樊雨梅，史傳超，帖 航，張?bào)銞c，趙海晴，廖 峰,

（1.國(guó)家膠類(lèi)中藥工程技術(shù)研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東聊城 252201；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

皮膚屏障功能是皮膚最重要的功能之一，在保護(hù)機(jī)體免受環(huán)境傷害、防止微生物入侵、調(diào)節(jié)體溫、避免體內(nèi)水分流失、維持內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要的作用?？諝馕廴綶1]、氣候因素、紫外線照射、過(guò)度清潔、衰老[2]等會(huì)影響皮膚屏障功能[3]。皮膚屏障受損與多種皮膚疾病的病因、病理過(guò)程相關(guān)，比如濕疹、銀屑病、接觸性皮炎、特異性皮炎等[4?6]。因此，皮膚屏障功能的修復(fù)對(duì)緩解皮膚炎癥、預(yù)防和治療皮膚疾病有著重要的意義。

近年來(lái)，研究表明植物油[7]、植物多糖[8]、膠原蛋白/膠原水解物[9]等天然成分能夠有效修復(fù)皮膚屏障。其中，膠原蛋白在抗衰老、保濕、防護(hù)紫外線損傷、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)分泌等方面已有廣泛的應(yīng)用[10]。研究表明，膠原蛋白對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、遷移和維持干細(xì)胞特性有較好的作用[11]。另外，基于鳥(niǎo)槍法的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)揭示膠原蛋白肽能夠調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞中的炎性因子表達(dá)，并誘導(dǎo)與皮膚屏障維持相關(guān)的蛋白表達(dá)[12]。豬、牛的皮和骨是提取膠原蛋白的主要來(lái)源，但由于存在瘋牛病的風(fēng)險(xiǎn)和宗教原因，海洋來(lái)源的膠原蛋白得到了廣泛關(guān)注，比如魚(yú)類(lèi)[13]、魷魚(yú)[14]、水母[15]等。然而，海洋來(lái)源的膠原蛋白因亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）含量較低導(dǎo)致變性溫度低而限制其廣泛應(yīng)用[16]。相比于豬羊，目前有關(guān)驢的疫病國(guó)內(nèi)外并無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[17]，可見(jiàn)驢骨作為提取膠原蛋白的原料相對(duì)安全。因此，本文在采用超高效液相色譜綜合高分辨率軌道分析質(zhì)譜（UPLC-Orbitrap MS）技術(shù)定性分析驢骨膠原蛋白有效成分的基礎(chǔ)上，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)驢骨膠原蛋白對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、遷移的影響，旨在為其應(yīng)用于表皮屏障修復(fù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

驢骨 山東天龍?bào)H產(chǎn)業(yè)研究院；乙腈、甲醇、甲酸 均為質(zhì)譜純，百靈威科技有限公司；2-氯苯丙氨酸 GL Biochem（Shanghai）Ltd；SLS（Sodium Lauryl Sulfate，十二烷基硫酸鈉，ω≥98.5%）、地塞米松（ω≥97%） Sigma-Aldrich 公司；胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶/EDTA、PBS、青霉素/鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基 Gibco公司；BrdU試劑盒 Roche公司；CCK-8試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT） 協(xié)和細(xì)胞庫(kù)3111C0001CCC000373。

LC-MS（ Ultimate 3000LC， Orbitrap Elite） 、MULTISKAN GO多功能酶標(biāo)儀、371二氧化碳培養(yǎng)箱 Thermos公司；DHP-9272B恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Axio Observer.D1倒置熒光顯微鏡 ZEISS公司；ACQUITY UPLC HSS T3柱 美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 驢骨膠原蛋白的制備 經(jīng)實(shí)驗(yàn)室多次制備，最終確認(rèn)驢骨膠原蛋白的制備工藝為：驢骨解凍清洗破粒后，驢骨與水的質(zhì)量體積比為1:2，升溫至140 ℃，攪拌3 h，虹吸出液，加入1倍純凈水，60 ℃加酶（風(fēng)味蛋白酶，酶活：1.52×104U/g）酶解 1 h 后，升溫至140 ℃滅酶1 h，獲得驢骨膠原蛋白液，蛋白液均質(zhì)、濃縮、噴霧干燥后得驢骨膠原蛋白粉。

1.2.2 驢骨膠原蛋白營(yíng)養(yǎng)成分的分析 蛋白質(zhì)含量依據(jù)GB 5009.5-2016 中凱氏定氮法進(jìn)行蛋白測(cè)定[18]，氨基酸的測(cè)定采用GB /T 5009.124-2016 的方法測(cè)定[19]。

1.2.3 驢骨膠原蛋白全成分分析

1.2.3.1 樣品前處理 稱(chēng)取約50 mg驢骨膠原蛋白，加入 800 μL 甲醇溶液，并加入 10 μL 內(nèi)標(biāo)（3.0 g/L，2-氯苯丙氨酸）。將其置于組織研磨儀中65 Hz研磨120 s。水浴超聲30 min后置于4 ℃離心機(jī)中，12000 r/min離心 15 min，吸取 200 μL上清，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶中待LC-MS檢測(cè)分析。

1.2.3.2 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱溫為 40 ℃，流速恒定0.3 mL/min。流動(dòng)相組成：A相：水+0.1%甲酸；B相：乙腈+0.1%甲酸。進(jìn)樣量4 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 ℃，流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相洗脫程序Table 1 Elution procedure of mobile phase

1.2.3.3 質(zhì)譜條件 正離子模式：加熱器溫度300 ℃，鞘氣流速 45 arb，輔助氣流速 15 arb，尾氣流速1 arb，電噴霧電壓3.0 kV，毛細(xì)管溫度350 ℃，S-Lens RF Level 30%。負(fù)離子模式：加熱器溫度300 ℃，鞘氣流速45 arb，輔助氣流速為15 arb，尾氣流速1 arb，電噴霧電壓3.2 KV，毛細(xì)管溫度350 ℃，S-Lens RF Level 60%。

掃描模式：一級(jí)全掃描（Full Scan, m/z 50~1000）與數(shù)據(jù)依賴(lài)性二級(jí)質(zhì)譜掃描（dd-MS2, TopN=10）；分辨率：一級(jí)質(zhì)譜為60000、二級(jí)質(zhì)譜為17500。碰撞模式：高能量碰撞解離（HCD）。

1.2.4 細(xì)胞水平探究驢骨膠原蛋白皮膚修復(fù)活性

1.2.4.1 驢骨膠原蛋白對(duì)HaCaT細(xì)胞生存活力的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞以密度1×105個(gè)/mL接種于 96孔板，每孔 100 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，換上含有驢骨膠原蛋白的DMEM完全培養(yǎng)基，每孔100 μL。另設(shè)空白對(duì)照組（不含細(xì)胞）、對(duì)照組加入相同體積的DMEM完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)48 h后，用200 μL預(yù)溫的PBS清洗2次。去除清洗溶液，每孔準(zhǔn)確加入100 μL CCK8工作液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1~3 h，在450 nm下測(cè)定吸光度。按照下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4.2 驢骨膠原蛋白對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞，按照細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔接種至 96 孔板，每孔含培養(yǎng)液 100 μL。在培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng) 24 h后，加入含有受試物的培養(yǎng)基，以1% FBS作為陽(yáng)性對(duì)照，以未處理細(xì)胞作為空白對(duì)照。加藥后在培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后進(jìn)行BrdU試驗(yàn)，以不做BrdU處理作為背景對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置1個(gè)背景對(duì)照，以BrdU處理不含細(xì)胞的微孔作為溶劑對(duì)照背景，于450/690 nm下讀取吸光度OD值。按照下面公式計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.4.3 驢骨膠原蛋白對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移的影響收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞，按照細(xì)胞密度為8×105個(gè)/孔接種至6孔板，每孔含培養(yǎng)液2 mL。在培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng) 24 h后，使用無(wú)菌槍頭劃出劃痕，用PBS沖洗2次以去除劃痕區(qū)殘留細(xì)胞。劃痕后隨機(jī)分為陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置3個(gè)平行。加入2 mL含有不同濃度的驢骨膠原蛋白且不含血清的培養(yǎng)基（陽(yáng)性對(duì)照除外）后，在培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后，于倒置顯微鏡下觀察劃痕區(qū)細(xì)胞的愈合情況并照相記錄，使用Image-Pro Plus 6.0計(jì)算劃痕區(qū)面積的平均值，按照下面公式計(jì)算劃痕區(qū)遷移率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以“均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示。多組數(shù)據(jù)差異比較采用方差分析，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*表示與空白對(duì)照組相比，P<0.05；**表示與空白對(duì)照組相比，P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 驢骨膠原蛋白基礎(chǔ)成分分析

采用國(guó)標(biāo)法測(cè)定驢骨膠原蛋白的蛋白含量為57.5%，氨基酸的組成見(jiàn)表2。驢骨膠原蛋白中，甘氨酸的含量最多，占總氨基酸的24.04%；其次是脯氨酸、谷氨酸和丙氨酸；不含有半胱氨酸，且組氨酸、酪氨酸和蛋氨酸含量比較低。根據(jù)KITTIPHATTANABAWON等[20]和王曉軍等[21]的報(bào)道，I型膠原蛋白中甘氨酸、脯氨酸含量豐富，且甘氨酸約占氨基酸總量的1/3，半胱氨酸、組氨酸、蘇氨酸和色氨酸的含量很低甚至沒(méi)有。因此，推斷驢骨膠原蛋白為I型膠原蛋白。驢骨膠原蛋白氨基酸組成與耗牛骨[21]、鹿骨[22]相似，均為典型的膠原蛋白氨基酸組成。

表2 驢骨膠原蛋白的氨基酸組成及含量Table 2 The amino acid composition and content of donkey bone collagen

2.2 驢骨膠原蛋白全成分分析

應(yīng)用多質(zhì)量分析器組合式質(zhì)譜儀對(duì)驢骨膠原蛋白進(jìn)行MSn級(jí)掃描，最終獲得驢骨膠原蛋白主要營(yíng)養(yǎng)成分信息，形成樣本的營(yíng)養(yǎng)成分譜庫(kù)。圖1為驢骨膠原蛋白的總離子流圖。根據(jù)Compound Discoverer軟件處理得到Mass數(shù)據(jù)，基于Metlin數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行全譜鑒定。共鑒定出87種營(yíng)養(yǎng)成分，詳細(xì)信息見(jiàn)表3。

表3 驢骨膠原蛋白LC-MS全譜鑒定Table 3 Compound identification of donkey bone collagen by LC-MS

圖1 驢骨膠原蛋白總離子流色譜圖Fig.1 The total ion chromatogram of donkey bone collagen

2.2.1 氨基酸及其衍生物 由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果知，驢骨膠原蛋白共鑒定出16種氨基酸及其衍生物，其中有5種必需氨基酸（賴(lài)氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸和亮氨酸），含有牦牛骨膠原蛋白[23]、雞骨明膠[24]、鹿骨膠原蛋白[22]、羅非魚(yú)骨膠原蛋白[25]不含有的色氨酸，后面需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。值得注意的是，驢骨膠原蛋白含有γ-氨基丁酸、?；撬帷⒔构劝彼?、亮氨酸、精氨酸等活性氨基酸。γ-氨基丁酸是一種神經(jīng)抑質(zhì)，可通過(guò)激活GSK-3β/Nrf-2通路保護(hù)胰腺組織、減少胰島β細(xì)胞損傷和影響mTOR/S6K1/IRS-1途徑提高肌肉對(duì)胰島素的敏感性，進(jìn)而緩解2型糖尿病患者的胰腺損傷和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[26]。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充適量?；撬崮軌蚪档吞悄虿?dòng)物血糖水平，改善糖尿病癥狀[27]。這些物質(zhì)可以從分子角度解釋驢骨治療糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)。焦谷氨酸是皮膚的天然保濕因子，對(duì)酪氨酸氧化酶等酶類(lèi)的活性有一定抑制作用，阻止“類(lèi)黑素”物質(zhì)在皮膚中積沉，使皮膚亮白[28]。精氨酸可通過(guò)促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成，有效促進(jìn)創(chuàng)面的愈合[29]。亮氨酸具有加快皮膚細(xì)胞的新陳代謝、促進(jìn)皮膚組織再生和愈合等效果[30]。這些物質(zhì)在一定程度上揭示了驢骨膠原蛋白具有促進(jìn)傷口愈合的功效。

續(xù)表3

2.2.2 有機(jī)酸類(lèi) 目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)骨膠原蛋白中有機(jī)酸成分的研究較少。本文利用LC/MS技術(shù)從驢骨膠原蛋白中鑒定出11種有機(jī)酸，如乳酸、水楊酸等。小分子有機(jī)酸是化妝品的重要成分之一，可滲透至皮膚角質(zhì)層，使老化角質(zhì)層中的細(xì)胞鍵合力減弱，加快細(xì)胞更新速度，促進(jìn)死亡細(xì)胞脫離，從而使皮膚表面光滑、細(xì)嫩、柔軟[31?32]。

2.2.3 脂質(zhì)類(lèi) 從驢骨膠原蛋白中共鑒定出46種脂質(zhì)類(lèi)，低于李蘭杰等[33]報(bào)道的驢骨粉脂肪酸種類(lèi)（52種），且未鑒定出羊脂酸等脂肪酸，可能與所使用的檢測(cè)方法不同有關(guān)，后面需進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。α-亞麻酸、亞油酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸、前列腺素、白細(xì)胞三烯等多不飽和酸及其代謝產(chǎn)物被稱(chēng)為“美容酸”，有防止皮膚老化、延緩衰老、促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)等功效。驢骨膠原蛋白含有的杜鵑花酸對(duì)表皮葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、皮屑芽孢菌等細(xì)菌有很好的抗菌效果[34]，也對(duì)治療色素沉著和痤瘡有很好的效果[35]。

2.2.4 糖類(lèi) 現(xiàn)代研究已經(jīng)證實(shí)糖類(lèi)成分具有保濕、延緩衰老、血管美容、抗粉刺、曬后修復(fù)和美白等眾多護(hù)膚功效[36]。由表3可知，鑒定出驢骨膠原蛋白有6種糖類(lèi)，包括葡萄糖酸、海藻糖等對(duì)皮膚有益的糖類(lèi)。

2.2.5 其他成分 利用多重質(zhì)譜在驢骨膠原蛋白中還鑒定出尿囊素、肌肽、維生素B5等活性成分。尿囊素具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、加快傷口愈合、軟化角質(zhì)蛋白等生理功能，是皮膚創(chuàng)傷的愈合劑和抗?jié)兯巹?，?duì)糖尿病、痤瘡均有較好的療效[37]。肌肽可通過(guò)抗氧化、抑制端?？s短和線粒體損傷、抗糖基化等作用抑制衰老[38]。維生素原B5不僅能夠起到防止頭發(fā)分叉、刺激毛發(fā)生長(zhǎng)、提高光澤度等作用，也可起到保濕、促進(jìn)修復(fù)以及抗炎等作用[30]。綜上，驢骨膠原蛋白在治療糖尿病、促進(jìn)傷口愈合、護(hù)膚等方面具有一定的物質(zhì)基礎(chǔ)和研究?jī)r(jià)值。

2.3 驢骨膠原蛋白皮膚修復(fù)活性的初步探究

2.3.1 驢骨膠原蛋白對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響 不同濃度驢骨膠原蛋白作用HaCaT細(xì)胞48 h后，與空白對(duì)照組相比，0.125~1 g/mL的驢骨膠原蛋白能顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的生長(zhǎng)（P<0.05），在驢骨膠原蛋白濃度為0~0.063 g/mL時(shí)，HaCaT細(xì)胞的增長(zhǎng)并無(wú)明顯變化，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，在適宜濃度下驢骨膠原蛋白能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增長(zhǎng)。

圖2 驢骨膠原蛋白對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of donkey bone collagen on the survival rate of HaCaT cells

2.3.2 驢骨膠原蛋白對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響CCK8法主要是通過(guò)檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)線粒體的能量代謝活性來(lái)反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)目和細(xì)胞活力，則CCK8的檢測(cè)結(jié)果并不能完全確定驢骨膠原蛋白一定能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖。而B(niǎo)rdU是胸腺嘧啶的類(lèi)似物，可代替胸腺嘧啶選擇性整合到復(fù)制期細(xì)胞新合成的DNA中，并隨著DNA復(fù)制進(jìn)入子細(xì)胞，再通過(guò)BrdU特異性抗體檢測(cè)BrdU的摻入來(lái)判斷細(xì)胞的增殖活力[8]，因此，采用BrdU法可更準(zhǔn)確地檢測(cè)驢骨膠原蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)驢骨膠原蛋白在0.01~0.15 g/mL范圍內(nèi)能夠以劑量依賴(lài)方式促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖，且與空白對(duì)照組相比均具有顯著性差異（P<0.05）（見(jiàn)圖3a）。由圖3b可知，0.15 g/mL的驢骨膠原蛋白促增殖效果最明顯，其增殖率達(dá)到（125.71%±9.25%），極顯著高于空白對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)率（100.00%±2.55%，P<0.01），與陽(yáng)性對(duì)照組5%的胎牛血清的細(xì)胞生長(zhǎng)率相近（130.26±5.45%，P>0.05），增殖作用明顯。

圖3 驢骨膠原蛋白（a）和各處理組（b）對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of donkey bone collagen（a）and different treatments（b）on the proliferation of HaCaT cells

2.3.3 驢骨膠原蛋白對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移的影響 采用細(xì)胞體外劃痕實(shí)驗(yàn)，探討不同濃度驢骨膠原蛋白對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移能力的影響。利用Image pro plus軟件計(jì)算、比較0 h和24 h劃痕面積的變化，結(jié)果顯示（見(jiàn)圖4，圖a放大倍數(shù)50倍），與空白對(duì)照組相比，5%胎牛血清作用后，HaCaT細(xì)胞遷移率增加28.99 %，差異顯著（P<0.01）。與張澤曦[39]報(bào)道的胎牛血清對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移率影響的效果一致，表明實(shí)驗(yàn)體系構(gòu)建成功。與空白對(duì)照組相比，0.038、0.075和0.150 g/mL的驢骨膠原蛋白均能極顯著增加HaCaT細(xì)胞遷移率（P<0.01），其中0.150 g/mL的驢骨膠原蛋白效果與5%胎牛血清促進(jìn)HaCaT細(xì)胞遷移的效果無(wú)顯著差異性（P>0.05）?？梢?jiàn)，驢骨膠原蛋白能夠顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的遷移融合，具有良好的皮膚屏障修護(hù)效果。

圖4 驢骨膠原蛋白和各處理組對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移的影響Fig.4 Effects of donkey bone collagen and different treatments on the migration of HaCaT cells

3 結(jié)論

利用HPLC串聯(lián)多重質(zhì)譜的手段鑒定出驢骨膠原蛋白中的87種營(yíng)養(yǎng)成分，包括氨基酸及其衍生物類(lèi)、糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、脂質(zhì)類(lèi)等。驢骨膠原蛋白含有杜鵑花酸、肌肽、尿囊素、精氨酸、亮氨酸、有機(jī)酸等多種對(duì)皮膚有益的成分。角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和遷移的能力對(duì)維護(hù)皮膚屏障功能有著重要的意義。結(jié)果表明，1 g/mL以?xún)?nèi)的驢骨膠原蛋白對(duì)HaCaT細(xì)胞無(wú)毒性，濃度范圍在0.01~0.15 g/mL的驢骨膠原蛋白以劑量依賴(lài)方式促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖。且0.15 g/mL的驢骨膠原蛋白促HaCaT細(xì)胞增殖和遷移的效果與5%胎牛血清類(lèi)似，顯著優(yōu)于空白對(duì)照組（P<0.05）。初步證明驢骨膠原蛋白對(duì)皮膚屏障功能受損具有一定的修復(fù)作用，推測(cè)可能與驢骨膠原促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖和遷移有關(guān)。本研究對(duì)驢骨膠原蛋白進(jìn)行了較為系統(tǒng)的活性成分研究與皮膚屏障修復(fù)體外功效評(píng)價(jià)，為驢骨深層次開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。