周 毅，楊亞坤，康 平，柳 丹，夏順杰，張 悅，劉 巍

(河北醫(yī)科大學(xué) 1.第二醫(yī)院、2.病理學(xué)教研室、3.診斷學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)可導(dǎo)致漸進(jìn)性、不可逆性的腎單位丟失和腎組織損傷，繼而出現(xiàn)腎功能障礙，并最終進(jìn)展至終末期腎功能衰竭(end-stage renal disease，ESRD)。腎臟纖維化是多種慢性腎臟疾病發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)和重要特征，是其進(jìn)展至ESRD的共同通路之一[1-2]。早期明確診斷并采取針對性治療，可有效延緩腎臟纖維化的發(fā)生和進(jìn)展。但是，一直以來，由于纖維化的診斷缺乏早期、精準(zhǔn)的特異性標(biāo)志物，使得其治療亦缺乏針對性。因此，闡明其發(fā)病機(jī)制，對于預(yù)防及早期干預(yù)疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一類重要的致纖維化生長因子，其家族成員TGF-β1在腎臟細(xì)胞中有廣泛表達(dá)，可通過抑制細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解，在腎間質(zhì)基質(zhì)沉積中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，Cdk5)作為一種蛋白激酶，通過磷酸化相應(yīng)底物發(fā)揮其生理學(xué)作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高糖、TGF-β1等因素，可導(dǎo)致p35斷裂為p25，繼而激活Cdk5，使其激酶活性異常升高，在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷及凋亡的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。本文在此基礎(chǔ)上，以人腎小球系膜細(xì)胞為研究對象，重點(diǎn)探討TGF-β1調(diào)控Cdk5表達(dá)在系膜細(xì)胞外基質(zhì)沉積中所起的作用，以期進(jìn)一步明確TGF-β1促進(jìn)腎臟纖維化的作用機(jī)制，為探索腎臟纖維化的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清(Gibco，No.10100147)。TGF-β1(MCE，HY-P7118)，Roscovitine(Abcam，ab141847)，0.25%胰蛋白酶(Solarbio，No.T1300)。DN-Cdk5質(zhì)粒(Addgene，#1871)。兔抗Cdk5單克隆抗體(Abcam，ab40773)，兔抗p35/25多克隆抗體(CST，#2680)，兔多克隆Collagen Ⅳ抗體(Proteintech，No.55131-1AP)、鼠單克隆FN抗體(Proteintech，No.66042-1-Ig)，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearch，115-095-003)，Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(Jackson ImmunoResearch，111-165-003)。PCR引物(上海生工)，Real time-PCR試劑盒(TaKaRa Biotechnology，RR820A)。

1.1.2細(xì)胞 人腎小球系膜細(xì)胞(HMC)為本實(shí)驗(yàn)室凍存細(xì)胞，復(fù)蘇、傳代后備用。

1.1.3儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific)，恒溫孵育箱(天津泰斯特)，超低溫冰箱(青島海爾)，高速低溫離心機(jī)(德國Eppendorf)，電泳槽、電泳儀(美國Bio-Rad)，光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Olympus)，熒光實(shí)時定量PCR儀(美國Agilent)，Odyssey FC成像儀(美國Li-COR Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞分組

1.2.1.1 TGF-β1對Cdk5蛋白及mRNA表達(dá)的影響 HMC接種于6孔板，10 μg·L-1的TGF-β1分別刺激0、3、6、12、24 h，Western blot、免疫熒光化學(xué)法檢測Cdk5、p35/25蛋白表達(dá)情況，Real time-PCR檢測Cdk5 mRNA表達(dá)。

1.2.1.2 Cdk5對系膜細(xì)胞FN、Collagen Ⅳ表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染Cdk5過表達(dá)質(zhì)粒，并設(shè)置空白對照組和質(zhì)粒對照組，Western blot、免疫熒光化學(xué)法檢測FN、Collagen Ⅳ蛋白表達(dá)情況。

1.2.1.3 Cdk5抑制劑Roscovitine對TGF-β1刺激HMC后FN、Collagen Ⅳ表達(dá)的影響 細(xì)胞隨機(jī)分為Control組、TGF-β1刺激組(10 μg·L-1的TGF-β1刺激24 h)，TGF-β1+Roscovitine組(10 μg·L-1的TGF-β1和10 μmol·L-1Roscovitine混合培養(yǎng)基刺激24 h)，Western blot、免疫熒光化學(xué)法檢測FN、Collagen Ⅳ蛋白表達(dá)情況，Real time-PCR檢測FN、Collagen Ⅳ mRNA的表達(dá)。

1.2.1.4 Cdk5干擾質(zhì)粒對TGF-β1刺激HMC后FN、Collagen Ⅳ表達(dá)的影響 細(xì)胞隨機(jī)分為Control組、TGF-β1+質(zhì)粒對照Vector組，TGF-β1+DN-Cdk5組。TGF-β1+Vector組和TGF-β1+DN-Cdk5組，分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒24 h后，再給予TGF-β1(10 μg·L-1)刺激24 h，Western blot、免疫熒光化學(xué)法檢測FN、Collagen Ⅳ蛋白表達(dá)情況，Real time-PCR檢測FN、Collagen Ⅳ mRNA的表達(dá)。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Cdk5過表達(dá)質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒購自Addgene公司。1×108·L-1密度的HMC接種于6孔板，待其生長至約80%密度時，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。將3 μL FuGENE HD、1 μg質(zhì)粒溶于100 μL不含血清與抗生素的培養(yǎng)基中，混勻，室溫靜置15 min，加入6孔板中，輕搖，培養(yǎng)6-8 h后改為普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.3Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法定量。取50 μg總蛋白，加6×上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，分別加入Cdk5(1 ∶500)、p35/25(1 ∶1 000)、FN(1 ∶1 000)、Collagen Ⅳ(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜。洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG(1 ∶5 000)，37 ℃孵育2 h。TTBS洗膜，滴加ECL發(fā)光劑，于Odyssey FC成像系統(tǒng)中顯影，并對條帶進(jìn)行定量分析。以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值比值代表目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.4Real time-PCR檢測相關(guān)mRNA表達(dá) TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，NanoDrop 1000微量核酸蛋白檢測儀測定RNA純度。按照PrimeScriptTMRT regent Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取2 μL cDNA產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，熒光實(shí)時定量PCR儀檢測相關(guān)mRNA的表達(dá)。Cdk5引物：上游5′-CTTAGGTGACGGCCCATAGT-3′，下游5′-GTAACCTGCCACTTCCACCT-3′；FN引物：上游5′-GAGCTATTCCCTGCACCTGATG-3′，下游5′-CGTGCAAGGCAACCACACT-3′；Col Ⅳ引物：上游5′-GATGGCCAGAAAGGACCAGT-3′，下游5′-GGGATTCGGGGACAGTCATC-3′；18S引物：上游5′-CATTCGAACGTCTGCCCTATC-3′，下游5′-CCTGCTGCCTTCCTTGGA-3′。擴(kuò)增條件：95 ℃變性15 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 1 min，45個循環(huán)，以18S作內(nèi)參基因，用△△Ct法分析基因的相對表達(dá)。

1.2.5免疫細(xì)胞熒光法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 從處理好的細(xì)胞培養(yǎng)板底部取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定；0.3%的Triton X-100打孔；血清封閉，37 ℃孵育；加入相應(yīng)抗體Cdk5(1 ∶50)、p35/25(1 ∶100)、FN(1 ∶100)、Collagen Ⅳ(1 ∶100)，4 ℃過夜。滴加帶FITC或Cy3標(biāo)記的二抗(1 ∶50或1 ∶100稀釋)，37 ℃避光孵育；用含DAPI的防熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況并照片。

2 結(jié)果

2.1TGF-β1對系膜細(xì)胞Cdk5、p35/p25表達(dá)的影響 TGF-β1(10 μg·L-1)作用于腎小球系膜細(xì)胞0、3、6、12、24 h后，隨著刺激時間的延長，Western blot檢測Cdk5蛋白表達(dá)呈時間依賴性增加。p35/p25是Cdk5的特異性協(xié)同激動劑，TGF-β1作用后，其蛋白表達(dá)與Cdk5一致，也呈時間依賴性增加(Fig 1A)。Real time-PCR法檢測TGF-β1作用于系膜細(xì)胞0、12、24 h后，Cdk5 mRNA表達(dá)的變化。與0 h相比，TGF-β1作用12 h、24 h后，Cdk5 mRNA均明顯增加(P<0.01，F(xiàn)ig 1B)，作用24 h時，Cdk5 mRNA增加約6.82倍。

Fig 1 Effect of TGF-β1 on expression of Cdk5 and p35/p25 in human mesangial cells n=6)A:Western blot;B:Real time-PCR；*P<0.05,**P<0.01 vs 0 h group;TGF-β1:10 μg·L-1

2.2 Cdk5對系膜細(xì)胞FN、Collagen Ⅳ表達(dá)的影響與空白對照組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染Cdk5過表達(dá)質(zhì)粒后，Western blot檢測FN、Collagen Ⅳ蛋白表達(dá)均明顯增高(P<0.01，F(xiàn)ig 2A、B)；免疫熒光結(jié)果也顯示，轉(zhuǎn)染Cdk5質(zhì)粒后，F(xiàn)N(綠色熒光)、Collagen Ⅳ(紅色熒光)蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01，F(xiàn)ig 2C)。

Fig 2 Effect of Cdk5 on expression of FN and collagen Ⅳ in human mesangial cells n=6)A-B:Western blot;C:Immunofluorescence staining；**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs Vector group

2.3 Cdk5激酶活性抑制劑Roscovitine對TGF-β1刺激HMC后FN、Collagen Ⅳ表達(dá)的影響與空白對照組相比，TGF-β1刺激后，Western blot結(jié)果顯示系膜細(xì)胞FN、Collagen Ⅳ蛋白表達(dá)均明顯增加，而應(yīng)用Cdk5激酶活性抑制劑Roscovitine后，F(xiàn)N、Collagen Ⅳ表達(dá)明顯降低(P<0.05，F(xiàn)ig 3A、B)；Real time-PCR結(jié)果顯示，TGF-β1刺激后，F(xiàn)N、Collagen Ⅳ mRNA表達(dá)明顯增加，應(yīng)用Roscovitine后，mRNA表達(dá)降低(P<0.05，F(xiàn)ig 3C、D)；免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，TGF-β1刺激后，F(xiàn)N(綠色熒光)、Collagen Ⅳ(紅色熒光)表達(dá)明顯增多，應(yīng)用Roscovitine干預(yù)后，F(xiàn)N、Collagen Ⅳ表達(dá)減少(Fig 3E、F)。

Fig 3 Effect of Roscovitine on expression of FN and collagen Ⅳ in HMC stimulated by TGF-β1 n=6)1.Control;2.TGF-β1;3.TGF-β1+Roscovitine.A-B:Western blot;C-D:Real time-PCR;E-F:Immunofluorescence staining；*P<0.05,**P<0.01 vs Control group;#P<0.05,##P<0.01 vs TGF-β1 group;TGF-β1:10 μg·L-1;Roscovitine:10 μmol·L-1

2.4 Cdk5干擾質(zhì)粒對TGF-β1刺激HMC后FN、Collagen Ⅳ表達(dá)的影響與對照組相比，TGF-β1加空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，Western blot結(jié)果檢測系膜細(xì)胞FN、Collagen Ⅳ蛋白表達(dá)均明顯增加，而轉(zhuǎn)染Cdk5干擾質(zhì)粒后，F(xiàn)N、Collagen Ⅳ表達(dá)明顯降低(P<0.05，F(xiàn)ig 4A-C)；Real time-PCR結(jié)果可見，TGF-β1加空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，F(xiàn)N、Collagen Ⅳ mRNA表達(dá)明顯增加，轉(zhuǎn)染Cdk5干擾質(zhì)粒后，mRNA表達(dá)降低(P<0.05，F(xiàn)ig 4D、E)；免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，TGF-β1加空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，F(xiàn)N(綠色熒光)、Collagen Ⅳ(紅色熒光)表達(dá)明顯增多，轉(zhuǎn)染Cdk5干擾質(zhì)粒后，F(xiàn)N、Collagen Ⅳ表達(dá)減少(Fig 4F、G)。

Fig 4 Effect of Cdk5 knockdown plasmid on expression of FN and collagen Ⅳ in HMC stimulated by TGF-β1 n=6)1.Control;2.TGF-β1+vector;3.TGF-β1+DN-Cdk5.A-C:Western blot;D-E:Real time-PCR;F-G:Immunofluorescence staining；*P<0.05,**P<0.01 vs Control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Vector group;TGF-β1:10 μg·L-1

3 討論

在我國，慢性腎臟疾病的發(fā)病率約為10.8%，正日益成為危害人民身體健康的公共衛(wèi)生問題之一。腎臟纖維化是多種慢性腎臟疾病的共同病理學(xué)特征，主要表現(xiàn)為ECM的大量堆積和腎小管萎縮，并最終導(dǎo)致ESRD。大量研究表明，TGF-β上調(diào)與糖尿病腎病、膜性腎病和其他多種慢性腎臟疾病的發(fā)生、進(jìn)展均關(guān)系密切，被認(rèn)為是致腎臟纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)之一，但其具體機(jī)制目前尚未完全闡明[5]。

Cdk5是脯氨酸限定性的絲/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，主要通過磷酸化相應(yīng)底物發(fā)揮其生理學(xué)作用。一直以來，關(guān)于Cdk5生物學(xué)功能的研究多集中于神經(jīng)系統(tǒng)，認(rèn)為其在維持神經(jīng)元正常功能和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起了關(guān)鍵作用[6-7]。近年來，考慮到Cdk5及其激活亞基p35在許多神經(jīng)系統(tǒng)外組織，如胰腺、腎臟、卵巢等部位也有廣泛表達(dá)，其神經(jīng)系統(tǒng)外作用逐漸引起關(guān)注[8]。有研究報道，在抗腎小球基底膜腎炎模型鼠和HIV轉(zhuǎn)基因鼠腎組織中，Cdk5在增殖和去分化足細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低；抑制Cdk5的表達(dá)可明顯改變體外培養(yǎng)的已分化足細(xì)胞的形態(tài)，出現(xiàn)胞體延長，足突消失；抑制足細(xì)胞中p35的表達(dá)可顯著增加UV輻射、嘌呤霉素氨基核苷等引起的足細(xì)胞凋亡，提示腎臟疾病中足細(xì)胞的損傷可能與Cdk5/p35的表達(dá)異常有關(guān)[9-11]。本課題組前期針對糖尿病腎病足細(xì)胞的研究也發(fā)現(xiàn)，高糖、TGF-β1等因素，可導(dǎo)致p35斷裂為p25，繼而激活Cdk5，使其激酶活性異常升高，在足細(xì)胞損傷及凋亡的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。

本研究在此基礎(chǔ)上，以人腎小球系膜細(xì)胞為研究對象，重點(diǎn)探討TGF-β1調(diào)控Cdk5表達(dá)在系膜細(xì)胞外基質(zhì)沉積中所起的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，10 μg·L-1的TGF-β1刺激后，隨著時間的延長，系膜細(xì)胞Cdk5蛋白及mRNA表達(dá)呈時間依賴性增加；作為Cdk5的特異性協(xié)同激動劑，p35、p25也呈現(xiàn)出與Cdk5一致的表達(dá)趨勢，可見TGF-β1作用于系膜細(xì)胞后，Cdk5被激活。

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，為了觀察Cdk5在腎臟纖維化中所起的作用，我們在系膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了Cdk5過表達(dá)質(zhì)粒，觀察其對FN、Collagen Ⅳ表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染Cdk5過表達(dá)質(zhì)粒后，F(xiàn)N、Collagen Ⅳ蛋白表達(dá)均明顯增高，可見Cdk5在膠原蛋白合成、細(xì)胞外基質(zhì)沉積中起了促進(jìn)作用。進(jìn)一步，我們應(yīng)用Cdk5激酶活性抑制劑Roscovitine或轉(zhuǎn)染Cdk5干擾質(zhì)粒，目的是降低Cdk5表達(dá)，來觀察其在TGF-β1促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成中所起的作用。結(jié)果顯示，與對照組相比，TGF-β1刺激后，系膜細(xì)胞FN、Collagen Ⅳ蛋白及mRNA表達(dá)均明顯增加；而無論是應(yīng)用Roscovitine還是轉(zhuǎn)染Cdk5干擾質(zhì)粒后，F(xiàn)N、Collagen Ⅳ蛋白及mRNA表達(dá)均明顯降低，可見Cdk5在TGF-β1促進(jìn)系膜細(xì)胞外基質(zhì)合成的過程中發(fā)揮了重要作用。

關(guān)于TGF-β1引起腎臟纖維化的機(jī)制，目前較多的研究集中在兩個方面：即Smad信號通路和非Smad信號通路[12]。在Smad依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，研究報道，TGF-β1可以通過結(jié)合TGF-β受體I(TGF-β receptor I，TβRI)表面的絲/蘇氨酸激酶受體發(fā)揮其細(xì)胞效應(yīng)，導(dǎo)致錨定蛋白SARA與Smad2/3結(jié)合并促進(jìn)其磷酸化；隨后，Smad2/3磷酸化復(fù)合物與Smad4形成一高階復(fù)合物并在細(xì)胞核內(nèi)積聚；在細(xì)胞核中，活性的Smad2/3/4復(fù)合物可以調(diào)節(jié)a-SMA、膠原IA2、PAI-1和MMP-2等的轉(zhuǎn)錄，繼而促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)，導(dǎo)致ECM成分的合成和沉積[13-14]。此外，也有越來越多的證據(jù)表明，TGF-β1可以通過Smad信號通路調(diào)控多種microRNAs(miRs)，進(jìn)而促進(jìn)腎纖維化的進(jìn)程[15]。而TGF-β1的非Smad通路，可刺激平行的下游信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)途徑，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)1/2、JNK和p38，以及生長和存活激酶，磷酸肌醇-3-激酶(phopshatidylinositol-3-kinase，PI3K)、Akt和小GTP結(jié)合蛋白(Ras、RhoA、Rac1和Cdc42)，Notch和Wnt/β-catenin途徑等，間接參與EMT、凋亡、分化和基質(zhì)形成[16]。本課題組前期在對足細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可通過ERK1/2通路增強(qiáng)足細(xì)胞中Cdk5的表達(dá)，而Smads通路并不參TGF-β1 對Cdk5的調(diào)節(jié)過程[3]。因此，我們推測，在系膜細(xì)胞，TGF-β1可能同樣通過非Smad通路調(diào)節(jié)Cdk5的表達(dá)，發(fā)揮對細(xì)胞外基質(zhì)合成的調(diào)控作用，其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上，我們的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1作用于人腎小球系膜細(xì)胞，可激活Cdk5，導(dǎo)致FN、Collagen Ⅳ表達(dá)增加。而抑制Cdk5后，可降低FN、Collagen Ⅳ的表達(dá)水平?？梢姡珻dk5在TGF-β1致腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)沉積中發(fā)揮了重要作用。抑制Cdk5表達(dá)及激酶活性的異常增高，可能是減緩慢性腎臟病腎小球纖維化的重要手段和治療靶點(diǎn)。我們的研究進(jìn)一步明確了TGF-β1促進(jìn)腎臟纖維化的作用機(jī)制，為探索腎臟纖維化的有效防治提供理論依據(jù)。