石 月，王金廂，李學(xué)鵬,2, ，勵(lì)建榮，李婷婷，郭曉華，黃建聯(lián)，丁浩宸

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心, 國(guó)家魚糜及魚糜制品加工技術(shù)研發(fā)分中心, 遼寧錦州 121013；2.大連工業(yè)大學(xué), 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心, 遼寧大連116034；3.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 遼寧大連 116600；4.山東美佳集團(tuán)有限公司, 山東日照 276815；5.遼寧安井食品有限公司, 遼寧鞍山 361003）

我國(guó)水產(chǎn)加工行業(yè)每年加工量超過1000萬(wàn)噸，通常魚頭骨和脊骨占魚體重的10%~15%，是僅次于魚皮的第二大加工副產(chǎn)物[1]。魚骨排具有高蛋白、低脂肪的營(yíng)養(yǎng)特性，鈣磷比接近2:1，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富。然而，我國(guó)在水產(chǎn)品加工和綜合利用方面比較落后，加工時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物如魚骨排等得不到有效地利用，造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失和環(huán)境壓力，其開發(fā)利用已引起行業(yè)高度重視。因此，對(duì)魚骨資源進(jìn)行高值化利用具有一定的研究意義。但目前，關(guān)于魚骨排加工利用的研究報(bào)道主要集中在即食魚骨和魚骨泥的制作與應(yīng)用等方面[2?4]，有關(guān)魚骨泥酶解及其呈味特性的研究仍鮮見報(bào)道。

酶解技術(shù)反應(yīng)條件溫和，酶解產(chǎn)物安全性高，在動(dòng)植物蛋白資源加工利用、生物多肽制備、香氣改善等方面應(yīng)用廣泛。魚骨排經(jīng)酶解可以釋放出多肽、游離氨基酸等物質(zhì)，可改善風(fēng)味，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與應(yīng)用范圍。ATMA等[5]利用酶解技術(shù)從魚骨中獲取生物活性多肽；TAN等[6]將鱈魚骨高溫處理后進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)酶解液具有較好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；楊會(huì)成等[7]將金槍魚骨酶解制備成骨膠原蛋白肽，再與檸檬酸鈣進(jìn)行螯合，研究發(fā)現(xiàn)鈣肽螯合物具有增加成骨細(xì)胞分泌堿性磷酸酶的生物活性作用；毛毛等[8]利用高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)與復(fù)合酶解技術(shù)對(duì)骨膠原多肽風(fēng)味進(jìn)行了優(yōu)化研究；董燁等[9]研究了不同預(yù)處理方式對(duì)鳙魚酶解液的氨基酸和揮發(fā)性成分的影響；這些研究為魚骨排的高值化利用提供了一定參考。

為了提高魚骨排的酶解效率，采用超微粉碎的預(yù)處理方式將魚骨排制備成魚骨泥。超微粉碎作為一種綠色高效的原料處理方法，被廣泛應(yīng)用于骨制品的預(yù)處理中。魚骨在超微粉碎過程中，受到剪切和擠壓力的作用，膠原蛋白三維結(jié)構(gòu)遭到破壞，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流出，同時(shí)增強(qiáng)了蛋白酶和底物的碰撞，有利于提升酶解效率，提高呈味化合物的含量，有益于整體風(fēng)味的提升。

本研究以鱈魚骨排為主要原料，采用超微粉碎法制備魚骨泥后再進(jìn)行酶解處理，對(duì)魚骨泥酶解工藝進(jìn)行了深入探究，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)獲得了最佳酶解條件。在此基礎(chǔ)上，對(duì)魚骨泥和酶解液的風(fēng)味及呈味化合物進(jìn)行了深度對(duì)比，剖析了酶解對(duì)魚骨泥呈味特性的影響，為魚骨副產(chǎn)物的綜合利用提供的一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱈魚骨排 大連天寶綠色食品股份有限公司；木瓜蛋白酶（80萬(wàn) U/g）、中性蛋白酶（20 萬(wàn) U/g）、風(fēng)味蛋白酶（3萬(wàn) U/g） 丹麥諾維信公司；NaOH滴定液 阿拉丁試劑（上海）有限公司；氯化鉀、甲醛 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SQW-6J細(xì)胞破壁超微粉碎機(jī) 濟(jì)南三清易辰超微粉碎技術(shù)有限公司；SORVALL Stratos型冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；FOSS 8400全自動(dòng)定氮儀 瑞典FOSS公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立高新技術(shù)公司；PEN3便攜式電子鼻

德國(guó)AIRSENSE公司；ZB-20 型斬拌機(jī) 諸城市瑞恒食品機(jī)械廠；SA402B電子舌 日本Nikon公司；avourSpec?風(fēng)味分析儀 中國(guó)海能儀器股份有限公司；RRH-A250型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 上海緣沃工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚骨排基本成分的測(cè)定 魚骨中水分、灰分、蛋白質(zhì)、脂肪含量分別按 GB 5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定》直接干燥法[10]、GB 5009.4-2016《食品中灰分的測(cè)定》高溫灰化法[11]、GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》凱氏定氮法[12]、GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測(cè)定》索氏提取法[13]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 魚骨泥制備工藝流程 鱈魚骨排→清洗→切塊（2 cm×2 cm）→漂白→清洗→粗粉碎 (斬拌機(jī)) →細(xì)粉碎 (骨泥機(jī)) →超微粉碎 (高精密濕法超微粉碎機(jī)) →離心脫水 (4000 r/min，5 min) →超微細(xì)魚骨泥

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 蛋白酶種類的篩選 分別采用木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶對(duì)魚骨泥進(jìn)行酶解，以料液比為 1:2（g/mL），加酶量 1.5%，酶解溫度 50 ℃，酶解時(shí)間5 h的條件進(jìn)行酶解。酶解完成后，沸水浴滅酶 10 min，在 4 ℃ 條件下，5000 r/min離心 10 min，獲得上清液備用，以水解度為指標(biāo)評(píng)價(jià)酶解效果。

1.2.3.2 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響 稱取30 g魚骨泥在酶解溫度為 50 ℃，加酶量為1%，料液比為1:2（g/mL）的條件下，考察酶解時(shí)間 2、3、4、5、6 h對(duì)水解度的影響。

1.2.3.3 加酶量對(duì)水解度的影響 稱取30 g魚骨泥在酶解溫度為50℃，料液比為1:2（g/mL），酶解時(shí)間為5 h，考察酶添加量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%對(duì)水解度的影響。

1.2.3.4 料液比對(duì)水解度的影響 稱取30 g魚骨泥在酶解溫度為50 ℃，加酶量為1%，酶解時(shí)間為5 h，考察料液比 1:1、1:2、1:3、1:4、1:5（g/mL）對(duì)水解度的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在研究酶解時(shí)間、料液比、加酶量這三個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步研究酶解效果，在50 ℃條件下利用風(fēng)味蛋白酶酶解，以水解度為指標(biāo)，利用 Design Expert 8.0軟件，采用 Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，確定酶解魚骨泥最佳工藝，因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

1.2.5 水解度的測(cè)定 采用甲醛滴定法，按照下式計(jì)算：

式中：總氮含量采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》凱氏定氮法測(cè)定[12]；氨基酸態(tài)氮含量采用GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》測(cè)定[14]。

1.2.6 電子鼻測(cè)定 參考GAO[15]的方法略有修改，準(zhǔn)確稱取10 g樣品于50 mL燒杯內(nèi)，酶解液稱取15 mL，用三層保鮮膜密封，室溫下靜置20 min，然后依次用電子鼻對(duì)揮發(fā)性氣味進(jìn)行分析檢測(cè)，每組樣品做3個(gè)平行。電子鼻載氣為干燥空氣，設(shè)置測(cè)試時(shí)間為120 s，清洗時(shí)間為120 s。

1.2.7 電子舌測(cè)定 準(zhǔn)確稱取30 g樣品于料理機(jī)中，按照料水比1:4（g/mL）的比例加入蒸餾水，絞碎、混勻，再以9000 r/min離心10 min，再經(jīng)0.45 μm和0.22 μm濾膜抽濾至澄清；酶解液的前處理方法同樣品，準(zhǔn)確稱取30 mL酶解液按照料水比1:4（g/mL）的比例混勻，離心、抽濾；分別取40 mL的上清液于電子舌專用樣品杯中。按照設(shè)置的序列放置在電子舌自動(dòng)進(jìn)樣器上進(jìn)行檢測(cè)，單次采樣時(shí)間為120 s，1次/s。每組樣品重復(fù)檢測(cè)4次，運(yùn)用系統(tǒng)自帶數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)，選取傳感器信號(hào)趨于穩(wěn)定時(shí)即第120 s的響應(yīng)值，對(duì)后3次采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行味覺特征分析。

1.2.8 GC-IMS檢測(cè) 稱取2.0 g樣品和2 mL酶解液分別置于20 mL頂空瓶中，設(shè)置孵育溫度60 ℃，孵化轉(zhuǎn)數(shù)500 r/min，孵育15 min，采用頂空自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為500 μL，進(jìn)樣針溫度65 ℃。色譜柱類型：MXT-5 (15 m×0.53 mm，1 μm)，柱溫 60 ℃，IMS溫度45 ℃，分析時(shí)間30 min，載氣/漂移氣為N2。

1.2.9 游離氨基酸測(cè)定 稱取5.0 g樣品于料理機(jī)中絞碎后，以9500 r/min勻漿三次（每次10 s），加入20 mL超純水，然后加入5%三氯乙酸20 mL，攪拌均勻。于4 ℃靜置12 h，用中性定性濾紙過濾，去除懸浮物。然后加入超純水，得到最終體積為50 mL。樣品經(jīng)過0.22 μm濾膜，注入自動(dòng)氨基酸分析儀。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行方差分析處理，以 Duncan’s 法進(jìn)行檢驗(yàn)，取95%置信度（P<0.05），結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用 Origin 9.0 軟件作圖。GC-IMS結(jié)果通過Reporter插件直接對(duì)比樣品間譜圖差異（二維俯視圖、三維譜圖），結(jié)合Gallery Plot插件對(duì)指紋圖譜對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚骨排基本成分測(cè)定結(jié)果

魚骨排中基本成分含量如表2所示，魚骨中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)，適用于后續(xù)魚骨泥酶解的研究。

表2 鱈魚骨排的營(yíng)養(yǎng)組成成分表Table 2 Nutrient composition of cod bone row

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

酶解法便于控制且反應(yīng)條件溫和，由于蛋白酶具有專一性和選擇性，可以賦予酶解液不同的風(fēng)味[16?18]。以水解度為指標(biāo)，研究不同蛋白酶的酶解效果。使用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶對(duì)魚骨泥進(jìn)行酶解，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1(A)所示，可以看出不同蛋白酶對(duì)魚骨泥水解度的影響差異顯著（P<0.05）。在風(fēng)味蛋白酶作用下，酶解液的水解度最高，為33.83%。有研究表明，風(fēng)味蛋白酶可以賦予酶解液較好的風(fēng)味[19]，而且可以將肽鏈末端的疏水性氨基酸切除，降低苦味[20]，因此選取風(fēng)味蛋白酶為水解用酶。

不同酶解時(shí)間對(duì)魚骨泥水解度的影響如圖1(B)所示。由圖可知，酶解4 h后，水解度增加不明顯，酶解5 h時(shí)水解度達(dá)到最大值，這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)體系中的底物基本被完全酶解，酶解過程基本結(jié)束，故選取4~6 h為最佳酶解時(shí)間段。

不同加酶量對(duì)魚骨泥水解度的影響如圖1(C)所示。由圖可知，加酶量在0.2%~1.0%范圍內(nèi)，水解度隨著酶添加量的增多呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在添加量為0.8%時(shí)水解度最大。這是由于蛋白酶添加量增多時(shí)，酶與底物的觸點(diǎn)增多，酶解效果顯著提高，但當(dāng)酶添加量過多時(shí)，酶與底物作用位點(diǎn)被完全占據(jù)，即此時(shí)的魚骨泥不能滿足更多蛋白酶酶解所需的營(yíng)養(yǎng)成分，因此繼續(xù)增加蛋白酶含量水解度沒有提升，故選取0.6%~1.0%為最佳蛋白酶添加量范圍。

圖1 不同因素對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of different factors on the degree of hydrolysis

不同料液比對(duì)魚骨泥水解度的影響如圖1(D)所示。由圖可知，水解度隨料液比的增加呈下降趨勢(shì)，這可能是由于料液比濃度較低時(shí)，物料粘稠，增大了酶與底物間的碰撞接觸，酶解效率較高，但當(dāng)料液比低于1:1 g/mL時(shí)，物料過于粘稠，影響酶解效率。當(dāng)料液比濃度增大時(shí)，酶與底物不能進(jìn)行有效接觸，水解度下降，同時(shí)由于料液比增大，對(duì)溶液中的可溶性肽有一定的稀釋作用，故水解度下降，因此最佳料液比范圍選取1:1~1:3 g/mL。

2.3 響應(yīng)面分析

以酶解時(shí)間（A）、加酶量（B）、料液比（C）三個(gè)因素為自變量，水解度為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用三因素三水平進(jìn)行酶解工藝條件優(yōu)化，Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 3 Response surface test design results

2.3.1 回歸模型的建立及顯著性、可信性分析 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，建立水解度（R）對(duì)時(shí)間（A）、酶添加量（B）、料液比（C）多元二次回歸模型：

R=3.1488+0.09A?0.093B?0.075C?0.077AB+0.195AC?0.015BC?0.35A2?0.478B2?0.298C2。方差分析結(jié)果如表4所示，回歸模型P值為0.0008，達(dá)到了極顯著水平，失擬項(xiàng)不顯著，表明模型對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合良好，可以用該模型來分析和預(yù)測(cè)酶解魚骨泥的工藝結(jié)果。C、C2的影響極顯著（P<0.01），A2對(duì)結(jié)果的影響顯著（P<0.05），三種因素對(duì)水解度影響的順序?yàn)椋毫弦罕?加酶量>時(shí)間。

表4 響應(yīng)面回歸模型方差分析表Table 4 Variance table of response surface regression model analysis

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析 各因素間的交互作用如圖2所示，由圖可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度呈先上升后下降的趨勢(shì)，隨著料液比的增大，水解度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由響應(yīng)曲面的陡峭程度可以看出，料液比與其它兩因素間的交互較好。等高線圖的形狀可以反映出兩因素交互作用的強(qiáng)弱和顯著程度[21]。料液比與其余兩個(gè)因素交互的曲線比較陡，說明在酶解時(shí)間不是很充分和加酶量較少時(shí)，降低料液比濃度能明顯提高水解度。

圖2 響應(yīng)面交互作用曲線圖Fig.2 The graph of response surface interaction

2.3.3 最佳酶解條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 利用Design-Expert統(tǒng)計(jì)軟件求解回歸方程得到，以水解度為指標(biāo)，酶解魚骨泥的最佳工藝為：時(shí)間5 h，加酶量1.0%，料液比1:1，水解度可達(dá)43.92%，在上述最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，水解度可達(dá)43.8%，接近預(yù)測(cè)值。證明通過響應(yīng)面分析獲得的最佳條件是有效可靠的。

2.4 酶解對(duì)魚骨泥氣味輪廓的影響

將魚骨泥、魚骨泥酶解液揮發(fā)性氣體變化進(jìn)行PCA 分析，其目的是將電子鼻輸出的數(shù)據(jù)降維成兩個(gè)不存在信息交叉的新指標(biāo)，使得原本復(fù)雜并可能存在相互影響的數(shù)據(jù)變得簡(jiǎn)單明了，性質(zhì)相似的樣品在距離上接近[22?23]。根據(jù)圖3(A)可以看出，PC1與PC2的貢獻(xiàn)率分別為84.50%和8.68%，兩者貢獻(xiàn)率之和達(dá)93.18%，說明主成分包含了樣品的主要?dú)馕缎畔?。兩組樣品主成分沒有重疊交互的部分，說明兩組樣品間氣味具有一定差異性。主要表現(xiàn)在酶解后的氣味向PC1正向移動(dòng)，而PC1特征值占比較大，說明魚骨泥經(jīng)酶解后，氣味特征越發(fā)復(fù)雜，和魚骨泥氣味差異較大。

圖3 魚骨泥和酶解液電子鼻響應(yīng)值的PCA(A)和雷達(dá)圖(B)Fig.3 PCA and radar chart of electronic nose response value of fish bone paste and its enzymatic hydrolysates

根據(jù)電子鼻雷達(dá)圖可以看出魚骨泥酶解前后的揮發(fā)性氣體傳感器響應(yīng)值的變化。從圖3(B)中可以看出R2、R5、R6、R7的響應(yīng)值變化較為明顯，R2對(duì)氮氧化合物靈敏、R5對(duì)芳香化合物靈敏、R6對(duì)甲烷靈敏、R7對(duì)無(wú)機(jī)硫化物靈敏。魚腥味主要構(gòu)成物質(zhì)是三甲胺，其反應(yīng)會(huì)生成較多的短鏈烷烴類化合物，酶解后烷烴類化合物含量有所降低?？傮w來說，酶解可以產(chǎn)生更多的芳香物質(zhì)和含硫化合物，同時(shí)使魚骨泥中烷烴類、氨類等具有不愉快氣味化合物的含量降低，表明酶解可以改善魚骨泥的整體風(fēng)味。

2.5 酶解對(duì)魚骨泥滋味輪廓的影響

電子舌可以有效的反映各樣品間的滋味差異，圖4反映出魚骨泥、酶解魚骨泥各滋味響應(yīng)值的強(qiáng)度。從圖中可以看出，魚骨泥酶解前后滋味輪廓具有一定的差異性，酶解液的滋味輪廓較大。主要表現(xiàn)為酸味、苦味和咸味的差異，酶解后苦味響應(yīng)值降低，說明酶解可以對(duì)苦味產(chǎn)生一定的削弱作用。酶解液的酸味響應(yīng)值高于魚骨泥，酸味可以對(duì)苦味產(chǎn)生一定的掩蓋作用。在陶寧萍等[24]的研究中，對(duì)魚皮進(jìn)行脫苦后，酸味亦有上升趨勢(shì)。咸味可以賦予水產(chǎn)品良好的風(fēng)味，魚骨泥經(jīng)酶解后咸味具有上升趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)水解后產(chǎn)生了具有咸味或類似咸味作用的肽。TAMURA等[25]在酪蛋白水解物類似物合成過程中偶然發(fā)現(xiàn)具有咸味的肽，ALEXANDER等[26]研究發(fā)現(xiàn)，魚精蛋白酶解產(chǎn)物經(jīng)分離純化得到的精酰胺二肽具有咸味增強(qiáng)作用。

圖4 魚骨泥和酶解液電子舌響應(yīng)值的雷達(dá)圖Fig.4 Radar chart of electronic tongue response value of fish bone paste and its enzymatic hydrolysates

2.6 酶解對(duì)魚骨泥揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

圖5為不同處理方式下魚骨泥特征風(fēng)味二維和三維GC-IMS譜圖，圖中每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性化合物，數(shù)量信息用顏色表示，白色對(duì)應(yīng)于相對(duì)較低濃度的揮發(fā)物，紅色對(duì)應(yīng)較高濃度的揮發(fā)物。在1.0~1.5 ms漂移范圍內(nèi)，酶解液的信號(hào)響應(yīng)高于魚骨泥，可以看出兩組樣品間具有一定的差異。

圖5 魚骨泥和魚骨泥酶解液的 GC-IMS 三維(A)、二維(B)譜圖Fig.5 GC-IMS 3D (A) and 2D (B) spectra of fish bone paste and its enzymatic hydrolysates

為更加直觀的對(duì)比兩組樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異，將二維圖譜中所有的待分析峰整合成指紋圖譜，如圖6 所示，圖中每一行代表一個(gè)樣品中選取的全部信號(hào)峰，圖中每一列代表同一揮發(fā)性有機(jī)物在不同樣品中的信號(hào)峰，兩組樣品間的揮發(fā)性風(fēng)物物質(zhì)在種類和含量上的差異均十分顯著（表5）。A區(qū)域是魚骨泥中主要呈味物質(zhì)，表現(xiàn)為癸醛、（E,Z）-2,6-壬二烯醛、辛醛、苯甲醛、庚醛、E-2-己烯醛、己醛、E-2-戊烯醛、戊醛、2-壬酮、2-戊酮、2-乙基己醇、二甲基硫醚等物質(zhì)的含量較高；B區(qū)域是酶解液中主要呈味物質(zhì)，表現(xiàn)為2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、壬醛、E-2-辛烯醛、3-辛酮、2-庚酮、環(huán)己酮、異己醇、2-丙醇、3-甲基丁酸乙酯、丁酸戊酯等物質(zhì)的含量較高。

表5 魚骨泥和酶解液揮發(fā)性化合物的定性分析Table 5 Qualitative analysis of volatile compounds in fish bone paste and its enzymatic hydrolysates

圖6 魚骨泥和魚骨泥酶解液的揮發(fā)性物質(zhì)成分差異化譜圖Fig.6 Differential spectrum of volatile components in fish bone paste and its enzymatic hydrolysates

醛類化合物是酶解液和魚骨泥中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之一，醛類物質(zhì)的閾值較低，對(duì)氣味形成的貢獻(xiàn)較大[27]，含有6~9個(gè)碳原子的醛、烯醛類物質(zhì)一般具有清香、果香和脂香味。魚骨泥中的主要呈味物質(zhì)是醛類化合物，如庚醛、辛醛具有青草味、魚腥味和令人不愉快的氣味[28]，苯甲醛有杏仁的味道，可能與氨基酸的降解有關(guān)[29]，（E,Z）-2,6-壬二烯醛是魚腥味的特征化合物。酶解液中壬醛含量較高，具有強(qiáng)烈的油脂氣味和甜橙氣息。醛類物質(zhì)是水產(chǎn)品主要的風(fēng)味物質(zhì)，經(jīng)過酶解作用，可以減少魚骨泥中的不良風(fēng)味。

酮類和醇類物質(zhì)主要來源于脂肪氧化，部分還可與美拉德反應(yīng)和硫胺素降解的化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)，對(duì)香氣形成具有較大貢獻(xiàn)[30]。酮類化合物是酶解液中主要呈味物質(zhì)，其閾值一般高于醛類。魚骨泥中酮類物質(zhì)主要有2-壬酮、2-戊酮、甲基庚烯酮等，具有檸檬草香味和柑橘樣氣息。酶解產(chǎn)生了一些新的酮類物質(zhì)，如3-辛酮、2-庚酮、二氫香芹酮等，具有水果和藥草等香氣。醇類閾值較高，對(duì)氣味影響較小[31]，檢測(cè)出的種類也相對(duì)較少，醇類物質(zhì)一般具有令人愉悅的氣味，2-乙基己醇有甜味和淡淡的花香。不飽和醇類的臨界值較飽和醇低，因此對(duì)于氣味形成貢獻(xiàn)較大，1-辛烯-3-醇具有蘑菇和泥土味等香氣。醇類物質(zhì)具有良好的風(fēng)味，能夠掩蓋不良?xì)馕叮虼丝梢匝谏w一定的腥味。

2.7 酶解對(duì)魚骨泥呈味化合物的影響

游離氨基酸具有甜味、苦味和鮮味等呈味特性，對(duì)食品風(fēng)味的形成具有重要貢獻(xiàn)[32?34]。根據(jù)表6可知，兩組樣品中共檢測(cè)出15種游離氨基酸，其中必需氨基酸7種，半必需氨基酸2種，非必需氨基酸6種，酶解后必需氨基酸占比達(dá)58.73%，較魚骨泥中占比高33.53%。魚骨泥中游離氨基酸總量為18.72 mg/100 g，酶解液中含量為1095.11 mg/100 mL，酶解后游離氨基酸的含量顯著高于魚骨泥，說明酶解液的水解程度較高。

表6 魚骨泥和魚骨泥酶解液游離氨基酸的含量Table 6 Free amino acid content of fish bone paste and its enzymatic hydrolysates

蛋氨酸、組氨酸是苦味氨基酸[35]，蛋氨酸的含量遠(yuǎn)低于閾值30 mg/100 mL，有研究表明當(dāng)苦味氨基酸含量低于閾值時(shí)，對(duì)總體滋味有利[36]，組氨酸僅在酶解液中檢出，其呈味閾值為20 mg/100 mL，酶解液中含量為24.20 mg/100 mL，是酶解液中苦味的主要貢獻(xiàn)氨基酸。天冬氨酸、谷氨酸具有鮮甜味[37]，其閾值分別為100 和30 mg/100 mL，酶解液中谷氨酸含量為27.4 mg/100 mL，對(duì)于鮮味的貢獻(xiàn)高于天冬氨酸。甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸具有甜味，能夠賦予食品總體較好的風(fēng)味[38]，這些具有良好風(fēng)味的氨基酸在酶解后含量均提升數(shù)倍，說明酶解液的風(fēng)味更佳。陳怡穎等[39]分別研究了雞肉酶解液和雞肉中風(fēng)味成分，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞肉酶解液中風(fēng)味成分更豐富，風(fēng)味更佳。

3 結(jié)論

本研究通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了魚骨泥酶解工藝，得到最佳工藝條件為：采用風(fēng)味蛋白酶，酶解時(shí)間5 h，加酶量1.0%，料液比1:1，在此條件下水解度可達(dá)43.8%。酶解前后的魚骨泥氣味和滋味特征有明顯差異。酶解降低了魚骨泥的苦味和腥味，改變了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成。魚骨泥中主要呈味物質(zhì)是醛酮類化合物，酶解液中主要呈味物質(zhì)為酮類、酯類化合物；酶解液中游離氨基酸的含量顯著高于魚骨泥中，賦予了酶解液整體較好的滋味。

本研究建立了魚骨泥的酶解工藝，為魚骨副產(chǎn)物的深加工提供了一定思路。后續(xù)研究可以根據(jù)分子量分布對(duì)酶解液中的肽段進(jìn)行分離純化，深入探究酶解液中呈味物質(zhì)組成及呈味機(jī)制。亦可將魚骨酶解液應(yīng)用到調(diào)味料的研制中，賦予食品水產(chǎn)品特有的風(fēng)味。