劉敏敏，謝小霞，陳 俏，胡碧波

（1.廣東省藥品檢驗(yàn)所, 廣東廣州 510663；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院中藥學(xué)院, 廣東廣州 510520）

涼茶是中草藥植物性飲料的通稱，是以中草藥為原料，以中醫(yī)養(yǎng)生理論為指導(dǎo)，具有清熱解毒、生津止渴、祛火除濕等功效的飲料。近年來(lái)，不法分子受利益驅(qū)使，向涼茶中非法添加各種化學(xué)藥物以提高其功效的問題較為嚴(yán)重[1]。罌粟殼為植物罌粟的干燥成熟果殼，可用于止痛、鎮(zhèn)靜和止咳[2]，是國(guó)家正式公布列入麻醉品名單的管制物。罌粟殼含有20多種生物堿，其中主要成分為嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁等[3?4]。涼茶中非法添加罌粟殼，可增加止咳效果，但長(zhǎng)期食用具有成癮性，可造成人的注意力下降、思維和記憶功能衰退等，長(zhǎng)期使用還會(huì)引起精神失常，出現(xiàn)幻覺，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致呼吸停止而死亡[5?6]。

目前測(cè)定罌粟殼殘留物的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法[7?8]、氣相色譜法[9?11]、高效液相色譜法[12?14]、氣質(zhì)聯(lián)用法[15?17]、液質(zhì)聯(lián)用法[18?22]、熒光PCR法[23?25]。其中液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法最為普遍，該方法靈敏度高，適用性強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)定性定量檢測(cè)，適于普及和推廣。罌粟堿類生物堿的前處理，一般采用QuEChERS法和固相萃取法[22,26?28]。這兩種方法比較復(fù)雜，操作步驟繁瑣，QuEChERS法需經(jīng)有機(jī)溶劑提取、鹽析等步驟，固相萃取法需經(jīng)溶劑提取、固相萃取柱吸附洗脫等步驟。

本研究以液體涼茶和固體涼茶顆粒這兩種典型基質(zhì)作為研究對(duì)象，針對(duì)涼茶樣品本身的特點(diǎn)，建立簡(jiǎn)單有效的樣品前處理技術(shù)，并結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)完成涼茶中5種主要罌粟殼生物堿的定性、定量快速檢測(cè)分析方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的日常監(jiān)測(cè)工作中。涼茶中非法添加化學(xué)藥物的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較多，但涼茶中非法添加罌粟殼類生物堿的研究尚未見報(bào)道。本方法準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單，為涼茶的日常監(jiān)督提供了科學(xué)、客觀的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗎啡（純度≥99.8%）、可待因（純度≥97.5%）、蒂巴因（純度100%）、鹽酸罌粟堿（純度100%）、那可丁（純度100%）、罌粟殼粉 中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈 色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司）；甲酸 色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸 分析純，廣州化學(xué)試劑廠；乙酸銨 色譜純，廣東光華科技股份有限公司；超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm，25 ℃） 美國(guó) Millipore 公司；其他試劑 均為分析純；涼茶樣品 廣東省藥品監(jiān)督管理局抽檢樣品，均來(lái)自于廣東省各地市涼茶鋪。

AB SCIEX Triple Quad 5500液質(zhì)聯(lián)用儀 美國(guó)AB SCIEX公司；Milli-Q Reference實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；電子天平 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；X1R低溫離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精密稱取嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確至0.1 mg）至5個(gè)10 mL容量瓶中，分別加0.5%甲酸甲醇溶液溶解，定容至刻度，搖勻，配制成濃度均為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。此溶液密封后?18 ℃避光保存，有效期1年。使用時(shí)根據(jù)需要吸取適量的各化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合，用乙腈稀釋成蒂巴因、罌粟堿、那可丁質(zhì)量濃度為20 μg/mL和嗎啡、可待因質(zhì)量濃度為100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液a和蒂巴因、罌粟堿、那可丁質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL和嗎啡、可待因質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液b。混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液a、b密封后4 ℃避光保存，有效期6個(gè)月。

1.2.2 樣品處理 固體樣品：稱取樣品約0.5 g（精確至0.001 g），置50 mL容量瓶中，加入約25 mL含5% HCl的20%甲醇溶液，密塞，超聲處理30 min（功率250 W，頻率20 kHz），取出，放冷，加流動(dòng)相定容，0.22 μm微孔濾膜過濾。取上清液，進(jìn)樣，再視情況稀釋。

液體樣品：量取2 mL涼茶，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容至10 mL, 0.22 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣，再視情況稀釋。

空白樣品溶液：取不含五種生物堿的陰性樣品，按樣品處理方法制備空白樣品溶液。

1.2.3 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱 (2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)；流動(dòng)相：含 0.1 % 乙酸的5 mmol/L乙酸銨溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫（見表1），流速: 0.3 mL/min；柱溫: 40 ℃；進(jìn)樣體積 5 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè) (MRM)，正離子模式，電離電壓 (IS)：4.5kv，氣簾氣 (CUR)：275.6 kPa，碰撞氣（CAD）：62 kPa，離子化溫度（TEM）：450 ℃，輔助加熱氣 1（GS1）：344.5 kPa，輔助加熱氣 2（GS2）：344.5 kPa。5 種待測(cè)物的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓（DP）及碰撞能量（CE）見表2。

表2 五種化合物的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓和碰撞能量Table 2 Qualitative pairs、quantitative pairs、de-clustering voltages and collision energies for 5 compounds

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用AB Sciex Multi Quant 色譜數(shù)據(jù)處理軟件完成數(shù)據(jù)的采集和處理。各平行樣間數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的選擇

涼茶主要包括液體涼茶和固體涼茶顆粒。涼茶中含有較多的親水性多糖、鞣質(zhì)以及葉綠素。對(duì)于液體樣品，比較了乙腈提取、QuEChERS、固相萃取法、流動(dòng)相提取4種方法（如圖1）。QuEChERS操作過程如下：樣品用鹽酸溶液分散均勻，用乙腈提取后，加入無(wú)水硫酸鎂和無(wú)水醋酸鈉的混合粉末鹽析處理，離心，取上清液檢測(cè)。固相萃取法操作過程如下：樣品溶液用固相萃取柱（Waters Oasis MCX 60 mg，3 mL）吸附，依次用水和甲醇洗滌，用氨化甲醇溶液（5%）洗脫，收集洗脫液用氮?dú)獯蹈?，殘留物用流?dòng)相定容測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乙腈提取不完全，液面分層，回收率低；固相萃取法回收率較低，可能是因?yàn)橄疵摬煌耆?；QuEChERS法提取效率和流動(dòng)相提取回收率均較高，但是流動(dòng)相提取操作簡(jiǎn)便，故采用了流動(dòng)相提取。固體樣品比較了流動(dòng)相、QuEChERS、固相萃取法、含5%鹽酸的20%甲醇溶液提取4種方法。結(jié)果顯示含5%鹽酸的20%甲醇溶液提取效率最高。

圖1 5種罌粟殼生物堿在采用不同提取溶劑時(shí)的提取效率Fig.1 Extraction efficiency of 5 alkaloids in different solvent

2.2 色譜柱的選擇

5種生物堿極性較大，在反相色譜柱上很難保留,一直以來(lái)是色譜分離技術(shù)的難點(diǎn)。目前的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，大都采用Hilic柱進(jìn)行檢測(cè)。Hilic柱為正向色譜柱，優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，缺點(diǎn)是受溶劑限制大，要求樣品溶劑中含有70%以上乙腈，使樣品前期的提取與純化使用的提取溶劑受到限制，且使用壽命短，價(jià)格昂貴。本實(shí)驗(yàn)比較了正向色譜柱、離子交換色譜柱、反相色譜柱三種不同類型的色譜柱：Hilic柱、CR柱、亞3 μm填料核殼色譜柱（圖2）。CR柱是將多孔球形硅膠表面包覆了單層有機(jī)硅聚合物薄膜后再分別導(dǎo)入十八烷基和磺酸基制成的離子交換色譜柱。流動(dòng)相可調(diào)節(jié)空間大，對(duì)前處理溶劑要求小，缺點(diǎn)是離子交換力強(qiáng)，相對(duì)峰形較寬；且保留時(shí)間容易發(fā)生漂移，不耐用。本實(shí)驗(yàn)采用Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）反相色譜柱分離，取得了良好的分離效果。本實(shí)驗(yàn)采用的亞3 μm填料核殼色譜柱具有Fused-core獨(dú)特核殼結(jié)構(gòu)，顯著改善了色譜峰形及分離度。此色譜柱分析時(shí)的壓力僅為21.5 MPa，在常規(guī)低壓液相色譜儀上也能實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合物的快速分離；所用2 μm入口篩板孔徑較大，避免篩板孔徑過小發(fā)生堵塞，色譜柱較耐用。

圖2 三種色譜柱的MRM色譜圖Fig.2 MRM spectra of 3 chromatographic column

2.3 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化。有機(jī)相比較了甲醇和乙腈，相同梯度條件下使用甲醇作有機(jī)相，目標(biāo)化合物能獲得更好的分離效果。水相比較了0.1%甲酸和0.1%乙酸的5 mmol/L乙酸銨溶液，采用0.1%乙酸的5 mmol/L乙酸銨溶液分析效果較好，故本文采用含0.1 %乙酸的5 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇梯度洗脫流動(dòng)相體系。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect) 是指檢測(cè)系統(tǒng)在分析樣品中的分析物時(shí)，處于分析物周圍的基質(zhì)對(duì)分析物測(cè)定結(jié)果的影響。涼茶含有中藥材成分基質(zhì)復(fù)雜，有必要對(duì)其進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)考察。研究選取了固體涼茶顆粒和液體涼茶兩種基質(zhì)，采用SSE% = (基質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/空白溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)×100的計(jì)算方法對(duì)5種化合物的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，當(dāng)SSE%在80%~120%之間時(shí)，表示基質(zhì)效應(yīng)不明顯[24]?；|(zhì)效應(yīng)結(jié)果如表3。結(jié)果顯示，5種化合物在兩種基質(zhì)中的SSE%值在80%~120%之間，可認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)不明顯，在實(shí)際檢測(cè)過程中，可忽略不計(jì)。

表3 5種生物堿的基質(zhì)效應(yīng)考察Table 3 Matrix effect of 5 alkaloids

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 取“1.2.1”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液b適量，用流動(dòng)相適當(dāng)稀釋后按“1.2.3”“1.2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，5種罌粟殼生物堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、涼茶基質(zhì)空白溶液和陽(yáng)性涼茶樣品MRM結(jié)果見圖3。

圖3 混合溶液MRM色譜圖Fig.3 MRM spectra of mixed solution

配制嗎啡、可待因質(zhì)量濃度為2.5、5、10、25、50、100 ng/mL，蒂巴因、罌粟堿、那可丁質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5、10 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明（見表4），嗎啡、可待因的線性范圍為2.5~100 ng/mL，蒂巴因、罌粟堿、那可丁的線性范圍為0.5~20 ng/mL，5種罌粟殼類生物堿的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995（R>0.995）。表明在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，各化合物呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2 檢出限和定量限 分別精密量取“1.2.1”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液b，用不含5種罌粟殼類生物堿涼茶樣品溶液稀釋，在“1.2.3”“1.2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣。按照信噪比S/N≥10計(jì)算定量限(LOQ)，S/N≥3計(jì)算檢出限(LOD)。嗎啡、可待因檢出限為0.8 μg/g，罌粟堿、蒂巴因、那可丁為0.2 μg/g，結(jié)果見表4。

表4 5種生物堿的線性關(guān)系及檢出限、定量限Table 4 Linear ranges, limits of detection（LOD）and limits of quantitaion（LOQ）of 5 alkaloids

2.5.3 加標(biāo)回收試驗(yàn) 以不含5種生物堿成分的涼茶樣品作為空白基質(zhì)，添加高、中、低3個(gè)濃度水平的對(duì)照品溶液，按照“1.2.2”項(xiàng)下進(jìn)行處理，結(jié)果見表5。5種生物堿成分的3個(gè)添加水平在液體基質(zhì)中回收率為84.5%~105.1%, RSD不大于6.3%；固體基質(zhì)中回收率為72.5%~112.3%，RSD不大于7.1%。

表5 空白樣品中5種生物堿的添加回收率（n=6）Table 5 Recovery of 5 alkaloids from blank samples（n=6）

2.5.4 精密度試驗(yàn) 取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在“1.2.3”“1.2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各物質(zhì)的色譜峰面積。結(jié)果顯示，5種成分的RSD值均小于0.2%，表明儀器精密度良好。

2.5.5 樣品測(cè)定 用建立的方法對(duì)150批涼茶樣品進(jìn)行了檢測(cè)，共6批檢出含有罌粟殼類生物堿（表6）。其中5批檢出含多種罌粟殼類生物堿，1批含有可待因。每批次涼茶樣品罌粟殼類生物堿總量范圍在10.96~353.81 mg/kg。

表6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 6 Actual sample test results

3 結(jié)論

本文首次對(duì)涼茶中非法添加罌粟殼進(jìn)行了研究。通過對(duì)前處理方法和儀器色譜條件的優(yōu)化，建立了定性、定量快速檢測(cè)涼茶中非法添加的嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁等5種罌粟殼類生物堿的方法，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，涼茶中非法添加罌粟殼類生物堿情況存在，且添加濃度比較大，嗎啡作為強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥常用量為5~15 mg，一周以上可成癮。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)嗎啡最大添加濃度達(dá)到275 mg/kg，一批樣品中所含有的罌粟殼類生物堿總量達(dá)到353.81 mg/kg，存在較大的安全隱患，應(yīng)引起監(jiān)管部門的足夠重視。