鄭傳癡，楊 艷，韋 余，周旭美，高健美,

（1.遵義醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學藥學院，貴州遵義 563000）

疲勞是指機體在生理過程中不能持續(xù)其機能在特定水平和（或）不能維持預(yù)定的運動強度[1]。若不及時消除疲勞可導致人體的內(nèi)分泌功能紊亂，免疫力下降，進而引發(fā)一系列生理問題，例如失眠、抑郁等。運動性疲勞嚴重影響人類的健康[2?3]，但其病因復雜，目前尚不明確。關(guān)于運動性疲勞的產(chǎn)生機制主要包括能源衰竭學說、自由基學說等。其中，氧化應(yīng)激損傷即體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species, ROS）產(chǎn)生與抗氧化能力之間失衡的狀態(tài)被認為是運動性疲勞產(chǎn)生的主要原因之一[4?5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，核因子 E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）作為內(nèi)源性抗氧化途徑的中樞轉(zhuǎn)錄因子在運動性疲勞中發(fā)揮重要作用[6?7]。因此，以Nrf2為作用靶點研究延緩疲勞的產(chǎn)生和促進疲勞的消除具有重大意義。

金絲桃苷是廣泛存在于金絲桃科、薔薇科等植物全草及果實（例如山楂、葡萄、蘋果等）中的黃酮類活性成分[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷具有抗心肌缺血再灌注損傷[9]、抗腫瘤[10]、降壓等作用[11]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷能夠改善D-半乳糖導致的衰老模型小鼠的學習記憶功能，其作用與抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[12]。但是，金絲桃苷能否通過調(diào)控Nrf2信號途徑發(fā)揮抗小鼠運動性疲勞的作用尚未見報道。因此，本研究采用運動性疲勞小鼠模型研究金絲桃苷的抗疲勞作用及其可能的作用機制，旨在為后續(xù)金絲桃苷臨床用于抗運動性疲勞提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金絲桃苷（批號SH8310，經(jīng)HPLC檢測純度≥98%） 北京索萊寶科技有限公司；SPF級雄性C57BL/6 小鼠（6~8 周齡，18~22 g） 湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（合格證號：SYXK（湘）2019-0004）。將所有 C57BL/6 小鼠分籠（n=5~6 只/籠）飼養(yǎng)，所有動物在通風良好、恒溫（(23±1)℃）、恒濕（55%±5%）12 h晝夜交替的房間適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實驗期間小鼠能夠自由進食及飲水；乳酸（lactic acid,LA）、血清尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）、肝糖元（liver glycogen, LG）、肌糖元（muscle glycogen,MG）、活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）、丙二醛（malonaldehyde, MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）試劑盒 上海仁捷生物科技有限公司；Nrf2、HO-1、NQO-1抗體 Abcam公司。

51119670 全波長酶標儀 ThermoFisher Scientific；LE8505自動疲勞轉(zhuǎn)棒儀 瑞沃德生命科技有限公司；1645050電泳儀、GelDoc EZ全自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng) Bio-Rad。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥 采用簡單隨機法將SPF級雄性C57BL/6小鼠40只隨機分為4組：空白組、金絲桃苷低劑量組、金絲桃苷中劑量組和金絲桃苷高劑量組。低、中、高劑量組每天灌胃5、10、20 mg/kg的金絲桃苷，連續(xù)給藥28 d?？瞻捉M灌胃等體積生理鹽水。

1.2.2 小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒實驗 在末次給藥30 min后，進行疲勞轉(zhuǎn)棒實驗。將各組小鼠置于轉(zhuǎn)棒疲勞儀（轉(zhuǎn)速 30 r/min）上，先進行小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒訓練 3次（1 次/d）后，末次給藥第4 d進行正式實驗，記錄小鼠運動性疲勞后，從轉(zhuǎn)棒上跌落的時間。

1.2.3 小鼠負重游泳實驗 在末次給藥30 min后，通過力竭負重游泳實驗觀察小鼠的耐力。在小鼠尾部固定5%體重的鉛線，將各組小鼠置于水深40 cm、水溫（25±1）℃的游泳箱中。小鼠從自由游泳開始至沉入水中10 s后不能浮出水面的時間作為小鼠力竭游泳時間。實驗結(jié)束后，采用2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，眼球取血后，在4 ℃條件下3000 r/min離心10 min取上清；采血后，立即取小鼠肝臟和腓腸肌組織，于?80 ℃冰箱中保存、備用。

1.2.4 生化指標檢測 通過ELISA法檢測小鼠血清中BUN、LA的含量，肝組織中LG、ROS、MDA、SOD、GSH-Px，肌肉組織中MG的含量，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書方法進行檢測。

1.2.5 分子對接技術(shù) 通過分子對接技術(shù)觀察金絲桃苷與Nrf2蛋白結(jié)合情況。首先從RSCB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）中下載Nrf2蛋白的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：3WN7），然后，從 PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載金絲桃苷化合物 2D及 3D結(jié)構(gòu)的 SDF格式文件。運用AutoDock vina軟件進行分子對接，利用Pymol軟件進行對接復合物的可視化分析。

1.2.6 Western blot檢測 通過Western blot法檢測小鼠肝組織中Nrf2、HO-1、NQO-1的蛋白表達。取小鼠肝組織，加入蛋白裂解液后，離心提取總蛋白并通過BCA試劑盒測定蛋白濃度，加熱使其變性后，蛋白上樣量30 μg，經(jīng)12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。將PVDF膜封閉于含5%脫脂奶粉的三乙醇胺緩沖鹽（tris buffered saline/tween, TBST）封閉液中 1 h 后，加入相應(yīng)的一抗：Nrf2（1:1000）、HO-1（1:1000）、NQO-1（1:1000），在 4 ℃ 條件下孵育一抗過夜，采用TBST洗膜3次后，以辣根過氧化酶標記的二抗室溫條件下孵育1 h后，采用ECL發(fā)光法經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，采用Image J軟件分析內(nèi)參蛋白和目的蛋白條帶的灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊用Bonferroni檢驗，方差不齊用Dunnett’s T3檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 金絲桃苷對小鼠轉(zhuǎn)棒時間的影響

通過轉(zhuǎn)棒實驗觀察金絲桃苷對運動性疲勞小鼠耐力和平衡性的影響。研究結(jié)果表明：與空白組比較，給藥組小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上停留的時間顯著（P<0.05）延長且呈劑量依賴性（表1）。

表1 金絲桃苷對小鼠轉(zhuǎn)棒停留時間的影響（n=10, ±s）Table 1 Effects of hyperoside on the rotating rod lasting time of mice（n=10, ±s）

表1 金絲桃苷對小鼠轉(zhuǎn)棒停留時間的影響（n=10, ±s）Table 1 Effects of hyperoside on the rotating rod lasting time of mice（n=10, ±s）

注：與空白組比較，*代表差異顯著，P<0.05；**代表差異極顯著，P<0.01；表2~表4同。

組別 劑量（mg/kg） 停留時間（s）空白組 109.6±1.5金絲桃苷低劑量組 5 141.4±3.9*金絲桃苷中劑量組 10 188.6±6.8**金絲桃苷高劑量組 20 239.4±6.3**

2.2 金絲桃苷對小鼠力竭游泳時間的影響

通過小鼠力竭游泳實驗觀察金絲桃苷對運動耐力的影響評價其抗疲勞活性。研究結(jié)果顯示：與空白組比較，給藥組小鼠力竭游泳時間顯著（P<0.05）延長并呈劑量依賴性（表2）。

表2 金絲桃苷對小鼠力竭游泳時間的影響（n=10, ）Table 2 Effects of hyperoside on the exhaustive swimming time of mice（n=10, ）

表2 金絲桃苷對小鼠力竭游泳時間的影響（n=10, ）Table 2 Effects of hyperoside on the exhaustive swimming time of mice（n=10, ）

組別 劑量（mg/kg） 停留時間（s）空白組 649.2±16.3金絲桃苷低劑量組 5 796.8±14.1*金絲桃苷中劑量組 10 887.3±11.5**金絲桃苷高劑量組 20 966.2±13.1**

2.3 金絲桃苷對小鼠抗疲勞相關(guān)生化指標的影響

通過ELISA法觀察金絲桃苷對運動性疲勞小鼠血清中LA、BUN的含量、肝組織中LG和腓腸肌組織中MG的含量。研究結(jié)果顯示：與空白組比較，金絲桃苷顯著降低小鼠LA、BUN的含量，升高小鼠肝糖原含量和肌糖原含量（表3）（P<0.05）。

表3 金絲桃苷對小鼠抗疲勞相關(guān)生化指標的影響（n=10, ±s）Table 3 Effects of hyperoside on anti-fatigue related indexes of mice（n=10, ±s）

表3 金絲桃苷對小鼠抗疲勞相關(guān)生化指標的影響（n=10, ±s）Table 3 Effects of hyperoside on anti-fatigue related indexes of mice（n=10, ±s）

組別 劑量（mg/kg）血清指標 肝臟 腓腸肌LA（mmol/L）BUN（mmol/L）LG（mg/g）MG（mg/g）空白組 9.5±0.4 15.3±0.5 4.2±0.1 2.2±0.1金絲桃苷低劑量組 5 7.4±0.2* 10.4±0.3* 6.4±0.3* 3.8±0.1*金絲桃苷中劑量組 10 6.1±0.2** 8.2±0.2** 8.4±0.1**5.5±0.2**金絲桃苷高劑量組 20 4.2±0.1** 6.2±0.4**11.5±0.9**6.3±0.1**

2.4 金絲桃苷對疲勞小鼠肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標的影響

通過ELISA法觀察金絲桃苷對疲勞小鼠肝組織ROS和MDA的含量、SOD和GSH-Px活力的影響。研究結(jié)果表明：與空白組比較，金絲桃苷顯著降低小鼠肝組織中ROS和MDA的含量，升高SOD和 GSH-Px 的活力（表4）（P<0.05）。

表4 金絲桃苷對疲勞小鼠肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標的影響（n=10, ）Table 4 Effects of hyperoside on oxidative-related indexes of liver of fatigue mice（n=10, ）

表4 金絲桃苷對疲勞小鼠肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標的影響（n=10, ）Table 4 Effects of hyperoside on oxidative-related indexes of liver of fatigue mice（n=10, ）

組別 劑量（mg/kg）ROS（U/L）MDA（nmol/L）SOD（U/mg prot）GSH-Px（U/mg prot）空白組 76.4±3.1 7.2±0.1 8.5±0.3 5.4±0.3金絲桃苷低劑量組 5 55.4±2.6*5.1±0.2* 12.3±0.6* 10.5±0.5*金絲桃苷中劑量組 10 27.8±4.5**3.5±0.2**17.9±0.7** 18.5±0.7**金絲桃苷高劑量組 20 19.1±3.4**2.9±0.2**25.6±0.8** 23.9±0.2**

2.5 金絲桃苷與Nrf2蛋白結(jié)合情況

通過分子對接技術(shù)觀察金絲桃苷與Nrf2蛋白結(jié)合情況。研究結(jié)果顯示：金絲桃苷與Nrf2的對接能量為?11.21 kcal/mol，由于其對接能量≤?5 kcal/mol，表明金絲桃苷能夠與Nrf2蛋白直接結(jié)合。兩者的氨基酸結(jié)合位點主要包括纈氨酸（Val608）、蘇氨酸（Thr560）、丙氨酸（Ala369）、異亮氨酸（Ile559）等（圖1）。

圖1 金絲桃苷與Nrf2蛋白的分子對接結(jié)果Fig.1 The molecular docking results of hyperoside binding with Nrf2

2.6 金絲桃苷對疲勞小鼠Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達的影響

采用Western blot法檢測金絲桃苷對疲勞小鼠Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達的影響。研究結(jié)果顯示：與空白組比較，金絲桃苷能夠明顯下調(diào)胞漿中Nrf2的蛋白表達，上調(diào)胞核中Nrf2、HO-1、NQO-1的蛋白表達（圖2）。

圖2 金絲桃苷對疲勞小鼠肝組織中Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達的影響Fig.2 Effects of hyperoside on the expressions of Nrf2, HO-1, NQO-1 of liver in fatigue mice

3 討論與結(jié)論

運動性疲勞可導致機體能量消耗、尿素氮、乳酸等代謝產(chǎn)物不斷累積，體力和工作能力下降，使機體呈現(xiàn)亞健康狀態(tài)或增加疾病發(fā)生的風險[13]。轉(zhuǎn)棒時間和力竭游泳時間長短可直觀反映機體的運動能力，是檢測藥物抗疲勞作用的重要指標[14?15]。本研究結(jié)果表明，金絲桃苷能夠明顯延長小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時間和力竭游泳時間，提示金絲桃苷能夠增強小鼠的運動能力和抗疲勞能力。此外，當機體長時間劇烈運動后，血液中LA大量產(chǎn)生，引起疲勞[16?17]。BUN是機體蛋白質(zhì)代謝的產(chǎn)物，其含量與運動性疲勞呈正相關(guān)，即BUN清除越快，則疲勞消除的就越快[18?19]。糖原是機體重要的能量來源，其中，MG在運動中直接提供能量，LG負責儲備能量。MG和LG的含量與抗疲勞能力呈正相關(guān)[20?21]。本研究結(jié)果表明，金絲桃苷能夠明顯降低運動性疲勞小鼠LA和BUN的水平，增加MG和LG的含量，表明金絲桃苷有效的提高了機體清除LA和BUN的能力，增強了機體糖原的儲備，進而發(fā)揮其抗疲勞的作用。

劇烈運動可導致機體ROS產(chǎn)生加速，導致氧化應(yīng)激損傷。ROS是體內(nèi)一類氧的單電子還原產(chǎn)物，體內(nèi)常見的ROS類型主要包括超氧陰離子、過氧化氫（hydrogen peroxide, H2O2）、羥自由基等[22?23]。當運動性疲勞發(fā)生時，過量產(chǎn)生的ROS會攻擊細胞膜，使脂質(zhì)過氧化物丙二醛（malondialdehyde, MDA）產(chǎn)生增加；同時，導致機體抗氧化物酶（SOD、GSHPx等）活力降低[24?25]。本研究結(jié)果表明，金絲桃苷能夠明顯降低ROS和MDA的水平，同時，增加SOD和GSH-Px的活力，提示金絲桃苷的抗疲勞作用與其抗氧化能力有關(guān)。

Nrf2 屬于 cap-‘n’-collar調(diào)節(jié)蛋白家族，具有高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。在機體穩(wěn)態(tài)條件下，Nrf2與胞漿中Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1）結(jié)合而處于無活性狀態(tài)[26]；當機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2與Keap1解離后易位到細胞核，與基因啟動子中存在的特定抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element, ARE）相互作用，啟動其下游的抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄過程，如血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1, HO-1）、NADPH醌氧化還原酶 1（NADPH quinone oxidoreductase 1, NQO1）等，進而提高細胞的抗氧化應(yīng)激損傷能力[27?28]。Nrf2信號途徑與機體抗氧化能力密切相關(guān)，激活Nrf2能夠有效抑制氧化應(yīng)激損傷，進而緩解疲勞[29?30]。但是，金絲桃苷能否通過調(diào)控Nrf2信號途徑發(fā)揮抗疲勞的作用尚不清楚，因此，本研究首先通過分子對接技術(shù)分析金絲桃苷與Nrf2的結(jié)合情況。研究結(jié)果表明金絲桃苷與Nrf2具有較強的親和力，提示金絲桃苷能夠與Nrf2直接結(jié)合?；谝陨嫌嬎銠C模擬預(yù)測結(jié)果，本研究進一步通過Western blot法驗證金絲桃苷對Nrf2信號途徑的影響。研究結(jié)果表明金絲桃苷能夠上調(diào)胞核中Nrf2的水平，下調(diào)胞漿中Nrf2的水平，提示金絲桃苷能夠促進Nrf2由胞漿易位到胞核。此外，金絲桃苷還可上調(diào)HO-1和NQO-1的蛋白表達，提示金絲桃苷能夠通過調(diào)節(jié)Nrf2信號途徑發(fā)揮抗運動性疲勞小鼠氧化應(yīng)激損傷的作用。盡管本研究初步明確了金絲桃苷的抗疲勞能力與調(diào)控Nrf2有關(guān)，但是，其具體作用靶點仍需進一步探索。因此，在未來的研究中將通過Nrf2基因敲除小鼠深入闡明金絲桃苷抗疲勞的作用機制。

綜上所述，金絲桃苷具有明顯抗小鼠運動性疲勞的作用，該作用與其調(diào)控Nrf2信號途徑進而增強抗氧化能力有關(guān)。