王欣欣，陳奕名，劉曉妍，位正鵬，王 鵬，劉瑞志，閆鳴艷，李銀平,

（1.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院, 山東青島266042；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東青島266003；3.中國環(huán)境科學(xué)研究院, 北京100012；4.海洋功能食品國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 山東榮成 264309）

金槍魚是大洋暖水性洄游魚類，廣泛分布于世界中低緯度的近海、外海和大洋等地，是重要的經(jīng)濟(jì)魚種[1]，主要用于制作罐頭、魚干等產(chǎn)品。蒸煮是金槍魚加工過程中的主要步驟之一，每加工1 t原料，將產(chǎn)生0.5 t左右的蒸煮液[2?3]。蒸煮液成分復(fù)雜，主要包括蛋白質(zhì)、游離氨基酸、肽類、糖、脂類等物質(zhì)[4]。這些蒸煮液由于量大且難以儲(chǔ)存，往往得不到妥善地處理，一般直接排放，既造成資源的巨大浪費(fèi)，又造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。

有研究發(fā)現(xiàn)，通過添加外源蛋白酶從低值的魚蒸煮液中制備多肽，可以得到營養(yǎng)價(jià)值高且必需氨基酸含量豐富的多肽，可用作保健食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的新型原料[5]。林云等[6]以鯖魚罐頭生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的蒸煮液為原料，采用復(fù)合酶分段酶解技術(shù)獲得不同相對(duì)分子質(zhì)量的生物活性肽，并研究了其抗氧化活性和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性。此外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，向金槍魚加工蒸煮液中加入一定體積的無水乙醇后，可以沉淀出大量的蛋白，經(jīng)簡單表征后發(fā)現(xiàn)該蛋白的性質(zhì)和明膠極為相似。明膠是膠原水解后的產(chǎn)物，屬于一種大分子的親水膠體。魚明膠作為生物聚合物之一，被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物明膠的優(yōu)良替代品[7]，且由于其獨(dú)特的功能特性，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域。如因其安全、經(jīng)濟(jì)、無副作用等特點(diǎn)，具有弱抗原性、生物可降解性及對(duì)血小板的凝聚作用，近年來也逐漸應(yīng)用于治療創(chuàng)傷和燒傷修復(fù)的材料等[8]。

因此，從蒸煮液中提取蛋白對(duì)于水產(chǎn)加工企業(yè)廢棄液的環(huán)?；?、高值化開發(fā)具有重要意義。但目前對(duì)于從金槍魚蒸煮液中提取蛋白并對(duì)蛋白進(jìn)行表征方面的研究鮮見報(bào)道。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)金槍魚蒸煮液中蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件，并通過傅立葉紅外掃描、紫外掃描分析、圓二色譜分析、氨基酸分析等方法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚蒸煮液 浙江省宏利達(dá)有限公司；無水乙醇、石油醚 分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；鹽酸 分析純，煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司；氫氧化鈉 分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；苯酚、福林酚 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；濃硫酸 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

FDU-1200真空冷凍干燥機(jī) 東京理化器械株式會(huì)社；Nicolet傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司；J-1500圓二色光譜儀 日本JASCO公司；UV-6100紫外分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司； S-433D全自動(dòng)氨基酸分析儀 德國Sykam公司；CT14RDⅡ高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蒸煮液成分測(cè)定 將魚蒸煮液解凍后過300目篩絹，測(cè)定其基本組成成分?；曳趾繙y(cè)定：GB 5009.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》；鹽度：JG 761-2016《電極式鹽度計(jì)檢定規(guī)程》，鹽度計(jì)測(cè)定；總脂肪含量測(cè)定：GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》；總糖含量測(cè)定[9]：苯酚-硫酸顯色法；蛋白質(zhì)含量測(cè)定[10?11]：凱氏定氮法、Folin-酚試劑法。

1.2.2 蒸煮液蛋白提取工藝 取適量金槍魚蒸煮液，按一定料液比加入無水乙醇，分別在不同溫度下攪拌反應(yīng)一定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后，4000 r/min離心15 min，取沉淀加入一定量的去離子水復(fù)溶，4000 r/min離心15 min，將上清液真空冷凍干燥后得蒸煮液蛋白，粉碎后對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征分析。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 pH對(duì)提取率的影響 在料液比1:2.5 mL/mL、提取時(shí)間3 h、固形物含量10%、室溫（25 ℃）的條件下，考察 pH2.0、4.0、6.0、8.0、10.0對(duì)蒸煮液蛋白提取率的影響。

1.2.3.2 料液比對(duì)提取率的影響 在提取時(shí)間3 h、原始pH6.32、固形物含量10%、室溫（25 ℃）的條件下，考察料液比（v（樣品）:v（乙醇）=1:0.5、1:1.0、1:1.5、1:2.0、1:2.5、1:3.0、1:3.5 mL/mL）對(duì)蒸煮液蛋白提取率的影響。

1.2.3.3 溫度對(duì)提取率的影響 在料液比1:2.5 mL/mL、提取時(shí)間3 h、原始pH6.32、固形物含量10%的條件下，考察提取溫度 25、30、35、40、45、50 ℃ 對(duì)蒸煮液蛋白提取率的影響。

1.2.3.4 固形物含量對(duì)提取率的影響 對(duì)蒸煮液進(jìn)行減壓濃縮或稀釋，獲得不同固形物含量樣品，在料液比1:2.5 mL/mL、提取時(shí)間3 h、原始pH6.32、溫度35 ℃的條件下，考察固形物含量10%、20%、30%、40%對(duì)蒸煮液蛋白提取率的影響。

1.2.3.5 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 在料液比1:2.5 mL/mL、原始pH6.32、固形物含量10%、溫度35 ℃ 的條件下，考察提取時(shí)間 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h對(duì)蒸煮液蛋白提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溫度、時(shí)間、料液比3個(gè)因素，以蛋白提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[12?14]。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 蒸煮液蛋白結(jié)構(gòu)表征

1.2.5.1 氨基酸組成分析 氨基酸組成分析：參照GB 5009.124-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》[15]，采用氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)其進(jìn)行分析。

1.2.5.2 紫外（Ultraviolet, UV）掃描分析 參考趙蒼碧等[16]的方法，將樣品置于紫外-可見光掃描儀上進(jìn)行180~300 nm波長范圍內(nèi)掃描。

1.2.5.3 傅里葉紅外（Fourier Transform Infrared,FTIR）光譜分析 參考ZHU等[17]的方法，采用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)樣品在500~4000 cm?1區(qū)間掃描。

1.2.5.4 圓二色譜（Circular Dichroism, CD）分析參考WANG等[18]的方法，取適量樣品溶液置于光程為1 mm的樣品池中進(jìn)行掃描分析。掃描波數(shù)為190~260 nm，溫度為 4 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用 Excel、Origin 9.0軟件和 Design Expert 8數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次平均值，以折線圖形式表現(xiàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒸煮液成分分析

測(cè)定金槍魚蒸煮液中蛋白質(zhì)、總糖、灰分、鹽度、油脂含量，結(jié)果如表2所示。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可得，金槍魚蒸煮液中蛋白質(zhì)含量較高為25.51%，是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)提取的理想原料。粗脂肪含量為14.4%，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[19]，金槍魚中脂肪多屬于不飽和脂肪酸，利于心血管疾病的預(yù)防，還含有少量總糖和灰分，分別占比3.57%、2.45%。

表2 金槍魚蒸煮液基本成分含量Table 2 Content of basic components in tuna cooking liquid

2.2 蒸煮液蛋白提取實(shí)驗(yàn)

2.2.1 pH對(duì)蛋白提取的影響 由圖1可知，隨著pH的增大，蒸煮液蛋白提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在pH4.0和6.0時(shí)其提取率最高為53.22%、55.09%。當(dāng)pH為8.0和10.0時(shí)，其提取率有所降低，但不明顯，分別為50.18%、45.05%。當(dāng)pH為2.0時(shí)，其提取率明顯降低，為23.66%。因此推測(cè)該蛋白的等電點(diǎn)可能在4.0~6.0之間，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液pH處于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子表面不帶電荷呈電中性，分子間的斥力減弱，容易受靜電引力影響聚集而產(chǎn)生沉淀[20]。

圖1 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of pH on protein extraction rate

2.2.2 料液比對(duì)蛋白提取的影響 由圖2可知，隨著料液比的增加，蒸煮液蛋白提取率逐漸增大，料液比為1:2.5 mL/mL時(shí)，蛋白質(zhì)提取率為61.44%，相較于料液比為1:1.5 mL/mL時(shí)提升了兩倍，可知料液比對(duì)蛋白提取率影響較大。因?yàn)殡S著料液比增大，蒸煮液與乙醇的接觸面積增大，提高了蛋白質(zhì)擴(kuò)散速度，從而提高了蛋白提取率[21]。繼續(xù)擴(kuò)大料液比，蛋白提取率變化趨于平緩，可能是因?yàn)橐掖歼^量，蛋白質(zhì)擴(kuò)散趨于飽和，因此蛋白提取率變化不明顯。

圖2 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on protein extraction rate

2.2.3 溫度對(duì)蛋白提取的影響 由圖3可知，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)提取率呈小幅度先升后降趨勢(shì)，在35 ℃時(shí)達(dá)到最高，原因可能是溫度過高蛋白質(zhì)開始逐步變性，因此選擇35 ℃為蒸煮液蛋白最適提取溫度。

圖3 溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on protein extraction rate

2.2.4 固形物含量對(duì)蛋白提取的影響 不同生產(chǎn)廠家，不同加工批次，其蒸煮液中的固形物含量均會(huì)存在較大差異，為驗(yàn)證該提取工藝的穩(wěn)定性，研究不同固形物含量對(duì)蛋白提取的影響具有重要意義。如圖4所示，固形物含量不同，蛋白質(zhì)提取率存在一定差異，但都高于60%，說明本工藝可以應(yīng)用于大部分蒸煮液樣品中蛋白的提取。

圖4 固形物含量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of solid content on protein extraction rate

2.2.5 時(shí)間對(duì)蛋白提取的影響 由圖5可知，當(dāng)提取時(shí)間為0.5~3 h時(shí)，蛋白的提取率隨著時(shí)間的延長而升高，提取時(shí)間較短，蛋白沉淀不完全。當(dāng)提取時(shí)間為4 h時(shí)，蛋白的提取率略有下降，可能原因是提取時(shí)間過長導(dǎo)致蛋白分解[22]，因此選擇3 h作為最佳提取時(shí)間。

圖5 時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of time on protein extraction rate

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化

2.3.1 模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取提取溫度、時(shí)間、料液比3個(gè)因素，按照Box-Behnken原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到溫度、時(shí)間、料液比的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=74.06?2.69A?0.087B+12.48C?1.26AB+2.83AC?2.58BC?3.29A2?0.63B2?9.00C2

方程的決定系數(shù)R2=0.9533，說明方程的擬合度較好，可通過二次方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

由表4可知，回歸模型極顯著（P=0.0007<0.01），證明模型可靠，可以用于預(yù)測(cè)蒸煮液蛋白質(zhì)提取率。各因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響大小順序?yàn)镃（料液比）>A（溫度）>B（時(shí)間）。其中，模型的極顯著因子項(xiàng)（P<0.01）為C和C2，可知料液比對(duì)蛋白提取的影響極其顯著，與單因素結(jié)果一致。

表4 提取工藝回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of regression model of extraction process

2.3.2 響應(yīng)面交互分析 響應(yīng)面的坡度平緩表示兩因素的交互作用不顯著，坡度較陡表示兩因素交互作用顯著。試驗(yàn)中所考察的三個(gè)因素對(duì)魚蒸煮液蛋白質(zhì)提取率影響的交互作用見圖6。由圖6（a~c）可知，在三組交互作用中，AC（溫度和料液比）交互作用最強(qiáng)，其次是 BC（時(shí)間和料液比）的交互作用，而AB（溫度和時(shí)間）的交互作用最弱，這與表4顯著性檢驗(yàn)得到的結(jié)果一致。

圖6 各因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface map of the effects of various factors on protein extraction rate

2.3.3 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 由Design-Expert 8.0軟件計(jì)算得出乙醇法提取金槍魚蒸煮液蛋白的最佳工藝條件：溫度35.77 ℃，時(shí)間2 h，料液比2.43，蛋白質(zhì)提取率為79.87%?？紤]實(shí)際操作，將優(yōu)化參數(shù)修正為提取溫度36.00 ℃，時(shí)間2 h，料液比2.40。采用修正后的提取條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際提取率為76.83%±0.24%，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值在95%置信區(qū)間內(nèi)沒有顯著差異，表明該響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可靠，具有實(shí)際參考價(jià)值。

2.4 蒸煮液蛋白結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 氨基酸組成分析 氨基酸是構(gòu)成生物體營養(yǎng)組分蛋白質(zhì)的基本單位，同時(shí)也是細(xì)胞生長過程中必要的營養(yǎng)成分。蒸煮液蛋白的氨基酸組成見表5，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸含量較高，分別為17.27%、8.09%、8.58%和10.21%，這與從金槍魚魚皮中提取的明膠相似[23]。金槍魚蒸煮液提取的蛋白的亞氨基酸含量為18.79%，與已報(bào)道的冷水魚類明膠中亞氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在17%左右[24]相符合。

表5 魚蒸煮液蛋白氨基酸分析結(jié)果Table 5 Amino acid analysis results of fish cooking liquid protein

2.4.2 紫外（UV）掃描分析 通常蛋白質(zhì)中存在色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸，這些氨基酸由于共軛雙鍵的存在，在紫外波長280 nm左右有明顯的吸收峰。而明膠中的芳香族氨基酸含量較少，使其在280 nm處的吸收峰不明顯[25]。此外，由于明膠中存在C＝O、CONH2、—COOH等發(fā)色基團(tuán)，紫外特征吸收峰通常出現(xiàn)在220 nm左右[26]。從圖7可以看出，從金槍魚蒸煮液中提取的蛋白在218 nm處有較高的吸收峰，而在280 nm處沒有明顯吸收峰，說明該提取蛋白中的芳香族氨基酸含量較少，與其氨基酸分析結(jié)果一致。

圖7 魚蒸煮液蛋白紫外掃描圖Fig.7 UV scan of fish cooking liquid protein

2.4.3 傅里葉變換紅外（FTIR）光譜分析 如圖8所示，魚蒸煮液蛋白紅外光譜峰具有膠原蛋白的特征振動(dòng)模式，其酰胺A帶、酰胺B帶、酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶分別出現(xiàn)在 3270.83、2934.72、1632.01、1538.75、1236.97 cm-1，與文獻(xiàn)中報(bào)道的虹鱒魚皮膠原蛋白的吸收峰位置一致[27]。酰胺A帶、B帶的吸收分別與NH鍵、CH2的伸縮振動(dòng)有關(guān)[28]。酰胺Ⅰ帶代表C＝O的伸縮振動(dòng)，對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化非常敏感；酰胺Ⅱ帶與CH2和NH鍵的彎曲振動(dòng)有關(guān)；酰胺Ⅲ帶與CH2的彎曲振動(dòng)有關(guān)。酰胺A帶和酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶、Ⅲ帶與膠原蛋白內(nèi)部的氫鍵形成有關(guān)，反映了肽鏈的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象[29]。膠原蛋白水解成明膠的過程即是膠原三螺旋結(jié)構(gòu)解旋并逐漸水解的過程，蒸煮液蛋白質(zhì)在1236.97 cm-1處出現(xiàn)酰胺III帶的吸收峰，說明在蛋白質(zhì)提取時(shí)，三螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞但仍有保留[23]。此外，蒸煮液蛋白在2934.72 cm?1的吸收峰是由C-H鍵的伸縮振動(dòng)引起的，1450.19 cm?1的吸收峰是由-CH-、-CH3的彎曲振動(dòng)引起的，1403.37 cm?1的吸收峰是由-CH2-鍵的搖擺振動(dòng)引起的，1079.53 cm?1的吸收峰是由于C-NC振動(dòng)或C-O鍵的伸縮振動(dòng)，這些吸收峰的存在說明魚蒸煮液蛋白質(zhì)屬于順式構(gòu)型[30]。多肽大部分肽鏈中的肽單位都是反式構(gòu)型，只有脯氨酸和羥脯氨酸的殘基肽單位是順式構(gòu)型[31]，與魚蒸煮液蛋白氨基酸組成結(jié)果相一致（脯氨酸和羥脯氨酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.79%），這也說明本實(shí)驗(yàn)所制得的蛋白為明膠。

圖8 魚蒸煮液蛋白FTIR圖Fig.8 FTIR diagram of fish cooking liquid protein

2.4.4 圓二色譜（CD）分析 圓二色譜是一種根據(jù)光學(xué)活性物質(zhì)對(duì)左旋和右旋圓偏振光的吸收差異原理分析蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的方法[32]。遠(yuǎn)紫外（190~250 nm）CD譜反映肽鍵的圓二色性，肽鍵的排列具有高度規(guī)律性，排列的方向決定了肽鍵能級(jí)躍遷的分裂情況，對(duì)蛋白在此范圍內(nèi)的譜帶位置和吸收強(qiáng)弱進(jìn)行分析可以判斷肽鏈的立體結(jié)構(gòu)信息[33]。因此，利用遠(yuǎn)紫外CD對(duì)魚蒸煮液蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入分析，將蛋白溶液放入圓二色譜儀中進(jìn)行光譜掃描結(jié)果如圖9所示，魚蒸煮液蛋白在198 nm附近出現(xiàn)明顯的吸收峰負(fù)峰，但是220 nm處沒有出現(xiàn)正峰。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，220 nm處吸收強(qiáng)度可表征三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性，當(dāng)?shù)鞍鬃冃曰蛘呷陕菪Y(jié)構(gòu)遭到破壞時(shí)，220 nm處吸收峰會(huì)發(fā)生變化[34]，因此結(jié)果表明本研究提取的魚蒸煮液蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)在高溫蒸煮過程中遭到破壞。

圖9 魚蒸煮液蛋白圓二色譜圖Fig.9 Circle dichrogram of fish cooking liquid protein

3 結(jié)論

采用乙醇法對(duì)金槍魚蒸煮液蛋白進(jìn)行提取并分析了其結(jié)構(gòu)特性。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了金槍魚蒸煮液蛋白的最佳提取工藝條件：提取溫度36 ℃，提取時(shí)間2 h，料液比2.40，此條件下蒸煮液中蛋白的提取率可達(dá)76.83%。氨基酸組成分析結(jié)果顯示其亞氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.79%，其中羥脯氨酸含量為10.21%；紫外光譜顯示其在218 nm處有較高的吸收峰，而在280 nm處沒有明顯吸收峰；其紅外圖譜具有膠原蛋白紅外光譜特征吸收峰；圓二色譜說明該研究制備的金槍魚蒸煮液蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，以上結(jié)果說明采用該工藝從金槍魚蒸煮液中提取的蛋白為明膠。本研究為金槍魚蒸煮液蛋白的深度開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。