王 娜，張 霞

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦科, 河北石家莊 050000）

宮頸癌是發(fā)生于子宮的惡性腫瘤，高居女性癌癥死亡率的第2位，且全球每年新増病例約50萬，嚴(yán)重威脅女性健康[1]?；瘜W(xué)治療是宮頸癌治療的重要方法之一，而現(xiàn)有的環(huán)磷酰胺、順鉑等化療藥物，長期使用會產(chǎn)生耐藥性，毒副作用嚴(yán)重，且治療效果也難以讓人滿意[2]。因此，新型宮頸癌治療藥物的開發(fā)迫在眉睫[3]。天然活性物質(zhì)由于療效確切及較低的毒副作用，在宮頸癌治療領(lǐng)域受到了研究者越來越多的關(guān)注。淫羊藿苷可以通過降低Toll樣受體4/髓樣分化因子 88/核因子κB（TLR4/MyD88/NF-κB）通路和 Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）通路影響宮頸癌炎癥、凋亡、侵襲和腫瘤免疫，進(jìn)而發(fā)揮治療宮頸癌作用[4]。藏紅花素通過激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路誘導(dǎo)子宮頸癌SiHa細(xì)胞自噬死亡，抑制細(xì)胞侵襲[5]。辣木生物堿具有抑制Hela細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其分子機(jī)制與阻斷Stat3信號通路的活化有關(guān)[6]。去甲氧基姜黃素也可以明顯降低HeLa細(xì)胞異種移植模型小鼠的腫瘤重量和體積，表明其可以抑制移植瘤的生長[7]。

甘草甜素（Glycyrrhizin）為甘草的主要功效成分，作為甜味劑廣泛用于各類食品中，具有抗氧化、抗炎等作用[8]。近年來，甘草甜素的抗腫瘤作用也逐漸引起了人們的關(guān)注，其相關(guān)研究主要集中在口腔癌[9]、前列腺癌[10]、肝癌[11]等。研究發(fā)現(xiàn)[12]，在宮頸癌CCa細(xì)胞中，甘草甜素可以介導(dǎo)Notch通路的下調(diào)，誘導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程的中斷。在宮頸癌HeLa細(xì)胞中，甘草甜素能夠誘導(dǎo)活性氧（ROS）依賴的細(xì)胞凋亡，并使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期[13]。目前，甘草甜素抗宮頸癌的研究主要集中在體外作用方面，而體內(nèi)抗宮頸癌研究報道較少；同時，既往的研究已經(jīng)證實甘草甜素具有良好的調(diào)節(jié)免疫及誘導(dǎo)凋亡作用[14?15]。因此，本研究通過建立U14宮頸癌小鼠模型，探討甘草甜素是否具有抑制U14宮頸癌小鼠腫瘤生長的作用，同時闡明該作用與調(diào)節(jié)免疫功能、誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)性，為今后應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠宮頸癌U14細(xì)胞系 購于上海賽默生物科技公司；雌性昆明種小鼠 60只，清潔級，體質(zhì)量20~22 g，購于北京維通利華公司[SCXK（京）2016-0011]，在溫度為22~24 ℃、相對濕度為50%~60%條件下常規(guī)條件飼養(yǎng)，自由飲水和飲食，12 h光照/12 h黑暗交替；甘草甜素（含量>95%） 西安朗德生物公司，批號20200516；環(huán)磷酰胺（含量>98%） 上海邁瑞爾化學(xué)公司，批號180115；白細(xì)胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及干擾素-γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測試劑盒 泉州睿信生物公司；TUNEL檢測試劑盒 美國羅氏公司；SYBR Green實時熒光定量PCR檢測試劑盒 美國賽默飛世爾公司；二奎啉甲酸（BCA）試劑盒 北京天恩澤基因科技有限公司；PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、AKT和磷酸化AKT（p-AKT）多克隆抗體 美國Abcam公司。

RD-20Ⅲ型高速冷凍離心機(jī) 日本TomySeiko公司；HEPA Class CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher公司；VICTOR-1429酶標(biāo)儀 美國PerkinElmer公司；UV-2100型分光光度計 上海UNICO儀器有限公司；FM-500倒置數(shù)碼熒光顯微鏡 上海普丹儀器公司；Quan Studio 3型定量PCR儀 美國賽默飛世爾公司；Mini-Protean小垂直板電泳儀 美國Biored公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模、分組及給藥 常規(guī)培養(yǎng)U14細(xì)胞，生長至對數(shù)期后接種于小鼠腹腔，1周處死小鼠并收集腹水。離心，細(xì)胞沉淀用生理鹽水稀釋至2×107個/mL。取0.2 mL細(xì)胞懸液接種于右側(cè)腋窩處，7 d內(nèi)異種移植瘤出現(xiàn)表示U14宮頸癌小鼠模型建立成功[16]。將成模小鼠隨機(jī)分為模型組、甘草甜素低、中、高劑量組（25、50、100 mg/kg）及環(huán)磷酰胺組（25 mg/kg），每組10只，其中甘草甜素的給藥劑量參考了文獻(xiàn)[17]并結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果而設(shè)定；未建模的10只小鼠設(shè)為正常組。于分組后次日開始灌胃給藥，1次/d，共21 d；正常組小鼠灌胃等體積的生理鹽水。在小鼠存活狀態(tài)下，用游標(biāo)卡尺分別記錄各組小鼠（n=10）在給藥第7、14和21 d的右側(cè)腋窩處瘤體積（最大直徑）。最后一次給藥24 h后，通過摘眼球法分離血清，頸椎脫位處死所有動物，立即收集瘤組織、胸腺及脾臟樣本。

1.2.2 抑瘤率、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)計算 取步驟“1.2.1”中分離的小鼠瘤組織、胸腺及脾臟樣本，精密稱重，分別計算抑瘤率、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)[16]。抑瘤率、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)的計算公式為：抑瘤率（%）=模型組瘤質(zhì)量-藥物處理組瘤質(zhì)量/模型組瘤質(zhì)量×100；胸腺指數(shù)（mg/g）=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量；脾臟指數(shù)（mg/g）=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.2.3 血清 IL-2、IFN-γ和 TNF-α含量檢測 取步驟“1.2.1”中分離的血清，使用ELISA檢測試劑盒檢測血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量，具體操作按說明書中的方法進(jìn)行。

1.2.4 腫瘤組織細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測 參考文獻(xiàn)[18]，用4%多聚甲醛固定腫瘤組織，經(jīng)石蠟包埋后，進(jìn)行4 μm厚度切片。按照試劑盒說明書中的操作指南，通過TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)的計算公式為：凋亡指數(shù)（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100。

1.2.5 腫瘤組織Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)檢測 檢測方法參考文獻(xiàn)[19]，采用Trizol法提取瘤組織RNA，定量后取2 μg RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃、10 s， 95 ℃、5 s， 60 ℃、20 s，共40個循環(huán)。各基因引物序列由上海生工合成。Caspase-3 引物序列：5’-GGA ACC ATC ATA CAT GGA AGC G-3’，5’-TCA CCA TGG CTC AGA AGC AC-3’；Bax引物序列：5’-AAC ATG GAG CTG CAG AGG AT-3’，5’-CAG TTG AAG TTG CCG TCA GA-3’；Bcl-2 引物序列：5’-GAG GAT TGT GGC CTT CTT TG-3’，5’-ACA GTT CCA CAA AGG CAT CC-3’；甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）引物序列：5’-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3’，5 ’-GGG GTC ATT GAT GGC AAC AAT A-3’。反應(yīng)結(jié)束后，采用2?△△CT法計算目的基因相對表達(dá)量。

1.2.6 腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)檢測檢測方法參考文獻(xiàn)[20]，腫瘤組織經(jīng)研磨及冰上裂解后，提取總蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行定量。各組取等量蛋白，煮沸10 min，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)前沿至分離膠底部時，結(jié)束電泳。轉(zhuǎn)膜，用脫脂牛奶室溫封閉 2 h；加入抗 PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT多克隆抗體，稀釋倍數(shù)均為1:1000；4 ℃下孵育過夜。洗膜后，加入相應(yīng)的二抗（1:2000），室溫繼續(xù)封閉2 h，電化學(xué)發(fā)光法顯色。顯影、拍照，通過Image J分析灰度值，并計算p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差“±S”表示，采用單因素方差分析及t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠瘤體積（最大直徑）、瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響

在給藥初期，各組小鼠進(jìn)食等行為活動正常，精神狀態(tài)良好。在給藥后期，模型組小鼠右上肢活動受限，皮毛光澤度變差，反應(yīng)遲鈍，精神狀態(tài)萎靡；甘草甜素各劑量組小鼠行為活動、精神狀態(tài)等情況均好于模型組；環(huán)磷酰胺組小鼠身體消瘦，飲水、飲食活動減少；正常組小鼠各方面均無異常。

分別記錄給藥第7、14和21 d時的瘤體積（最大直徑），發(fā)現(xiàn)甘草甜素低、中劑量組在第14、21 d及甘草甜素高劑量組小鼠在第7、14、21 d時的瘤體積（最大直徑）均小于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；同時，甘草甜素各劑量組小鼠的瘤質(zhì)量與模型組比較，均明顯降低（P<0.05或P<0.01），其抑瘤率分別為15.68%、25.41%和38.38%。與模型組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠在第7、14、21 d時的瘤體積（最大直徑）、瘤質(zhì)量均明顯降低（P<0.05或P<0.01），其抑瘤率為50.81%。結(jié)果見表1。以上結(jié)果表明甘草甜素具有抑制U14宮頸癌小鼠腫瘤生長的作用，雖然其抑瘤效果弱于陽性藥物環(huán)磷酰胺，但由于較低的毒副作用，仍具有潛在的應(yīng)用前景。

表1 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠瘤體積（最大直徑）、瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響（±S，n=10）Table 1 Influence of glycyrrhiza on tumor volume (maximum diameter), tumor weight and tumor inhibition rate in U14 cervical cancer mice (±S, n=10)

表1 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠瘤體積（最大直徑）、瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響（±S，n=10）Table 1 Influence of glycyrrhiza on tumor volume (maximum diameter), tumor weight and tumor inhibition rate in U14 cervical cancer mice (±S, n=10)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；表4、表5同。

組別 瘤體積（最大直徑）（mm） 瘤質(zhì)量（g） 抑瘤率（%）7 d 14 d 21 d正常組 — — — — —模型組 2.66±0.34 5.94±0.75 8.41±1.05 1.85±0.34 —甘草甜素低劑量組 2.47±0.43 5.23±0.70* 6.82±0.96* 1.56±0.21* 15.68甘草甜素中劑量組 2.31±0.39 5.02±0.54** 6.06±0.85** 1.38±0.23** 25.41甘草甜素高劑量組 2.06±0.28* 4.75±0.63** 5.39±0.63** 1.14±9.18** 38.38環(huán)磷酰胺組 1.98±0.24* 4.26±0.51** 4.48±0.72** 0.91±0.12** 50.81

2.2 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

調(diào)節(jié)免疫功能是天然化合物治療癌癥的主要機(jī)制之一[21]。胸腺和脾臟均為機(jī)體內(nèi)重要的免疫器官，其指數(shù)可以作為機(jī)體免疫功能的重要參數(shù)。表2結(jié)果表明，與正常組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)降低（P<0.01）；與模型組比較，甘草甜素低、中、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)升高（P<0.05或P<0.01），而環(huán)磷酰胺由于具有一定的免疫抑制作用，該組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)降低（P<0.01）。在Lewis 肺癌小鼠模型中，消巖湯可以使模型小鼠的脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)升高，而環(huán)磷酰胺使脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)降低[22]，與本研究的結(jié)論相符。以上結(jié)果提示，甘草甜素在一定程度上可以促進(jìn)U14宮頸癌小鼠胸腺和脾臟的發(fā)育，提高免疫功能。

表2 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響（±S，n=10）Table 2 Influence of glycyrrhiza on thymus index and spleen index in U14 cervical cancer mice (±S, n=10)

表2 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響（±S，n=10）Table 2 Influence of glycyrrhiza on thymus index and spleen index in U14 cervical cancer mice (±S, n=10)

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；表3同。

組別 胸腺指數(shù)（mg/10 g） 脾臟指數(shù)（mg/10 g）正常組 26.79±3.12 81.25±7.66模型組 15.17±2.43## 56.53±7.53##甘草甜素低劑量組 20.22±3.67** 64.82±8.51*甘草甜素中劑量組 23.74±2.72** 69.60±7.23**甘草甜素高劑量組 27.61±4.14** 72.48±8.65**環(huán)磷酰胺組 11.14±1.09** 38.79±4.02**

表3 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠血清 IL-2、IFN-γ和TNF-α含量的影響（±S，n=10）Table 3 Influence of glycyrrhiza on serum IL-2, IFN-γ and TNF-α contents in U14 cervical cancer mice (±S, n=10)

表3 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠血清 IL-2、IFN-γ和TNF-α含量的影響（±S，n=10）Table 3 Influence of glycyrrhiza on serum IL-2, IFN-γ and TNF-α contents in U14 cervical cancer mice (±S, n=10)

組別 IL-2（ng/L） IFN-γ（ng/L） TNF-α（ng/L）正常組 6.15±0.79 2.58±0.32 130.41±16.33模型組 4.14±0.52## 2.08±0.34## 254.78±30.23##甘草甜素低劑量組 4.67±0.79* 2.52±0.35** 345.33±42.11**甘草甜素中劑量組 5.20±0.61** 2.71±0.46** 368.29±35.48**甘草甜素高劑量組 5.52±0.82** 3.13±0.26** 419.54±48.72**環(huán)磷酰胺組 4.78±0.57** 2.56±0.40** 386.61±37.35**

2.3 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量的影響

IL-2、IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子在機(jī)體的抗腫瘤免疫中具有重要作用，本實驗采用ELISA法檢測了各組小鼠血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量，結(jié)果如表3所示。與正常組比較，模型組小鼠血清IL-2、IFN-γ明顯降低，TNF-α含量明顯增高（P<0.01）；與模型組比較，甘草甜素低、中、高劑量組及環(huán)磷酰胺組小鼠血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。IL-2可以促進(jìn) T淋巴細(xì)胞的增殖，而IFN-γ具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤、抗病毒作用[23]。TNF-α能夠激活NK細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞等釋放IFN-γ，抑制腫瘤細(xì)胞的生長；TNF-α也可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管再生、腫瘤細(xì)胞侵襲等作用加速腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其抗腫瘤作用還存在爭議[24?25]。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，甘草甜素抑制U14宮頸癌小鼠腫瘤生長的作用與調(diào)節(jié)免疫功能有關(guān)。

2.4 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

增殖與凋亡失衡會引起腫瘤，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是當(dāng)前臨床常用抗腫瘤藥物的主要作用機(jī)理[26]。研究發(fā)現(xiàn)[27]，甘草甜素能夠抑制人舌癌Cal-27細(xì)胞株的增殖，并促進(jìn)其凋亡。本研究通過TUNEL染色法檢測甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響，結(jié)果如圖1所示。模型組、甘草甜素低、中、高劑量組及環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為（5.37%±0.85%）、（11.43%±1.54%）、（19.60%±2.12%）、（30.77%±4.48%）和（38.05%±5.19%），各給藥組與模型組比較，具有顯著性差異（P<0.01），提示甘草甜素具有誘導(dǎo)U14宮頸癌小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的作用。

圖1 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響（400×）Fig.1 Influence of glycyrrhiza on tumor tissue apoptosis index in U14 cervical cancer mice (400×)

2.5 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

Caspase家族由多種與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白酶構(gòu)成，在腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵地位，而Caspase-3是最為核心的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者；Bcl-2家族由Bax等促凋亡因子和Bcl-2等凋亡抑制因子構(gòu)成，廣泛參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[28]。高硯春等[29]發(fā)現(xiàn)，甘草甜素具有抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長的作用，下調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)、上調(diào)Caspase-3、BaxmRNA是其發(fā)揮抑制作用的主要機(jī)制。本研究采用實時定量PCR法檢測甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果如表4所示。與模型組比較，甘草甜素低、中、高劑量組及環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤細(xì)胞Caspase-3及BaxmRNA表達(dá)增加（P<0.05或P<0.01），而Bcl-2 mRNA表達(dá)降低（P<0.05或P<0.01），進(jìn)一步在分子水平證實甘草甜素具有誘導(dǎo)U14宮頸癌小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的作用。

表4 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響（±S，n=10）Table 4 Influence of glycyrrhiza on tumor tissue Caspase-3,Bax and Bcl-2 mRNA levels in U14 cervical cancer mice (±S,n=10)

表4 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響（±S，n=10）Table 4 Influence of glycyrrhiza on tumor tissue Caspase-3,Bax and Bcl-2 mRNA levels in U14 cervical cancer mice (±S,n=10)

組別 Caspase-3 mRNA Bax mRNA Bcl-2 mRNA模型組 0.42±0.05 0.84±0.09 1.11±0.13甘草甜素低劑量組 0.61±0.08** 0.98±0.11* 0.95±0.08*甘草甜素中劑量組 0.63±0.06** 1.06±0.13** 0.81±0.12**甘草甜素高劑量組 0.77±0.07** 1.27±0.15** 0.83±0.11**環(huán)磷酰胺組 0.86±0.10** 1.40±0.14** 0.64±0.08**

2.6 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)的影響

調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡除了與相關(guān)基因聯(lián)系密切外，PI3K/AKT信號通路在惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)程中也扮演著重要角色[30]。AKT受PI3K的正反饋調(diào)控影響，是PI3K的下游蛋白，為蛋白激酶，其磷酸化水平越高，證明惡性腫瘤細(xì)胞的增殖能力及抗凋亡能力就越強(qiáng)[31]。本研究采用Western Blot法檢測了甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果如圖2及表5所示。與模型組比較，甘草甜素低、中、高劑量組及環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），表明甘草甜素具有阻斷PI3K/AKT信號通路活化的作用。

表5 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)的影響（± S，n=10）Table 5 Influence of glycyrrhiza on tumor tissue p-PI3K and p-AKT expressions in U14 cervical cancer mice (± S, n=10)

表5 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)的影響（± S，n=10）Table 5 Influence of glycyrrhiza on tumor tissue p-PI3K and p-AKT expressions in U14 cervical cancer mice (± S, n=10)

組別 p-PI3K/PI3K p-AKT/AKT模型組 1.24±0.23 1.65±0.24甘草甜素低劑量組 0.93±0.14** 1.46±0.21*甘草甜素中劑量組 0.51±0.08** 1.32±0.15**甘草甜素高劑量組 0.37±0.05** 0.89±0.10**環(huán)磷酰胺組 0.18±0.03** 0.34±0.04**

圖2 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Influence of glycyrrhiza on tumor tissue p-PI3K and p-AKT expressions in U14 cervical cancer mice

3 討論與結(jié)論

多種藥物及食品中的有效成分均可以通過提高免疫力而發(fā)揮抗腫瘤作用。紅茶多酚能夠抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長，其機(jī)制可能與提高抗氧化能力及增強(qiáng)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)活性有關(guān)[32]。黃酒多糖也能改善S180荷瘤小鼠的免疫功能，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[33]。張夢欣等[34]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘草甜素也可以通過提高巨噬細(xì)胞百分比發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本研究通過建立U14宮頸癌小鼠模型，灌胃給予不同劑量的甘草甜素后，發(fā)現(xiàn)甘草甜素可以升高胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，增加血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量，進(jìn)一步證實甘草甜素的抑瘤作用同樣與改善免疫功能有關(guān)。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是天然活性物質(zhì)發(fā)揮抗腫瘤作用的重要途徑[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，甘草甜素各劑量組凋亡指數(shù)及Caspase-3、BaxmRNA表達(dá)均增加，Bcl-2 mRNA表達(dá)降低，表明甘草甜素具有誘導(dǎo)U14宮頸癌小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的作用。PI3K/AKT信號通路在腫瘤組織中異常激活，而阻斷PI3K/AKT信號通路的激活，可以加速腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用[36]。研究發(fā)現(xiàn)，甘草甜素能夠通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[37]。此外，甘草甜素促進(jìn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯作用也與抑制PI3K/AKT信號通路有關(guān)[38]。本研究結(jié)構(gòu)同樣發(fā)現(xiàn)，甘草甜素低、中、高劑量組小鼠腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)水平降低，進(jìn)一步表明阻斷PI3K/AKT信號通路的活化進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是甘草甜素發(fā)揮抗腫瘤作用的潛在機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素具有抑制U14宮頸癌小鼠腫瘤生長的作用，且證實該作用與改善免疫功能及誘導(dǎo)凋亡作用有關(guān)，其在宮頸癌治療領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價值。