他結(jié)構(gòu)，分離出整個基底膜，放入含無血清培養(yǎng)液的35 mm培養(yǎng)皿中，移到膠原凝膠滴的表面，鋪放平整。在細胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)中培養(yǎng)，隔日更換無血清培養(yǎng)液。

1.6 實驗分組和給藥小鼠耳蝸基底膜離體培養(yǎng)24 h后，隨機分為5組：對照組、H2O2模型組和耳聾左慈丸組(5 mg·L-1、10 mg·L-1和50 mg·L-1)，每組14只。耳聾左慈丸組先以藥物預(yù)處理24 h，對照組和模型組更換無血清培養(yǎng)液，24 h后模型組和耳聾左慈丸組加入0.3 mmol·L-1的H2O2繼續(xù)置于細胞培養(yǎng)箱孵育4 h，終止培養(yǎng)。

1.7 Real-time qPCR法檢測miR-34a表達終止培養(yǎng)后，收集基底膜組織，每組6只動物，設(shè)3個復(fù)孔。提取其miRNA(具體步驟參照說明書進行)。引物設(shè)計與合成由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。mmu-mir-34a-5p基因引物序列：TCTGTCTCTCTTGGCAGTGTCTTA。miRNA逆轉(zhuǎn)錄和qPCR選用U6 snRNA作為內(nèi)參。整個擴增反應(yīng)體系參照試劑盒說明書進行。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min預(yù)變性；95 ℃，12 s變性；60 ℃，40 s，循環(huán)40次。實驗結(jié)果采用公式 2-△△Ct計算miR-34a的相對表達量。

1.8 免疫熒光組化法檢測蛋白表達終止培養(yǎng)后，加入4% 多聚甲醛固定液固定1 h，用細鑷刮脫帶有基底膜的膠滴，0.01 mol·L-1PBS清洗3次，10% 山羊血清封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；0.01 mol·L-1PBS清洗3次，加入Alexa Fluor 488標記的羊抗兔二抗(1 ∶400)，避光孵育1 h；0.01 M PBS清洗3次，加入phalloidin-TRITC(1 ∶200)，避光孵育30 min，0.01 mol·L-1PBS清洗3次。滴加50% 甘油PBS封固于玻片上，共聚焦顯微鏡下觀察。免疫熒光圖片采用ZEN 2.3 lite軟件進行熒光半定量分析，每組4個耳蝸基底膜組織。

1.9 TUNEL法檢測細胞凋亡終止培養(yǎng)后，加入4% 多聚甲醛固定液固定30 min，用細鑷刮脫帶有基底膜的膠滴，0.01 mol·L-1PBS清洗3次，按照說明書，使用 TUNEL檢測試劑盒，注意避光。然后用0.01 mol·L-1PBS清洗3次，加入phalloidin -TRITC(1 ∶200)，避光孵育30 min，0.01 mol·L-1PBS清洗3次。滴加50% 甘油PBS封固于玻片上，共聚焦顯微鏡下觀察，每組4個耳蝸基底膜組織。

2 結(jié)果

2.1 耳聾左慈丸對H2O2損傷小鼠耳蝸基底膜miR-34a表達的影響Real-time qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2模型組miR-34a表達明顯升高(P<0.01)，耳聾左慈丸組miR-34a表達與模型組比較明顯下降(P<0.01)。提示耳聾左慈丸可以抑制H2O2致小鼠耳蝸基底膜損傷后miR-34a的表達增高(Fig 1)。

Fig 1 Effect of ELZC on miR-34a expression in H2O2damaged cochlear cultures **P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs model group

2.2 耳聾左慈丸對H2O2損傷后毛細胞SIRT1蛋白表達的影響結(jié)果如Fig 2所示，對照組耳蝸毛細胞排列整齊，無缺失；0.3 mmol·L-1的H2O2作用4 h后外毛細胞大量缺失，內(nèi)毛細胞損傷較?。欢@左慈丸給藥后，隨著濃度的增加，毛細胞丟失和損傷明顯減輕。與對照組相比，模型組耳蝸毛細胞SIRT1蛋白熒光強度明顯降低(P<0.01)，耳聾左慈丸組SIRT1蛋白表達與模型組比較有增強趨勢，50 mg·L-1耳聾左慈丸組SIRT1蛋白表達與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 耳聾左慈丸對H2O2損傷后毛細胞自噬相關(guān)蛋白的影響結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組毛細胞LC3-Ⅱ和p62蛋白表達明顯升高(P<0.05，P<0.01)；耳聾左慈丸組與模型組相比，LC3-Ⅱ和p62蛋白熒光表達明顯降低(P<0.01，P<0.05)。以上結(jié)果提示，H2O2可以引起耳蝸基底膜毛細胞自噬體的堆積，損傷自噬流，而耳聾左慈丸有減少自噬體堆積，減輕自噬流損傷的作用(Fig 3)。

2.4 耳聾左慈丸對H2O2損傷后毛細胞凋亡的影響結(jié)果如Fig 4所示，對照組基底膜毛細胞幾乎沒有 TUNEL陽性細胞出現(xiàn)，而H2O2模型組TUNEL陽性細胞數(shù)明顯增多；耳聾左慈丸組TUNEL陽性細胞數(shù)與模型組相比明顯降低。以上結(jié)果提示，H2O2可以誘導(dǎo)小鼠耳蝸基底膜毛細胞的凋亡，耳聾左慈丸具有抑制細胞凋亡的作用。

Fig 2 Effect of ELZC on SIRT1 expression in A:Immunofluorescence staining of SIRT1，bar=10 μm；B:Densitometry analysis of SIRT1.**P<0.01 vs control group；#P<0.05 vs model group

Fig 3 Effects of ELZC on LC3-Ⅱ and p62 expression in H2O2 damaged cochlear cultures n=4)A:Immunofluorescence staining and densitometry analysis of LC3-Ⅱ；B:Immunofluorescence staining and densitometry analysis of p62,bar=10 μm.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs model group

Fig 4 Effect of ELZC on apoptosis in H2O2 damaged cochlear cultures (n=4).bar=10 μm

3 討論

miRNA是一類非編碼微小RNA分子，通過特異性結(jié)合靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)，引起mRNA降解或蛋白質(zhì)翻譯抑制[10]。miRNA 在老年性聾的發(fā)病機制中也可能具有重要作用。miR-34a是誘導(dǎo)衰老、細胞周期阻滯和凋亡的關(guān)鍵因子。在C57BL/6J早發(fā)性老年聾小鼠耳蝸中，miR-34a表達增加，抑制自噬相關(guān)蛋白ATG9A的表達，損傷自噬流，引起細胞死亡[11]。還有研究發(fā)現(xiàn)，老年性聾患者血漿中miR-34a水平明顯增高，這些都提示，miR-34a在老年性聾的發(fā)病機制中有重要作用[12]。

SIRT1是一種 NAD+ 依賴性去乙酰化酶，在代謝和衰老過程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究將SIRT1作為治療年齡相關(guān)性疾病的作用靶點。SIRT1是miR-34a的靶基因，miR-34a升高可以通過作用于NAMPT降低SIRT1的活性[13]。Xiong等[14]發(fā)現(xiàn)，調(diào)控miR-34a/SIRT1信號通路，可以協(xié)調(diào)線粒體自噬和線粒體生物合成，保護耳蝸毛細胞，延緩年齡相關(guān)性聽力損失。本研究發(fā)現(xiàn)，耳聾左慈丸可以降低H2O2誘導(dǎo)的耳蝸基底膜miR-34a表達的升高，并上調(diào)SIRT1蛋白表達，提示耳聾左慈丸可能通過miR-34a/SIRT1通路抑制耳蝸基底膜的氧化損傷。

自噬和凋亡是調(diào)控細胞死亡的兩個重要途徑[15]。自噬是細胞在生理或病理因子作用下，通過溶酶體途徑對錯誤折疊的蛋白質(zhì)和功能受損的細胞器進行有效的識別和降解[16]。因此，自噬被認為是細胞除凋亡和壞死之外的第三種死亡方式。有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和慢性炎癥可以誘發(fā)線粒體受損和蛋白質(zhì)表達異常，此時自噬水平的早期上調(diào)可以起到一定的清除作用，而自噬流一旦出現(xiàn)阻滯現(xiàn)象，就會加速聚集大量無功能的線粒體和蛋白分子，出現(xiàn)凋亡、自噬或兩種細胞死亡途徑共存的現(xiàn)象，引發(fā)耳蝸毛細胞毒性反應(yīng)[17]。SIRT1可以與ATG5、ATG7和LC3作用，并去乙?；@些蛋白，表明SIRT1也可以直接參與自噬調(diào)節(jié)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可以引起耳蝸基底膜毛細胞LC3-Ⅱ 和p62蛋白表達增高，提示自噬體堆積、自噬流阻滯，耳聾左慈丸可降低LC3-Ⅱ 和p62蛋白表達，f具有恢復(fù)自噬流的作用。

綜上所述，耳聾左慈丸可能通過作用于miR-34a，調(diào)節(jié)SIRT1蛋白，進而影響自噬流，抑制細胞凋亡，對H2O2致小鼠耳蝸基底膜毛細胞損傷起到保護作用。

(致謝：本研究在上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院聽覺實驗室完成，在此致以衷心的感謝！)