于聰聰，蘭 韜, ，云振宇，初 僑，席興軍，孫冬梅，孟玲玲，張維冰

（1.中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院農(nóng)業(yè)食品標(biāo)準(zhǔn)化研究所，北京 100191；2.華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237）

隨著大麻的使用在許多國(guó)家已經(jīng)合法化[1?2]，許多大麻食品應(yīng)運(yùn)而生。根據(jù)美國(guó)一項(xiàng)針對(duì)可食用大麻產(chǎn)品標(biāo)簽使用情況的調(diào)查顯示[3]，常見(jiàn)的食用大麻產(chǎn)品主要包括烘培食品、飲料、糖果及巧克力等[4]。而隨著我國(guó)進(jìn)出口貿(mào)易的逐年增加，一些摻雜了大麻的巧克力也進(jìn)入國(guó)內(nèi)，這類(lèi)食品容易危害未成年人健康，所以我國(guó)也加大了此類(lèi)食品的監(jiān)管，海關(guān)也在著手開(kāi)展相關(guān)食品品類(lèi)中大麻酚類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)方法規(guī)范起草工作。

文獻(xiàn)資料顯示[5?6]，大麻酚類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，如表1所示。這些分子構(gòu)型差異較小，如大麻二酚（CBD）、大麻酚（CBN）與四氫大麻酚（THC）互為同分異構(gòu)體，大麻酚類(lèi)物質(zhì)之間具有緊密的關(guān)聯(lián)性，并且在一定條件下還可以相互轉(zhuǎn)化，如四氫大麻酚酸（THCA）在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為T(mén)HC和CBN[7]，這也導(dǎo)致此類(lèi)物質(zhì)在分離檢測(cè)時(shí)較為困難。

表1 常見(jiàn)大麻酚類(lèi)物質(zhì)基本信息Table 1 Essential information of common cannabinoids

文獻(xiàn)報(bào)道[8]，目前檢測(cè)大麻酚類(lèi)物質(zhì)的方法主要包括氣相色譜法[9]（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10?12]（GC-MS）、高效液相色譜法[13?16]（HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17?20]（HPLC-MS）等。在這些檢測(cè)方法中，氣相色譜法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法主要針對(duì)易揮發(fā)類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)；高效液相色譜法具有較好的普適性，但檢測(cè)物質(zhì)的靈敏度較低；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法則具有較高的選擇性、靈敏度及準(zhǔn)確度，更適用于基質(zhì)中痕量的大麻酚類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)及定量分析。

目前國(guó)內(nèi)大麻酚類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)主要有公安行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[21]及司法鑒定規(guī)范[22]，這些標(biāo)準(zhǔn)主要針對(duì)THC、CBD、CBN三種物質(zhì)，樣品基質(zhì)為人體的毛發(fā)[23]、血液[24]、尿液[25]，大麻植株[26]，火麻油[27?28]，化妝品[29]以及藥品[30]等基質(zhì)中大麻酚類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)方法研究也較多，但是涉及巧克力基質(zhì)的方法較少。目前，美國(guó)分析化學(xué)協(xié)會(huì)（AOAC）在征集巧克力中大麻酚類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)方法[31]，該方法要求目標(biāo)檢測(cè)物必須包含THC、CBD、CBN、THCA、大麻二酚酸（CBDA）這五種物質(zhì)，說(shuō)明巧克力中此五種大麻酚的同時(shí)檢測(cè)是非常有必要的。

結(jié)合我國(guó)國(guó)情，為了滿足進(jìn)出口檢驗(yàn)的需要，建立一種兼顧普適性、分辨率、準(zhǔn)確度的巧克力樣品中五種大麻酚類(lèi)物質(zhì)的分析方法是非常有必要的。本文通過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件和色譜、質(zhì)譜條件，基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立一種同時(shí)檢測(cè)黑巧克力中五種大麻酚類(lèi)物質(zhì)的分析方法，并通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化，為相關(guān)產(chǎn)品的安全監(jiān)管奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CBDA、CBD、CBN、THC、THCA標(biāo)準(zhǔn)溶液1000 μg/mL 美國(guó) Cerilliant公司；甲醇、乙腈 色譜純，德國(guó)Merck公司；甲酸 色譜級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；黑巧克力 北京物美超市。

ACCELA高效液相色譜儀、TSQQuantum Access MAX三重四極桿質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技有限公司；Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm I.D.,5.0 μm） 安捷倫科技有限公司；Supersil-ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm I.D.，5.0 μm）、Supersil ODS-B色譜柱（4.6 mm×250 mm I.D., 5.0 μm） 大連依利特分析儀器有限公司；Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ色譜柱（4.6 mm×250 mm I.D., 5.0 μm）、Hplcone-3C18色譜柱（4.6 mm×150 mm I.D., 2.0 μm） 蘇州麥克旺志生物技術(shù)有限公司；VM200型渦旋振蕩器 托摩根生物科技有限公司；HITACHI-CF15RXII離心機(jī) 日立公司；JA5003B電子天平（精確至0.01 g） 上海越平科學(xué)儀器制造有限公司；電子恒溫不銹鋼水浴鍋上海虞龍儀器設(shè)備有限公司；ELGA純水儀 威立雅水處理技術(shù)（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 將黑巧克力放置在冰箱?18 ℃保存24 h，取黑巧克力200 g，用小刀將其刮成巧克力屑，放入冰箱?18 ℃ 保存。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[27?28]，采用甲醇經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的超聲提取就能夠?qū)崿F(xiàn)大麻酚類(lèi)物質(zhì)的提取實(shí)驗(yàn)，因此本實(shí)驗(yàn)采用如下步驟進(jìn)行巧克力樣品的前處理實(shí)驗(yàn)。

準(zhǔn)確稱(chēng)取黑巧克力屑0.5 g于10 mL的離心管內(nèi)，蓋好離心管蓋，在恒溫水浴鍋45 ℃下加熱5 min，使巧克力融化，然后加入2.5 mL的甲醇，渦旋震蕩2 min，再用離心機(jī)在1000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，最后過(guò)0.22 μm的濾膜，上機(jī)。

1.2.2 檢測(cè)條件 三重四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI），采用正離子掃描模式（ESI+）和負(fù)離子掃描模式（ESI-），霧化氣為液氮；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管溫度為350 ℃；霧化氣溫度為300 ℃；鞘氣壓力為35 Arb；輔助氣壓力為5 Arb；離子噴霧電壓為3500 V；CID壓力為1.5 Torr。

高效液相色譜儀，色譜柱：Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水（V/V）溶液，流動(dòng)相B：乙腈；進(jìn)樣量：5 μL；流速：1800 μL/min；梯度洗脫程序：0~15 min，70%~95%B；15~15.1 min，95%~70%B；15.1~18 min，70%~70%B。

1.3 方法優(yōu)化及驗(yàn)證

1.3.1 方法優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)分別對(duì)質(zhì)譜部分和液相部分的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，質(zhì)譜部分主要采用蠕動(dòng)泵直接進(jìn)樣，對(duì)各個(gè)待測(cè)物的子母離子對(duì)及其碰撞能等參數(shù)分別進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳的質(zhì)譜條件；液相部分分別采用不同廠家的色譜柱以及不同洗脫程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，得出最佳的液相條件；實(shí)驗(yàn)還采用甲醇、乙腈等不同的提取溶劑對(duì)巧克力樣品前處理等過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化。

1.3.2 線性范圍、檢出限及定量限 混和標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確吸取 1 mL 的 CBDA（1000 μg/mL）、CBD（1000 μg/mL） 、 CBN（1000 μg/mL） 、 THC（1000 μg/mL）、THCA（1000 μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，配制成100 μg/mL的五種大麻酚混和標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，?18 ℃冰箱冷藏保存，有效期為3個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取0.1 mL的100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋到1 mL，得到10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別取適量的標(biāo)準(zhǔn)中間液稀 釋 得 到 0.05、 0.10、 0.25、 0.50、 1.00、 2.50、5.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)7個(gè)不同濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析，以五種化合物的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制五種大麻酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后得出五種大麻酚的線性范圍及線性回歸方程。將添加有大麻酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的巧克力樣品按照方法前處理進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定，以目標(biāo)組分最低水平的3倍平均信噪比為檢出限（LOD），10倍平均信噪比為定量限（LOQ），計(jì)算得本方法的LOD和LOQ。

1.3.3 精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)對(duì)方法的日內(nèi)和日間精密度進(jìn)行了檢測(cè)。在相同儀器條件下，實(shí)驗(yàn)分別以添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的巧克力為樣品，按照實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行前處理實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量分析，計(jì)算樣品中五種大麻酚的含量，同時(shí)計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。日內(nèi)精密度：即在每 d的 8、10、12、14、16、18時(shí)分別對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，記為日內(nèi)精密度；日間精密度：連續(xù)3 d對(duì)巧克力樣品在每d的10時(shí)進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，記為日間精密度。最終，以日內(nèi)和日間精密度對(duì)方法的精密度和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.4 方法的準(zhǔn)確性 為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)根據(jù)計(jì)算得到方法的定量限0.15 mg/kg以及標(biāo)曲的濃度點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)采用6個(gè)平行樣品，分別取定量限的8.3、16.7和33.3倍對(duì)巧克力樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，其對(duì)應(yīng)的三個(gè)加標(biāo)水平即為1.25、2.50、5.00 mg/kg，且對(duì)應(yīng)標(biāo)曲中間的三個(gè)濃度點(diǎn)0.25、0.50、1.00 μg/mL，然后計(jì)算三個(gè)加標(biāo)水平下的回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，確定該方法的準(zhǔn)確性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)采用Excel數(shù)據(jù)處理軟件和Origin數(shù)據(jù)作圖軟件分別對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。實(shí)驗(yàn)中三個(gè)加標(biāo)水平的回收率實(shí)驗(yàn)采用6個(gè)平行樣平行測(cè)定6次，采用Excel計(jì)算平均值及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果。日內(nèi)精密度采用6個(gè)平行樣平行測(cè)定6次，采用Excel計(jì)算日內(nèi)精密度；日間精密度連續(xù)3 d采用6個(gè)平行樣平行測(cè)定6次，采用Excel計(jì)算3 d的日間精密度。色譜圖均由Origin作圖軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

調(diào)整儀器狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)采用蠕動(dòng)泵直接進(jìn)樣的方式進(jìn)行優(yōu)化，配制濃度為1 μg/mL的五種大麻酚的單標(biāo)溶液，經(jīng)蠕動(dòng)泵注入質(zhì)譜儀中，分別在正離子掃描模式和負(fù)離子掃描模式下對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行全掃，選擇響應(yīng)強(qiáng)度高的離子掃描模式，再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，取目標(biāo)物的三對(duì)或多對(duì)離子對(duì)，通過(guò)系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化得到目標(biāo)物的碰撞能和套管透鏡電壓，優(yōu)化之后五種大麻酚的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 五種大麻酚的質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果Table 2 MRM parameters and MS condition for five cannabinoids

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)在相同的流動(dòng)相及洗脫梯度下，采用五種色譜柱 Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm I.D.，5.0 μm）、Supersil-ODS2 色譜柱（4.6 mm×250 mm I.D.，5.0 μm）、Supersil ODS-B 色譜柱（4.6 mm×250 mm I.D., 5.0 μm）、Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ色譜柱（4.6 mm×250 mm I.D., 5.0 μm）和 Hplcone-3C18色譜柱（4.6 mm×150 mm I.D., 2.0 μm），分別對(duì)相同濃度的五種大麻酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離分析，其HPLC-MS/MS的總離子色譜圖（Total ion chromatogram，TIC）對(duì)比見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，五種色譜柱均能完成五種大麻酚的分離，且工作站給出五種物質(zhì)峰的分離度結(jié)果均大于1。其中Zorbax SB-C18對(duì)五種大麻酚的分離效果較好，能夠達(dá)到完全分離的狀態(tài)，目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度值較高，峰型也較好，五種大麻酚能夠在12 min內(nèi)全部流出；采用Supersil ODS2色譜柱，五種大麻酚能夠達(dá)到完全分離的狀態(tài)，目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度值最高，峰型也較好，但五種大麻酚完全流出時(shí)間長(zhǎng)達(dá)17 min；采用Supersil ODS-B色譜柱，五種大麻酚能夠達(dá)到完全分離的狀態(tài)，五種大麻酚的響應(yīng)強(qiáng)度值較高，但THCA峰峰型較差，出現(xiàn)拖尾情況，五種大麻酚完全流出時(shí)間也較長(zhǎng)，達(dá)到16 min；采用Cosmosil 5C18-MS-II色譜柱，五種大麻酚能夠達(dá)到完全分離的狀態(tài)，但CBDA和CBD的響應(yīng)強(qiáng)度值差別較大且保留時(shí)間比較接近，峰型較好，五種大麻酚完全流出時(shí)間為14 min；采用Hplcone-3C18色譜柱，五種大麻酚能夠達(dá)到完全分離的狀態(tài)，目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度值較高，峰型較好，但五種大麻酚完全流出時(shí)間較長(zhǎng)，為17 min。

圖1 五種不同色譜柱對(duì)五種大麻酚分離TIC譜圖的對(duì)比Fig.1 The comparison of the TIC chromatograms of five cannabinoids by five kinds of reversed-phase C18 columns

通過(guò)對(duì)比五種色譜柱下五種大麻酚的響應(yīng)強(qiáng)度、保留時(shí)間及色譜峰峰型發(fā)現(xiàn)，安捷倫Zorbax SBC18色譜柱對(duì)五種大麻酚分離的響應(yīng)強(qiáng)度值較高，峰型較好，且保留時(shí)間最短，對(duì)五種大麻酚的分離效果最佳，因此最終選擇Zorbax SB-C18進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究及方法驗(yàn)證。

2.2.2 洗脫模式優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)分別采用梯度洗脫程序和等度洗脫程序分別對(duì)五種大麻酚進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，兩種洗脫模式下的TIC對(duì)比見(jiàn)圖2。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩種洗脫模式下五種大麻酚均能分離開(kāi)，梯度洗脫模式下，五種大麻酚的峰寬較窄且較尖銳，峰型較好；等度洗脫模式下CBN、THC、THCA的峰寬較寬，且響應(yīng)強(qiáng)度較低，保留時(shí)間較長(zhǎng)。因此，最終選擇梯度洗脫模式進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究及方法驗(yàn)證。

圖2 不同洗脫程序下五種大麻酚分離的TIC對(duì)比圖Fig.2 The comparison of the TIC chromatograms of five cannabinoids based on different separations

2.3 樣品前處理優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)采用不同的提取溶劑甲醇和乙腈，以5.00 mg/kg的添加水平進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，以五種大麻酚的回收率結(jié)果為指標(biāo)，考察了不同提取溶劑對(duì)巧克力樣品中五種大麻酚的提取效率并對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表3。由表中的數(shù)據(jù)可得，當(dāng)分別采用甲醇和乙腈作為提取溶劑時(shí)，五種大麻酚的加標(biāo)回收率都在90.6%~96.3%范圍內(nèi)，均能滿足實(shí)驗(yàn)要求，同時(shí)考慮到實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)成本，甲醇成本較低，且兩種溶劑對(duì)巧克力中五種大麻酚均具有較好的提取效果，因此實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇作為五種大麻酚的提取溶劑。同時(shí)，考察了提取溶劑的最佳使用體積，向每份巧克力樣品中添加250 μL的10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別采用2.5 mL和5.0 mL的甲醇進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，對(duì)兩種情況下五種大麻酚的回收率結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)五種大麻酚的回收率結(jié)果均較好且相當(dāng)，都在89%~101.8%范圍內(nèi)，說(shuō)明兩種情況下均能夠?qū)⑶煽肆悠分械奈宸N大麻酚提取完全，考慮實(shí)驗(yàn)的試劑成本問(wèn)題，最終選擇2.5 mL甲醇作為提取溶劑。

表3 不同溶劑對(duì)五種大麻酚提取效率的影響Table 3 Effects of different solvents on the extraction efficiency of five cannabinoids

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、檢出限和定量限 根據(jù)五種大麻酚7個(gè)濃度點(diǎn)對(duì)應(yīng)的濃度及其響應(yīng)值，分別繪制五種大麻酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明在0.05~5.00 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，五種大麻酚的響應(yīng)強(qiáng)度值與濃度有很好的線性關(guān)系，且五種大麻酚的線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.997。將添加有大麻酚標(biāo)準(zhǔn)品的巧克力樣品提取溶液逐步稀釋?zhuān)M(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，計(jì)算其峰高與基線噪音高之比，當(dāng)S/N=3（S為對(duì)照品峰高，N為基線噪音高）時(shí)的對(duì)照品濃度即為方法的檢出限（LOD），得到 CBDA、CBD、CBN、THC、THCA的檢出限為 0.01 μg/mL，即0.05 mg/kg；當(dāng)S/N=10時(shí)的濃度為方法的定量限（LOQ），得到 CBDA、CBD、CBN、THC、THCA的定量限為0.15 mg/kg，結(jié)果見(jiàn)表4。本文對(duì)比了其他文獻(xiàn)方法的定量數(shù)據(jù)[13?14]，本文方法具有更低的定量限，比文獻(xiàn)方法要低1~2個(gè)數(shù)量級(jí)，更適用于微量添加大麻酚的巧克力等食品的檢測(cè)。

表4 五種大麻酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍、檢出限及定量限Table 4 Linear range, LOD and LOQ of five cannabinoids

2.4.2 精密度和穩(wěn)定性 本文對(duì)方法的重現(xiàn)性和精密度進(jìn)行了驗(yàn)證，其日內(nèi)和日間的精密度結(jié)果見(jiàn)表5。根據(jù)表5數(shù)據(jù)可得，五種大麻酚在日內(nèi)測(cè)定6次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值RSDs范圍為2.0%~4.3%，日間連續(xù)3 d測(cè)定6次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDs范圍為2.5%~4.7%，日內(nèi)精密度和日間精密度二者的RSDs值均<5%，說(shuō)明該方法具有良好的精密度及穩(wěn)定性。

表5 五種大麻酚的精密度測(cè)試結(jié)果（n=6）Table 5 Intraday and interday precisions of the method（n = 6）

2.4.3 加標(biāo)回收率 本文對(duì)三個(gè)加標(biāo)水平1.25、2.50、5.00 mg/kg的巧克力樣品進(jìn)行的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。由表6數(shù)據(jù)可得，CBDA的回收率在94.5%~103.2%之間，RSDr<3.2%，CBD的回收率在98.5%~109.0%之間，RSDr<2.0%；CBN的回收率在96.2%~102.7%之間，RSDr<4.9%；THC的回收率在91.8%~102.3%之間，RSDr<4.6%；THCA的回收率在92.0%~108.8%之間，RSDr<4.9%，五種大麻酚的加標(biāo)回收率在91.8%~109.0%，其RSDr值在1.5%~4.9%。該結(jié)果表明，本研究建立的檢測(cè)方法在不同加標(biāo)水平下，具有較高的回收率和良好的精密度，能夠滿足巧克力樣品中5 種大麻酚類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)的要求。

表6 巧克力樣品中五種大麻酚的回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 6 The recoveries of five cannabinoids at three spiked concentrations and relative standard deviations（RSD）in dark chocolate samples（n = 6）

2.4.4 實(shí)際樣品檢測(cè) 以本方法的提取方法和儀器條件對(duì)市售的兩種黑巧克力進(jìn)行五種大麻酚的測(cè)定，結(jié)果顯示兩種黑巧克力中均未檢出五種大麻酚。

3 結(jié)論

本文建立了一種基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的同時(shí)檢測(cè)黑巧克力中五種大麻酚類(lèi)物質(zhì)的分析方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法的日內(nèi)和日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDs值均<5%，說(shuō)明該方法具有良好的精密度和穩(wěn)定性；五種大麻酚物質(zhì)在三個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為91.8%~109.0%，RSDs<5%，說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確性。同時(shí)本方法具有簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)，可以為大麻酚類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)提供技術(shù)支持，又可以為國(guó)內(nèi)大麻酚類(lèi)物質(zhì)的監(jiān)測(cè)和合理使用提供依據(jù)。