吳 蘋，劉晉倩，董 晶，王 碩，范宗強(qiáng)，李 震，王帥珂，陳 芳,

（1.聊城大學(xué)藥學(xué)院, 山東聊城 252059；2.聊城人民醫(yī)院, 山東聊城 252059）

魚腥草屬三白草科，是一種多年生草本植物[1]，在中醫(yī)應(yīng)用上歷史悠久。魚腥草含有多種化合物，包括多糖、脂肪酸、多酚、黃酮類化合物和甾醇類化合物等[2]，傳統(tǒng)上魚腥草的提取物可被用于預(yù)防或治療炎癥性疾病[3]。魚腥草多糖是魚腥草的主要活性成分之一，大量科學(xué)研究證明，魚腥草多糖具有消炎抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)腸道等多種活性功能[2,4]。

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種炎癥性腸病，主要在結(jié)腸的遠(yuǎn)端靠近直腸的部位發(fā)病，通過在腸黏膜和黏膜下層形成潰瘍面而產(chǎn)生連續(xù)性炎癥反應(yīng)[5]。這種病的臨床癥狀主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的腹痛、腹瀉和便血。自21世紀(jì)以來，該病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷呈上升趨勢(shì)[6]。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制目前還不清楚，研究表明其發(fā)病病因與遺傳、環(huán)境、免疫[7?8]以及腸道菌群有關(guān)。目前，該病主要以抗炎和免疫調(diào)節(jié)為主，以生物制劑治療為輔。但藥物治療在緩解疾病癥狀的同時(shí)常伴有許多副作用，而天然藥物治療結(jié)腸炎能有效緩解副作用。因此，從天然資源中開發(fā)創(chuàng)新有效的藥物對(duì)減少副作用和改善治療效果尤為重要。

目前，有文獻(xiàn)報(bào)道天然多糖對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎有顯著的緩解作用[9?11]，例如有研究表明[12]魚腥草粗多糖能夠改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腹瀉和糞便粘稠、不定型等腸炎癥狀，但是魚腥草多糖對(duì)該病的作用機(jī)制尚不清楚。本課題組前期探索了魚腥草粗多糖對(duì)結(jié)腸炎功能恢復(fù)的可行性[12]，現(xiàn)通過對(duì)結(jié)腸炎小鼠灌胃魚腥草多糖，探索其對(duì)結(jié)腸炎的治療效果及作用機(jī)制，為開發(fā)具有抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的功能性食品或保健品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚腥草多糖 （含量98%） 楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司；葡聚糖硫酸鈉鹽（MW36000-50000） 上海翊圣生物科技有限公司；KM小鼠，SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（魯）20190003，體重 16~20 g，雄性濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。小鼠在動(dòng)物房正常飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境7 d，自由飲食普通飼料，19~23 ℃，光暗周期 12/12 h；TNF-α試劑盒、IFN-γ試劑盒、IL-1β試劑盒、IL-6試劑盒 武漢云克隆科技股份有限公司；肌酐（CR）試劑盒、血尿素氮（BUN）試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘇木精伊紅（HE）染色試劑盒 杭州碧云天公司；乙醇分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

SF-400A 型電子稱 奧豪斯儀器（上海）有限公司；DP-80正置顯微鏡 日本Olympus公司；8S-1型磁力攪拌器 江蘇省金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；MY-10手持式勻漿儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；HFU 40400BA型超低溫冰箱 美國Thermo公司；5425R型低溫離心機(jī) 德國eppendorf公司；Synergy H1酶標(biāo)儀 美國BIOTEK公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立以及治療方案 適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按平均體重?zé)o顯著性差異分為5組，每組 10只，分別為空白組 Control、模型組DSS、多糖低劑量組DSS+HCP（L）、多糖高劑量組DSS+HCP（H）和陽性藥物組DSS+SASP。除空白組外，其余4組自由連續(xù)飲用2.5%的DSS溶液9 d，然后再給予蒸餾水3 d，建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型[13]。從第13 d開始，空白組和DSS組分別給予蒸餾水溶液，陽性藥物組給予SASP 9 mg/kg/d灌胃, 經(jīng)過本課題組前期劑量初篩確定，魚腥草多糖組分別給予低劑量1 g/kg/d和高劑量2 g/kg/d灌胃，共飼喂6 d。飼養(yǎng)過程中每3 d記錄體重和疾病活動(dòng)指數(shù)。第19 d，在小鼠空腹12 h后用戊巴比妥鈉麻醉后處死，對(duì)小鼠進(jìn)行眼球取血，在4 ℃下3000 r/min離心10 min后取上清，在?80 ℃保存用于生化分析。同時(shí)收集小鼠的結(jié)腸組織，測(cè)量結(jié)腸長度后一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，一部分保存于?80 ℃進(jìn)行生化分析。最后收集小鼠解剖前24 h的新鮮糞便，用于腸道菌群的檢測(cè)。

1.2.2 疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)的評(píng)估 參考LI等[14]的方法，對(duì)造模后小鼠的體重、糞便黏度和便血的情況進(jìn)行評(píng)分(表1)，每3 d記錄一次疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分，以評(píng)估結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，評(píng)分的每一項(xiàng)指數(shù)均按0~4分進(jìn)行評(píng)分，0分表示無疾病癥狀，4分表示嚴(yán)重疾病癥狀。具體標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard of mice disease activity index（DAI）score

1.2.3 小鼠結(jié)腸長度及結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 用分度值為1 mm的直尺測(cè)量小鼠從盲腸到肛門的結(jié)腸長度；采用蘇木精和伊紅(HE)染色法分析結(jié)腸組織病理變化。對(duì)取出的小鼠結(jié)腸組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h后進(jìn)行乙醇脫水，再經(jīng)乙醇和二甲苯脫水，用石蠟包埋制成蠟塊。將蠟塊用切片機(jī)制備5 μm切片并用HE法染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織的病理變化。

1.2.4 炎癥因子、肝腎功能指標(biāo)測(cè)定 小鼠進(jìn)行眼球取血，在4 ℃下3000 r/min離心10 min后取上清液，然后將上清液在?80℃下保存用于生化分析。對(duì)收集的血清使用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行炎癥因子、肝腎功能指標(biāo)測(cè)定。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒說明書操作步驟，檢測(cè)各組小鼠血清中的炎癥細(xì)胞因子 (TNF-α、IFN-γ、IL-1β和 IL-6)水平，同時(shí)采用試劑盒檢測(cè)肝腎功能指標(biāo)(ALT、AST、CR和BUN)。

1.2.5 腸道菌群16S rRNA測(cè)序及生物信息學(xué)分析結(jié)腸炎是由腸道共生菌群或其代謝物侵入腸道屏障，驅(qū)動(dòng)免疫細(xì)胞的激活和分化而引發(fā)的[15]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的16S核糖體RNA檢測(cè)分析[16?17]，收集的小鼠糞便由NovoMagic有限公司進(jìn)行16S rRNA分析，以便確定HCP對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有數(shù)據(jù)均采用IBM spss 24統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和卡方檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖形分析采用Graph Pad Prism 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚腥草多糖對(duì)結(jié)腸炎小鼠體重和DAI的影響

在飲用2.5% DSS溶液9 d后，與空白組相比，模型組小鼠出現(xiàn)了體重下降、半稀便、大便隱血以及肛門便血的癥狀，這些現(xiàn)象表明，小鼠結(jié)腸炎模型造模成功。如圖1-A所示，空白組小鼠的體重一直處于上升趨勢(shì)，模型組在第6 d出現(xiàn)體重下降。經(jīng)魚腥草多糖和陽性藥物干預(yù)后，小鼠體重逐漸升高。實(shí)驗(yàn)第15 d，與模型組相比，魚腥草多糖高劑量組和陽性藥物組小鼠體重極顯著增加（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)第18 d，與模型組相比，魚腥草多糖低、高劑量組和陽性藥物組體重均增加，差異極顯著（P<0.01）。其中，多糖低劑量、高劑量兩組的體重?zé)o顯著性差異；陽性藥物組和多糖低劑量組差異顯著（P<0.05），與多糖高劑量組無顯著性差異。這表明魚腥草多糖可以改善小鼠結(jié)腸炎所導(dǎo)致的體重下降，且各劑量組間的效果呈劑量依賴性。

圖1 魚腥草多糖對(duì)DSS結(jié)腸炎小鼠體重和DAI的影響Fig.1 Effect of HCP on the body weight and DAI of DSS induced ulcerative colitis in mice

DAI評(píng)分對(duì)評(píng)估結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度具有指導(dǎo)意義[14,18]，評(píng)分反映了小鼠體重變化、糞便稀軟程度以及糞便出血情況的總和，分值越高說明結(jié)腸炎越嚴(yán)重。從圖1-B可以看到，造模期間模型組DAI評(píng)分明顯高于空白組（P<0.01），經(jīng)魚腥草多糖和陽性藥物干預(yù)后，魚腥草多糖組和陽性藥物組DAI評(píng)分明顯下降。比較最后一天DAI時(shí)發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組評(píng)分明顯升高，差異極顯著（P<0.01）。與模型組相比，多糖組和陽性對(duì)照組DAI評(píng)分明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。這說明魚腥草多糖能緩解結(jié)腸炎小鼠體重下降，減輕腹瀉和便血現(xiàn)象。

2.2 魚腥草多糖對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響

潰瘍性結(jié)腸炎會(huì)導(dǎo)致小鼠腸壁增厚，結(jié)腸長度縮短，因此結(jié)腸長度也是評(píng)價(jià)潰瘍性結(jié)腸炎的一個(gè)間接指標(biāo)[19]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白組的平均結(jié)腸長度最長，為（11.65±0.59）cm，與空白組相比，模型組結(jié)腸長度明顯收縮，平均長度為（6.48±0.32）cm，具有極顯著性差異（P<0.01，圖2A~B）。與模型組相比，魚腥草多糖低劑量和高劑量組的結(jié)腸長度顯著增加，平均長度分別為（8.45±0.27）cm 和（9.51±0.34）cm；SASP組為（9.77±0.53）cm。以上數(shù)據(jù)表明，魚腥草多糖給藥處理能改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的病理狀況。

圖2 魚腥草多糖對(duì)DSS結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響Fig.2 Effect of HCP on the colonic longth of DSS induced ulcerative colitis in mice

2.3 結(jié)腸組織病理學(xué)分析

通過HE染色法觀察分析各組小鼠結(jié)腸組織病理的變化。如圖3所示，空白組小鼠結(jié)腸組織的黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整清晰，腺體排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤。模型組小鼠的結(jié)腸組織存在隱窩變形、杯狀細(xì)胞丟失、炎癥細(xì)胞浸潤和嚴(yán)重的黏膜損傷。魚腥草多糖低劑量組有少量的潰瘍面和炎癥細(xì)胞浸潤，與模型組相比黏膜病變有一定程度的減輕；多糖高劑量組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)較完整，潰瘍面不明顯，但仍存在輕微炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象；陽性藥物組潰瘍面不明顯，幾乎無炎癥細(xì)胞浸潤。這說明魚腥草多糖減輕了DSS所致的黏膜病變，保護(hù)了結(jié)腸組織。

圖3 DSS結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織切片HE染色 (4X)Fig.3 HE staining of intestinal tissue sections of DSS induced ulcerative colitis in mice (4X)

2.4 魚腥草多糖對(duì)結(jié)腸炎小鼠炎癥因子的影響

研究表明，結(jié)腸炎與促炎細(xì)胞因子（包括TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IFN-γ）的上調(diào)和抗炎細(xì)胞因子（IL-4、IL-10）的下調(diào)有關(guān)[5]。結(jié)果如圖4所示，與空白組相比，模型組小鼠血清中促炎因子IFN-γ、IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著增加，差異極顯著(P<0.01)。與模型組相比，魚腥草多糖低、高劑量組以及陽性藥物組小鼠血清中 IFN-γ、IL-1β、IL-6 和 TNF-α的水平明顯降低(P<0.01)，給藥組間差異不明顯。結(jié)果表明 DSS組的小鼠血清 IFN-γ、IL-1β、IL-6和 TNF-α水平明顯增加，而魚腥草多糖一定程度地下調(diào)了促炎因子的含量，說明魚腥草多糖對(duì)DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎有明顯的抗炎作用。

圖4 魚腥草多糖對(duì)DSS結(jié)腸炎小鼠炎癥細(xì)胞因子的影響Fig.4 Effect of HCP on the inflammatory factors of DSS induced ulcerative colitis in mice

2.5 魚腥草多糖對(duì)結(jié)腸炎小鼠肝腎功能指標(biāo)的影響

在小鼠肝腎功能相關(guān)血清生化指標(biāo)中，血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性反映肝細(xì)胞損傷程度[20]，肝細(xì)胞損傷越嚴(yán)重，血清中AST、ALT的水平越高。如圖5A~B所示，與空白組相比，模型組ALT、AST水平明顯升高(P<0.01)。相反，與模型組相比，多糖低劑量和多糖高劑量組顯著降低了小鼠血清中AST和ALT的水平(P<0.01)。這說明多糖處理具有保護(hù)肝臟受損的作用。血清肌酐（CR）、血尿素氮（BUN）均通過腎臟進(jìn)行代謝，其濃度越高表明腎臟損傷越嚴(yán)重[21]。如圖5C~D所示，與空白組相比，模型組血清中CR、BUN的水平均明顯升高，差異極顯著(P<0.01)。給藥干預(yù)后，與模型組相比，魚腥草多糖組及陽性藥物組中CR水平均極顯著降低(P<0.01)，并且給藥組間差異不明顯；如圖5D所示，與模型組相比，魚腥草多糖高劑量組和陽性藥物組的BUN水平均出現(xiàn)極顯著下降（P<0.01)，多糖低劑量組則顯著下降（P<0.05)，多糖的治療效果呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。以上結(jié)果表明，模型組結(jié)腸炎小鼠ALT、AST、CR和BUN的水平明顯增加，說明小鼠的肝腎產(chǎn)生了一定程度的損傷，而用魚腥草多糖干預(yù)后，小鼠體內(nèi)ALT、AST、CR和BUN水平明顯減少，說明魚腥草多糖在保護(hù)肝腎功能方面具有一定的作用。

圖5 魚腥草多糖對(duì)DSS結(jié)腸炎小鼠肝腎生化指標(biāo)的影響Fig.5 Effect of HCP on the liver and kidney biochemical indexs of DSS induced ulcerative colitis in mice

2.6 魚腥草多糖對(duì)結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的影響

本研究采用稀釋性曲線（Rarefaction curve）來比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，在圖6A中，物種的稀釋性曲線最后趨于平滑，說明該樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是合理的[22]。與空白組相比，模型組的物種豐富度較低；與模型組相比，魚腥草多糖低劑量和高劑量組的物種豐富度升高，并趨向于空白組，這說明魚腥草多糖能提高結(jié)腸炎小鼠的物種豐富度。研究中采用豐度等級(jí)圖（Rank-abundance）曲線來比較物種豐富度和物種均勻度。在圖6B中，與空白組比較，模型組腸道菌群物種豐度降低，與模型組比較，魚腥草多糖低劑量和高劑量組菌群物種豐度升高。以上結(jié)果表明，魚腥草多糖具有保護(hù)腸道菌群的潛在作用。

同時(shí)，本研究采用主坐標(biāo)分析（Principal coordinate analysis，PCoA）檢測(cè)樣本間菌群豐度整體差異。PCoA是對(duì)多維的微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，從而在不同的角度表征這兩個(gè)樣本間的群落差異[23]。各組樣本OUT豐度的PCoA分析結(jié)果顯示，各組間區(qū)分明顯，表明模型組及藥物干預(yù)組等可影響腸道菌群的豐度及結(jié)構(gòu)。圖6C中，與空白組相比，模型組與陽性藥物組分散較遠(yuǎn)，表明模型組和陽性藥物組菌群結(jié)構(gòu)較空白組變化大，而魚腥草多糖低劑量和高劑量組則向空白組靠攏，說明魚腥草多糖可促進(jìn)腸道菌群豐度和結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。

DSS處理后，小鼠腸道屏障受損，腸道環(huán)境改變，導(dǎo)致腸道菌群組成發(fā)生改變[24]。有研究報(bào)道變形菌門(Proteobacteria)[25]和擬桿菌門(Bacteroidetes)[26]可促進(jìn)腸道產(chǎn)生過量的促炎細(xì)胞因子，二者是結(jié)腸炎主要的致病菌門。如圖6D所示，從門水平主要的10個(gè)菌門可以看出，占比較多的菌門有厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門和變形菌門。與空白組相比，模型組的厚壁菌門的相對(duì)豐度顯著降低，而擬桿菌門和變形菌門的相對(duì)豐度顯著升高。與模型組相比，魚腥草多糖處理組中變形菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著降低，而厚壁菌門水平明顯升高。值得一提的是，與模型組相比，陽性藥物組的厚壁菌門和擬桿菌門的水平?jīng)]有明顯變化，這可能是由于柳氮磺胺吡啶副作用的表現(xiàn)，柳氮磺胺吡啶會(huì)被結(jié)腸內(nèi)部細(xì)菌的偶氮還原酶分解產(chǎn)生磺胺吡啶，長時(shí)間服用產(chǎn)生過量的磺胺吡啶可能破壞了腸道內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致有害菌擬桿菌門的水平升高。這說明魚腥草多糖處理組中促炎因子水平的降低也可能與腸道中變形菌門和擬桿菌門的降低有關(guān)。

圖6 魚腥草多糖對(duì)DSS結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的影響Fig.6 Effect of HCP on the intestinal microbial distribution of DSS induced ulcerative colitis in mice

Bray-Curtis距離是反映兩個(gè)群落之間差異性的常用指標(biāo)。本研究基于物種信息的 Bray-Curtis距離分析，用來比較各樣品間基于群落組成的層次聚類，由圖6E可見，空白組和魚腥草多糖低劑量組的距離最近，其次是多糖高劑量組。這表明空白組和魚腥草多糖組之間的群落組成的層次聚類差異性較小。而空白組和模型組的Bray-Curtis距離較遠(yuǎn)，表明這兩組樣品間的群落組成的層次聚類差異較大。

3 結(jié)論

潰瘍性結(jié)腸炎的病因和發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，其中腸道免疫功能失衡是導(dǎo)致結(jié)腸炎的重要因素，主要表現(xiàn)為促炎因子和抗炎因子水平不平衡[27]。腸道菌群的多樣性減少以及結(jié)構(gòu)失調(diào)也會(huì)破壞腸道穩(wěn)態(tài)，加重腸道的炎癥反應(yīng)[28]。

本研究表明，魚腥草多糖不僅減輕了潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的體重減輕、腹瀉便血及腸道損傷等病理癥狀，而且明顯減輕了小鼠因飲用DSS而導(dǎo)致的肝腎損傷。促炎細(xì)胞因子參與調(diào)控結(jié)腸炎的發(fā)生和發(fā)展[29?30]，病人一旦發(fā)病往往伴隨著促炎細(xì)胞因子水平的升高，因此下調(diào)促炎因子水平是治療該病的一種策略。本研究發(fā)現(xiàn)魚腥草多糖能抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α等炎癥因子，降低促炎細(xì)胞因子的水平，這與臨床上使用TNF-α抑制劑改善急性結(jié)腸炎[31]具有相似性。這說明魚腥草多糖降低小鼠DAI以及緩解組織病理損傷可能與調(diào)節(jié)炎癥因子水平相關(guān)。

魚腥草多糖改善結(jié)腸炎的作用還可能與其影響小鼠的腸道菌群有關(guān)。變形菌門[25]和擬桿菌門[26]參與調(diào)控結(jié)腸炎的發(fā)病，可通過促進(jìn)產(chǎn)生過量的促炎因子增加腸道的炎癥反應(yīng)。魚腥草多糖能顯著降低兩者的相對(duì)豐度，調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，維持微生物穩(wěn)態(tài)，這可能也是減輕炎癥的一個(gè)作用方面。此外，魚腥草多糖還可能影響了腸道菌群代謝產(chǎn)物的含量，如短鏈脂肪酸，通過代謝產(chǎn)物發(fā)揮抗炎保護(hù)作用，目前本課題組正開展相關(guān)的工作，以期進(jìn)一步闡明魚腥草多糖對(duì)結(jié)腸炎的作用機(jī)制。

綜上所述，魚腥草多糖對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用與炎癥因子水平和腸道菌群結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。本研究揭示了魚腥草多糖改善腸道損傷、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平、恢復(fù)腸道菌群結(jié)構(gòu)的可能機(jī)制，可為開發(fā)預(yù)防結(jié)腸炎的功能性食品或保健品提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。