王 奕， 韓 濤， 張志強(qiáng)， 崔 剛， 廖 搴， 蔡恒烈

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第二大惡性腫瘤，嚴(yán)重危害著人們健康。 中國(guó)是HCC 的高發(fā)國(guó)家，發(fā)病人數(shù)約占全球HCC 患者總數(shù)的 55%［1］。 目前，盡管針對(duì) HCC 的診斷及治療取得了一定進(jìn)展， 但HCC 患者的5 年總生存率仍不足10%［2］。 有研究指出，對(duì)于相同腫瘤分期的 HCC，經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞（transhepaticarterialchemoembolization，TACE）的治療效果存在一定差異［3］。因此，早期評(píng)價(jià)HCC 治療效果，不僅可節(jié)約醫(yī)療資源，還可達(dá)到精準(zhǔn)治療的目的［3］。 文獻(xiàn)報(bào)道，微小核糖核酸-599（miR-599）參與了甲狀腺乳頭狀癌［4］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［5］和膀胱尿路上皮癌［6］等發(fā)病和進(jìn)展過(guò)程，并與預(yù)后有關(guān)。此外，miR-599 還可調(diào)節(jié)HCC 細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等過(guò)程［7-8］。 本研究選取 TACE 治療的 HCC患者作為研究對(duì)象， 分析miR-599 與預(yù)后的關(guān)系，以期為改善HCC 預(yù)后提供幫助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

納入 2016 年6 月至 2018 年 2 月在江西省萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院確診并接受治療的166 例HCC 患者，男 108 例，女 58 例；年齡為（62.2±4.7）歲，范圍為 48～70 歲。 Child-Pugh A 級(jí) 124 例，B 級(jí) 42 例；HBsAg 陽(yáng)性 137 例，陰性 29 例；甲胎蛋白≤400 μg/L 69 例，＞400 μg/L 97 例；腫瘤單發(fā) 63 例，多發(fā) 103 例；腫瘤直徑≤5 cm 87 例，＞5 cm 79 例；腫瘤分期：Ⅰb期 16 例，Ⅱ期 70 例，Ⅲa 期 80 例；TACE 次數(shù)：1 次111 例，2 次 26 例，3 次 29 例；索拉非尼：接受 19 例，未接受 147 例；血管侵犯：有 80 例，無(wú) 86 例。 HCC診斷參照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019 年版）》［9］，有典型的肝癌影像學(xué)表現(xiàn)，病灶＞2 cm 或肝占位性病灶經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查證實(shí)。 納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜80 歲；②接受TACE 治療；③簽署了知情同意書(shū)。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①Child-Pugh C 級(jí)；②臨床信息不完整；③合并其他惡性腫瘤；④合并血液系統(tǒng)疾??；⑤獲取血液樣本前接受了放化療、靶向治療或免疫治療等。

所有研究對(duì)象對(duì)研究?jī)?nèi)容知情同意，簽署知情同意書(shū)。 本研究經(jīng)江西省萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2016R-239KS）。

1.2 TACE 治療方案

術(shù)前檢查所有受試者血常規(guī)、尿常規(guī)、凝血功能等。 手術(shù)步驟：消毒、鋪巾，行局部麻醉，采用Seldinger 法由股動(dòng)脈入路插入導(dǎo)管至腹腔動(dòng)脈或肝總動(dòng)脈，行血管造影檢查，明確癌組織的供血情況；將化療藥奧沙利鉑（江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20064296，100 mg/m2）和 5-氟尿嘧啶（上海旭東海普藥業(yè)有限公司， 國(guó)藥準(zhǔn)字：H31020593，500 mg/m2）稀釋，緩慢灌注至癌組織的供血?jiǎng)用}，用乳化充分的超液化碘油（煙臺(tái)魯銀藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H37022398）和阿霉素（瀚暉制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H33021980，40 mg/m2）的混懸液栓塞，注入明膠海綿顆粒［杭州艾力康醫(yī)藥科技有限公司，國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014 第3771056 號(hào)］栓塞，直至癌組織供血?jiǎng)用}呈“干樹(shù)枝”狀；拔出導(dǎo)管和導(dǎo)管鞘，局部加壓止血。術(shù)后給予保肝、止吐等藥物治療，醫(yī)囑術(shù)后4 周復(fù)診，行CT 檢查，根據(jù)癌組織壞死情況制定后續(xù)治療方案，TACE 后腫瘤復(fù)發(fā)的患者，再次給予TACE 治療；TACE 治療無(wú)效的患者，聯(lián)合消融（本研究中不包含接受消融治療的患者）或靶向藥物。

1.3 miR-599 表達(dá)量檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)血清 miR-599 表達(dá)量［10］。抽取受試者TACE 術(shù)前1 d 和術(shù)后28 d 肘部靜脈血10 mL，離心后吸取上清液，置于 EP 管中，-80℃冰箱中保存。 實(shí)驗(yàn)步驟：取凍存的血清，解凍后用TRIzol 試劑（日本 Takara 公司）提取總 RNA，用 752型紫外分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器五廠有限公司）檢測(cè)RNA 純度； 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA；用 Q1600 型 PCR 儀（杭州柏恒科技有限公司）擴(kuò)增產(chǎn)物，條件為95 ℃10 min，95 ℃ 60 s，35 個(gè)循環(huán)，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s。miR-599 上游序列：5'-TAAGCTGACATGGGACAGG GAT- 3'， 下 游 序 列 ：5'- CTCCATATCGCACTTTA ATCTCTAACT-3'； 內(nèi)參 U6 上游序列：5'-CTCGCT TCGGCAGCACA-3'， 下游序列：5'-ACGCTTCACGA ATTTGCGT-3'。 選取同期參加體檢的20 名年齡、性別與HCC 患者匹配的健康人的樣本作為對(duì)照，用2-DDct法計(jì)算HCC 患者血清中miR-599 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 隨訪

采用復(fù)診和電話隨訪方式獲取受試者3 年生存結(jié)局，于受試者出院后1 個(gè)月復(fù)診，此后每3～6個(gè)月隨訪 1 次， 末次隨訪時(shí)間為2021 年 2 月 23日，中位隨訪時(shí)間為36（6～36）個(gè)月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，TACE 前、后 miR-599 的相對(duì)表達(dá)量比較用重復(fù)測(cè)量方差分析；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（Q1，Q3）表示，2 組間比較采用 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。用受試者工作特征（receiver operating characteristics，ROC）曲線下面積評(píng)價(jià)miR-599 診斷HCC 預(yù)后的價(jià)值。用Cox 回歸分析miR-599 與TACE 治療HCC預(yù)后的關(guān)系。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生存組和死亡組患者臨床特征比較

根據(jù)HCC 患者的3 年生存結(jié)局將其分為生存組113 例和死亡組53 例。 生存組和死亡組的年齡、性別構(gòu)成、HBsAg、腫瘤數(shù)目和接受TACE 治療次數(shù)構(gòu)成比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；生存組的 Child-Pugh A 級(jí)、AFP≤400 μg/L、腫瘤直徑≤5 cm、 腫瘤分期Ⅰb 期和接受索拉非尼治療的例數(shù)均高于死亡組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表1。

按1∶1 傾向性評(píng)分匹配（最鄰近原則）后，生存組和死亡組的年齡、 性別構(gòu)成、Child-Pugh 分級(jí)、HBsAg、AFP、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、腫瘤分期和接受TACE 治療次數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。 見(jiàn)表 1。

表1 生存組和死亡組患者的臨床特征比較

2.2 生存組和死亡組患者miR-599 相對(duì)表達(dá)量比較

生存組和死亡組患者miR-599 相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=66.799，P＜0.01），生存組術(shù)前、術(shù)后的miR-599 相對(duì)表達(dá)量均高于死亡組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)前、術(shù)后的 miR-599 相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=232.151，P＜0.01），生存組和死亡組的術(shù)后miR-599 相對(duì)表達(dá)量均較術(shù)前升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；生存結(jié)局和時(shí)間之間無(wú)交互作用（F=3.843，P=0.052）。 見(jiàn)表 2。

按1∶1 傾向性評(píng)分匹配（最鄰近原則）后，生存組和死亡組的miR-599 相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.267，P=0.001），生存組術(shù)前、術(shù)后的 miR-599 相對(duì)表達(dá)量均高于死亡組， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)前、術(shù)后的 miR-599 相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=37.369，P＜0.01），生存組和死亡組的術(shù)后miR-599 相對(duì)表達(dá)量均較術(shù)前升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；生存結(jié)局和時(shí)間之間無(wú)交互作用（F=1.258，P=0.269）。 見(jiàn)表 2。

表2 生存組和死亡組患者miR-599 相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 miR-599 診斷HCC 預(yù)后的價(jià)值分析

術(shù)前miR-599 診斷HCC 預(yù)后的ROC 曲線下面積高于術(shù)后miR-599，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.603，P=0.009），見(jiàn)表 3。

按1∶1 傾向性評(píng)分匹配（最鄰近原則）后，術(shù)前miR-599 診斷 HCC 預(yù)后的ROC 曲線下面積高于術(shù)后miR-599，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.961，P=0.337），見(jiàn)表 3。

表3 miR-599 診斷HCC 預(yù)后的價(jià)值分析

2.4 HCC 生存預(yù)后的Cox 回歸分析

將HCC 預(yù)后作為因變量，將年齡、性別、Child-Pugh 分級(jí)、HBsAg、AFP、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、腫瘤分期、TACE 次數(shù)、 接受索拉非尼治療和術(shù)前miR-599 作為自變量，分別納入Cox 回歸分析，結(jié)果顯示Child-Pugh 分級(jí)、AFP、腫瘤直徑、腫瘤分期和術(shù)前miR-599 與 HCC 預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。 將 HCC 預(yù)后作為因變量，將Child-Pugh 分級(jí)、AFP、腫瘤直徑、腫瘤分期、 術(shù)前miR-599 和接受索拉非尼治療作為自變量（納入標(biāo)準(zhǔn)為單因素Cox 回歸分析的P＜0.10 或已知與HCC 生存預(yù)后有關(guān)），一并納入Cox 回歸分析， 結(jié)果顯示腫瘤直徑＞5 cm 和腫瘤分期高是HCC 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），接受索拉非尼治療和術(shù)前miR-599 表達(dá)量高是HCC 預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05）。 見(jiàn)表 4。

表4 HCC 生存預(yù)后的Cox 回歸分析結(jié)果（傾向性評(píng)分匹配前）

按1∶1 傾向性評(píng)分匹配（最鄰近原則）后，將HCC預(yù)后作為因變量， 將年齡、 性別、Child-Pugh 分級(jí)、HBsAg、AFP、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、腫瘤分期、TACE次數(shù)和術(shù)前miR-599 作為自變量（1∶1 傾向性評(píng)分匹配后不包含接受索拉非尼治療的患者）， 分別納入Cox 回歸分析，結(jié)果顯示術(shù)前miR-599 與HCC 預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。將HCC 預(yù)后作為因變量，將腫瘤數(shù)目、腫瘤分期和術(shù)前miR-599 作為自變量一并納入Cox 回歸分析， 結(jié)果顯示術(shù)前miR-599 表達(dá)量高是HCC 預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05）。 見(jiàn)表 5。

表5 HCC 生存預(yù)后的Cox 回歸分析結(jié)果（傾向性評(píng)分匹配后）

3 討論

目前，已有多數(shù)miRNA 被報(bào)道與HCC 預(yù)后有關(guān)，如 miR-542-3p、miR-139 和 miR-100-5p 等［11-13］。本研究主要分析血清miR-599 與TACE 治療HCC 預(yù)后的關(guān)系。 既往文獻(xiàn)報(bào)道，接受TACE 治療的HCC患者3 年生存率為72.12%［14］，本研究中接受 TACE治療的HCC 患者3 年生存率為68.07%， 存在一定差異，其原因可能與樣本量大小、腫瘤分期構(gòu)成等有關(guān)。

為避免混雜因素影響統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究采用最鄰近原則進(jìn)行了1∶1 傾向性評(píng)分匹配，從生存組和死亡組中抽選臨床特征匹配的42 例患者進(jìn)行比較。 結(jié)果顯示，生存組和死亡組患者術(shù)后miR-599 相對(duì)表達(dá)量均較術(shù)前升高， 提示miR-599相對(duì)表達(dá)量與TACE 治療有關(guān)； 且生存組術(shù)前、術(shù)后的miR-599 相對(duì)表達(dá)量均高于死亡組， 提示術(shù)前、術(shù)后的miR-599 相對(duì)表達(dá)量與TACE 治療HCC預(yù)后有關(guān)，是HCC 預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。 本研究構(gòu)建了術(shù)前、 術(shù)后的miR-599 診斷HCC 預(yù)后的ROC 曲線，結(jié)果顯示術(shù)前miR-599 診斷HCC 預(yù)后的ROC 曲線下面積高于術(shù)后miR-599，提示術(shù)前miR-599 診斷HCC 預(yù)后的價(jià)值較術(shù)后miR-599 高；按1∶1 傾向性評(píng)分匹配（最鄰近原則）后，雖術(shù)前和術(shù)后的miR-599 診斷HCC 預(yù)后的ROC 曲線下面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 但術(shù)前miR-599 診斷HCC預(yù)后的ROC 曲線下面積高于術(shù)后miR-599，因此認(rèn)為術(shù)前miR-599 對(duì)HCC 預(yù)后評(píng)估有一定價(jià)值。

本研究用Cox 回歸分析了HCC 預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素， 結(jié)果顯示術(shù)前miR-599 是HCC 生存預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素；按1∶1 傾向性評(píng)分匹配（最鄰近原則）后， 結(jié)果亦顯示術(shù)前miR-599 表達(dá)量高仍是HCC預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。 推測(cè)其原因有以下兩點(diǎn)：一是過(guò)表達(dá)miR-599 可靶向MYC 抑制 HCC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［7］；二是過(guò)表達(dá) miR-599 可靶向富含絲氨酸/精氨酸剪接因子2 抑制HCC 細(xì)胞活力、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞周期停滯和凋亡［8］，miR-599 表達(dá)量與HCC 細(xì)胞的增殖、 凋亡、 侵襲和遷移等有關(guān)，進(jìn)而可反映HCC 患者TACE 治療獲益。

既往研究結(jié)果顯示， 腫瘤直徑和腫瘤分期與HCC 生存預(yù)后獨(dú)立相關(guān)［15-16］。本研究結(jié)果也顯示，腫瘤直徑＞5 cm 和腫瘤分期高是HCC 生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素， 接受索拉非尼治療是HCC 生存預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，與上述報(bào)道結(jié)果一致。按1∶1 傾向性評(píng)分匹配（最鄰近原則）后，結(jié)果顯示腫瘤直徑＞5 cm 和腫瘤分期高并非HCC 生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，推測(cè)該差異可能與傾向性評(píng)分匹配后樣本量小有關(guān)，后續(xù)還需增大樣本量，進(jìn)一步進(jìn)行分析。

綜上所述， 術(shù)前 miR-599 與 HCC 患者 TACE治療預(yù)后有關(guān)，其表達(dá)量低提示預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)高。 本研究尚存在一定不足， 如僅分析了血清miR-599 與TACE 治療的HCC 患者預(yù)后的關(guān)系，未分析其與接受其他治療方案的HCC 患者預(yù)后的關(guān)系， 后續(xù)將開(kāi)展大樣本、多中心研究進(jìn)行分析，以充實(shí)本研究結(jié)論。