劉志洋，孫琪瑤，宮世平，徐建舒，王亞慧，張銘澤，于 悅,

（1.長春科技學院生命科學學院，吉林長春 130600；2.長春信息技術職業(yè)學院科技處，吉林長春 130103；3.長春海關技術中心，吉林長春 130062；4.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118）

鹿皮膠是由梅花鹿或馬鹿的皮制成的半成品[1]，其原材料鹿皮作為一種傳統(tǒng)中藥及鹿的重要組成部分之一，具有補氣補血、補腎等多種功效。近年來，鹿皮常被制作成鹿皮膠和各種營養(yǎng)保健產(chǎn)品，如鹿皮膠軟膠囊就是目前市場上比較熱銷的產(chǎn)品之一[2?5]。同時對鹿皮膠的研究在其補血、免疫調(diào)節(jié)和提高血清睪酮等功效方面逐步擴展，有中醫(yī)界的研究證實了鹿皮膠可治療潰瘍、婦女白帶、出血、腎虛滑精等各種疾病[6]，具有補血、增強免疫力和壯陽等功效[7?10]。目前，對鹿皮膠中氨基酸和微量元素等成分的研究廣泛，而對多糖等生物大分子成分的研究鮮見報道，針對水浴浸提法提取鹿皮膠多糖的工藝研究目前尚屬空白階段，對于鹿皮膠的功效研究上也主要體現(xiàn)在其補血和免疫調(diào)節(jié)等方面[11?13]，對于鹿皮膠多糖生理活性的研究不夠全面。

多糖廣泛存在于植物、動物、真菌中，安全無毒，是重要的天然產(chǎn)物資源。由于動物多糖具有來源廣泛的優(yōu)勢，目前對動物性多糖的研究逐漸引起人們的關注。顧龍玥等[14]研究證實動物多糖具有良好的降血糖活性。劉凱麗[15]研究證實星蟲多糖對非酒精性脂肪肝具有一定的改善作用。鹿皮膠多糖，作為一種新型的天然營養(yǎng)產(chǎn)物，擁有巨大的開發(fā)潛力。此外，近年來研究表明，多糖對于酒精性肝損傷具有良好的預防和保護作用，具有良好的開發(fā)價值。植物多糖、動物多糖和真菌多糖干預酒精性肝損傷的作用機制包括保護膜結構、調(diào)節(jié)線粒體功能、增強抗氧化、調(diào)節(jié)細胞因子、抗細胞凋亡等[16?20]。鹿皮膠多糖作為一種動物多糖可能存在預防和保護酒精性肝損傷的作用，但目前對于其保肝護肝作用的研究仍處空白，還未見考證。

本研究旨在開發(fā)一種簡單高效的方法來提取鹿皮膠多糖，準確分析其含量及結構，并針對鹿皮膠多糖對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用進行評價。本研究可為鹿皮膠資源日后的應用與開發(fā)提供理論基礎和科學依據(jù)，為其在功能性食品領域和臨床應用方面創(chuàng)造更多的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級昆明種小白鼠，體重約18~22 g，4~6周齡，使用許可證號：SCXK(遼)2020—0001 遼寧長生生物技術股份有限公司；鹿皮膠 吉林海王健康生物科技有限公司；谷草轉氨酶(AST/GOT)測試盒、谷丙轉氨酶(ALT/GPT)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、丙二醛(MDA)試劑盒 南京建成科技有限公司；乙醇、正丁醇、三氯甲烷 分析純，購自上?；S；葡聚糖標準品 (T-110、T-70、T-40、T-10) 北京索萊寶科技有限公司。

UV-1600紫外-可見分光光度計、Bruker IFS 48FT-IR傅里葉紅外光譜儀 日本島津公司；DHG-9140A電熱鼓風恒溫干燥箱 杭州藍天儀器有限公司；RE 52-98旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生生化日本佑倚有限公司；XLJ-ⅡB離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹿皮膠多糖的提取及純化 將鹿皮膠粉碎后過 200目篩，按料液比1:30（g/mL）進行水浴浸提（85 ℃、1.5 h），真空抽濾，取旋蒸濃縮后的多糖上清液，Sevage法除蛋白，95%乙醇醇沉，所得沉淀冷凍干燥后即為鹿皮膠粗多糖。

取DEAE-52纖維素濕法裝柱(3.6 cm×30 cm)[21]，鹿皮膠粗多糖制成20 mg/mL溶液，上樣量5 mL，流速 1 mL/min，使用 0、0.1、0.3、0.5 mo1/L 氯化鈉溶液對樣品進行洗脫，每4 min收集1管，其后用苯酚-硫酸法[22]對各管的吸光度進行測定，并以管數(shù)為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖。收集各洗脫液主峰，對洗脫液進行濃縮、透析、凍干，得到鹿皮膠多糖組分。接著選擇主峰最高的多糖組分，配制成5 mg/mL的溶液，通過葡聚糖凝膠Sephadex G-200進一步純化，上樣量1 mL，選用0.10 mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.7 mL/min，每10 min收集1管。用苯酚-硫酸法對各管的吸光度進行測定，并以管數(shù)為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖。收集各洗脫液主峰，對其進行濃縮、透析、凍干，此時得到的鹿皮膠多糖組分命名為DHGP-2[23]。

1.2.2 鹿皮膠多糖的結構特征

1.2.2.1 得率及總糖含量的測定 將葡萄糖標準品分別配制成 10、20、30、40、50 mg/mL，分別取 1 mL各濃度葡萄糖標準品溶液，加入1 mL 6%苯酚溶液，混勻后，加入5 mL硫酸，搖勻，靜置30 min后于490 nm處測定吸光度，并繪制標準曲線。參照繪制的標準曲線方程y=0.7711x+0.1371，R2=0.9990。計算出樣品總糖的濃度，并根據(jù)公式(1)計算出多糖質量分數(shù)，根據(jù)公式(2)計算出多糖得率[24]。

1.2.2.2 鹿皮膠多糖的基本理化性質分析 將鹿皮膠多糖溶解在冷水，熱水，乙酸乙酯，乙醇，丙酮，醚，正丁醇，異丙醇中，觀察其溶解度。碘-碘化鉀反應測定鹿皮膠多糖中是否存在淀粉[25]；氯化鐵反應測定是否存在酚類化合物；通過斐林試劑反應鑒別還原糖的存在[26]；通過茚三酮反應鑒別游離氨基酸，通過考馬斯亮藍法測定蛋白質，通過硫酸-咔唑反應鑒別葡萄糖醛酸[27]。

1.2.2.3 鹿皮膠多糖分子量的測定 采用濕法填充Sephadex柱 (1.0 cm×50 cm)，流速為 0.5 mL/min。每種葡聚糖標準品和藍色葡聚糖(Dextran T-2000)均上樣2.0 mg，先用藍色葡聚糖測洗脫體積(V0)，葡聚糖標準品(T-110、T-70、T-40、T-10)依次按順序上柱[28]。收集的洗脫液分裝到每個試管中，含量設定為3 mL，以苯酚-硫酸法跟蹤測定，根據(jù)吸光度測定洗脫體積(Ve)。以Ve/V0比值為縱坐標，分子量的自然對數(shù)lg Mw為橫坐標，繪制標準曲線，取2.0 mg純化后的多糖上柱，測定洗脫體積 Ve′，根據(jù) Ve′/V0值和標準曲線計算出分子量。

1.2.2.4 鹿皮膠多糖的紅外光譜分析 稱取干燥的DHGP-2 1~2 mg，將 DHGP-2與 KBr按質量比1:150的比例均勻混合后，壓制成片。測定紅外光譜吸收，初步鑒定其結構[29]。

1.2.3 鹿皮膠多糖對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用

1.2.3.1 實驗動物的造模及分組 將60只SPF級昆明種小鼠隨機平均分為6組，其中空白組和模型組灌胃蒸餾水，陽性對照組和鹿皮膠低、中、高劑量組分別灌胃25 mg/kg 聯(lián)苯雙酯和100、300、600 mg/kg鹿皮膠多糖[30]。連續(xù)給藥14 d[31]，灌胃量10 mL/kg[18]，每周稱重1次。

1.2.3.2 給藥及指標測定 除空白組灌胃純凈水外，其余各組小鼠均在最后一次灌胃后給予50%的乙醇溶液，灌胃體積 10 mL/kg，連續(xù)給藥14 d，最后一次給藥后，禁食不禁水，12 h后眼球取血，離心取血清測定AST、ALT、GSH-Px、SOD的活力及MDA的含量；制備肝組織勻漿，測定 MDA含量、GSH-Px、SOD活力[32]；無菌取肝，4%多聚甲醛固定包埋后切片(5 μm)進行HE染色，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化，并用CCD-NC6051攝影系統(tǒng)拍照，觀察組織形態(tài)和細胞超微結構。

2 結果與分析

2.1 鹿皮膠多糖的得率及含量測定

由標準曲線方程計算出鹿皮膠粗多糖含量為40.24%，得率為25.32%。

2.2 鹿皮膠多糖分離純化

2.2.1 DEAE-52陰離子交換柱層析 圖1為DEAE-52的洗脫曲線。鹿皮膠多糖經(jīng)過0、0.1、0.3、0.5 mo1/L的NaCl溶液梯度洗脫，每個濃度洗脫25管，分別在第42~45管、53~57管、85~88管均表現(xiàn)出良好無拖尾的對稱峰，說明這些是單一組分多糖。因此收集第42~45管、53~57管、85~88管多糖洗脫液，將其濃縮、透析、凍干得到三種不同的多糖組分，含量依次為23.4%、65.8%和27.1%，選擇含量最高的組分，進行進一步的純化。

圖1 鹿皮膠多糖在DEAE-52柱層析的洗脫曲線Fig.1 Elution curve of deer skin gum polysaccharide in DEAE-52 column chromatography

2.2.2 鹿皮膠多糖的Sephadex G-200葡聚糖凝膠洗脫曲線 Sephadex G-200的洗脫曲線如圖2所示，以超純水為洗脫液，在9~11管處發(fā)現(xiàn)單一對稱峰，將其收集后進行濃縮、透析、凍干，多糖純度高達86.71%，說明經(jīng)分級純化后所得主要成分的純度較高。

圖2 鹿皮膠多糖在Sephadex G-200葡聚糖凝膠的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of deer skin gum polysaccharide in Sephadex G-200 dextran gel

2.2.3 鹿皮膠多糖各組分基本理化性質分析 鹿皮膠多糖是顏色為白色的絮狀固體，25 ℃時在水中溶解度>10 g，易溶于水，不溶于乙醇、聚乙二醇、丙酮。在硫酸-咔唑反應中，反應呈陽性，在其他反應中，結果均為陰性，說明得到的鹿皮膠多糖含有葡萄糖醛酸，無淀粉、酚類、蛋白質、氨基酸及還原糖殘基。

2.2.4 鹿皮膠多糖的分子量 分子量的標準曲線回歸方程為Ve/V0= ?1.4384(lg Mw)+8.1382，R2= 0.9988。如圖3所示，收集吸光度數(shù)值相對較高的第26~30管，Ve的洗脫體積為45 mL。測定標準藍色葡聚糖的洗脫體積 V0為30 mL，根據(jù)Ve′/V0的比值，計算其分子量為 41.2 kDa。

圖3 DHGP-2多糖在Sephadex G-200的洗脫曲線Fig.3 Elution curve of DHGP-2 polysaccharide in Sephadex G-200

2.2.5 鹿皮膠多糖的紅外光譜 圖4是鹿皮膠多糖DHGP-2 的紅外圖譜。3347 cm?1的吸收峰為 O-H的伸縮振動[33]，2939.51 cm?1的吸收峰為C-H的伸縮振動[34]；1411.89 cm?1的吸收峰是羧基伸縮振動[35]，以上三種吸收峰為典型的多糖吸收峰，說明其為多糖。鹿皮膠多糖 DHGP-2在波長 1651.06 cm?1附近的明顯吸收峰是羰基C=O的伸縮振動峰[36]，表明該多糖存在羰基結構；1025.13 cm?1處的吸收峰證明單糖以吡喃糖苷的形式存在[37]；1151.14 cm?1是吡喃糖環(huán)的C-O-C和 C-O-C單鍵的吸收峰，同樣也是糖醛酸的特征峰[38]。

圖4 DHGP-2多糖紅外掃描圖譜Fig.4 Infrared scanning pattern of DHGP-2 polysaccharide

2.3 鹿皮膠多糖預防急性酒精性肝損傷的研究

2.3.1 鹿皮膠多糖對酒精所致急性肝損傷小鼠體重的影響 鹿皮膠多糖對酒精所致急性肝損傷小鼠體重的影響如表1所示，由結果可知，各劑量組小鼠體重無明顯差異，說明鹿皮膠多糖安全無毒，可進行對急性酒精性肝損傷小鼠保護作用的研究。

表1 鹿皮膠多糖對小鼠體重的影響(±s, n=10)Table 1 Effects on body weight of mice (±s, n=10)

表1 鹿皮膠多糖對小鼠體重的影響(±s, n=10)Table 1 Effects on body weight of mice (±s, n=10)

注：與模型組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，表2、表3同。

組別 動物數(shù)（只） 初始體重（g） 7 d體重（g） 14 d體重（g）空白組 10 24.34±0.45 26.17±0.28 28.16±0.66模型組 10 24.22±0.38 27.04±0.62 29.03±0.46陽性對照組 10 24.01±0.36 26.62±0.31 27.93±0.73低劑量組 10 23.96±0.59 26.59±0.50 29.74±0.84中劑量組 10 24.35±0.54 26.87±0.34 28.43±0.78高劑量組 10 24.61±0.61 26.74±0.53 29.20±0.89

2.3.2 鹿皮膠多糖對小鼠酒精性肝損傷血清相關指標的影響 鹿皮膠多糖對小鼠酒精性肝損傷血清相關指標的影響如表2所示，與空白組相比較，模型組各指標均存在極顯著差異(P<0.01)，表明造模成功。與模型組比較，鹿皮膠多糖中、高劑量組小鼠血清中SOD、GSH-Px活性明顯升高，具有極顯著差異(P<0.01)，ALT、AST活性和MDA含量明顯降低，具有顯著或極顯著差異(P<0.05，P<0.01)，表明鹿皮膠多糖對急性酒精性肝損傷小鼠具有一定的保護作用。

表2 鹿皮膠多糖對小鼠血清谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶 (ALT)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量的影響Table 2 Effects of deer skin glue polysaccharide on activities of AST, ALT, GSH-Px, SOD and content of MDA in serum of mice

2.3.3 鹿皮膠多糖對小鼠肝臟相關生化指標的影響鹿皮膠多糖對小鼠肝臟中各相關指標影響如表3所示。與空白組相比較，模型組的各指標均存在極顯著差異(P<0.01)。與模型組比較，鹿皮膠多糖低劑量組各個指標均無顯著差異，中劑量組MDA含量以及SOD活性出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，聯(lián)苯雙酯陽性對照組各個指標均具有極顯著差異(P<0.01)，鹿皮膠多糖高劑量組的肝臟MDA含量極顯著降低(P<0.01)以及SOD活性極顯著升高(P<0.01)，GSHPx活性明顯升高，具有顯著性差異(P<0.05)。肝細胞的谷胱甘肽過氧化酶和超氧化物歧化酶活性降低，丙二醛含量升高，說明肝細胞抗氧化能力和脂質代謝異常。而對這三種指標的代謝異常起到反向抑制作用，則說明鹿皮膠多糖可調(diào)節(jié)脂質代謝，通過良好的抗氧化性來緩解肝結構的損傷。

表3 鹿皮膠多糖對小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響Table 3 Effects of deer skin glue polysaccharide on activities of SOD, GSH-Px and content of MDA in liver of mice

2.3.4 小鼠肝組織病理切片 結果如圖5所示。由切片結果可得，正常組肝細胞情況良好，無壞死及炎性浸潤等現(xiàn)象(圖5F)。模型組小鼠中央靜脈周圍出現(xiàn)大面積的凝血壞死和炎癥細胞的浸潤現(xiàn)象，肝組織結構紊亂，說明急性酒精肝損傷模型造模成功。與模型對照組相比，陽性對照組(圖5E)肝損傷明顯減輕，無嚴重的炎癥細胞。鹿皮膠多糖高、中、低劑量組(圖5A~C)肝組織細胞均表現(xiàn)輕微的脂變現(xiàn)象，可能是因為酒精進入肝細胞中的三個代謝酶系統(tǒng)后均可被氧化生成乙醛，乙醛作用于肝臟，使肝臟出現(xiàn)炎癥反應和肝臟的纖維化，說明酒精對小鼠肝臟造成了損傷，而鹿皮膠多糖高劑量組損傷最小，表明鹿皮膠多糖對于酒精造成的肝臟損傷具有一定的修復作用。

圖5 鹿皮膠多糖對小鼠的急性酒精性肝損傷肝組織的病理組織學觀察Fig.5 Pathological histology observation of acute alcoholic liver damage liver tissue in mice with deer skin gum polysaccharide

3 討論與結論

本文采用水浴浸提法提取鹿皮膠多糖，得率為25.32%；通過DEAE-52陰離子交換柱和Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱分離純化后得到純度為86.71%的鹿皮膠純多糖，形態(tài)特征為一種白色絮狀物；通過碘-碘化鉀等反應確定該多糖不含淀粉；通過氯化鐵反應確定該多糖不含酚類物質；通過斐林試劑反應確定該多糖中不存在還原糖；通過茚三酮反應確定該多糖不存在游離的氨基酸及蛋白質；通過硫酸-咔唑反應確定該多糖中含有糖醛酸，屬于酸性多糖；通過分子量的測定確定該多糖分子量為41.2 kDa；通過紅外光譜分析確定該多糖為吡喃糖結構。

動物實驗研究結果表明，灌胃14 d鹿皮膠多糖的小鼠體重與空白組小鼠體重變化不明顯，表明鹿皮膠多糖無毒副作用，可用于研究對急性酒精性肝損傷小鼠的保護作用。在生活中急性酒精性肝損傷較為多見，常表現(xiàn)為身體疲勞、腹瀉、食欲不振，嚴重者可產(chǎn)生黃疸等癥狀，如不及時治療，延誤最佳治療機會，將對身體造成嚴重傷害[39]。據(jù)報道，人體飲用酒精后，主要通過肝臟進行代謝，并產(chǎn)生大量超氧離子和活性氧等，通常由SOD和GSH-Px等進行清除[40]，若長期、大量飲酒，將引起體內(nèi)抗氧化劑降低，清除能力下降，導致MDA等大量堆積，機體產(chǎn)生氧化應激并參與酒精性肝病的致病過程，破壞肝臟結構。杜明等[40]研究表明高劑量組桑黃多糖(1.0 g/kg)具有保護急性酒精肝損傷的作用。本研究發(fā)現(xiàn)鹿皮膠多糖中高劑量組(300、600 mg/kg)均可提高血清中SOD、GSH-Px活性、降低ALT、AST活性和MDA含量，并存在劑量效應關系，可見鹿皮膠多糖在保護急性酒精性小鼠肝損傷方面具有良好的作用。

綜上所述，本研究證實了鹿皮膠多糖對酒精引起的小鼠肝損傷的輔助保護作用。為鹿皮膠資源的開發(fā)利用奠定了理論基礎，為進一步研究鹿皮膠多糖對酒精性肝病的預防及治療作用提供了科學依據(jù)。