董 蕊，逯 影，王 盼

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院, 吉林長(zhǎng)春 130118）

對(duì)乙酰氨基酚（Acetaminophen, APAP）是一種被廣泛使用的解熱鎮(zhèn)痛藥物。近年來(lái)，在我國(guó)對(duì)乙酰氨基酚過(guò)量使用導(dǎo)致的急性肝損傷呈上升趨勢(shì)[1?2]。研究已發(fā)現(xiàn)天然植物中的苷類、黃酮、多酚、生物堿等成分對(duì)急性肝損傷有保護(hù)作用[3?4]。

柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinenseDC.）的干燥根，又稱北柴胡。柴胡性微寒，味苦、辛，歸肝膽經(jīng)，具有保肝、抗炎等作用[5]。柴胡在我國(guó)應(yīng)用廣泛，不僅用于藥用，還可以用于保健，如含有柴胡的藥膳（香蘇柴荊蒸豬肝）、柴胡保健酒等。中醫(yī)認(rèn)為，柴胡有升舉陽(yáng)氣、疏肝解郁的功效。在藥性五味中，醋以酸味為主，酸味入肝，因此柴胡入肝以醋柴胡為主。研究表明，柴胡醋炙后增強(qiáng)了藥效入肝的作用[6?7]，其抗抑郁的效果強(qiáng)于醋炙前[8]，因此增加了醋柴胡在臨床上的應(yīng)用[9?10]。柴胡醋炙后其皂苷含量發(fā)生變化，在醇提液中柴胡皂苷A（Saikosaponin A,SSA）增加，柴胡皂苷 D（Saikosaponin D, SSD）減少。有研究表明SSA對(duì)脂多糖與D-半乳糖誘導(dǎo)的肝損傷有保護(hù)作用[11]，SSD對(duì)人肝細(xì)胞具有保護(hù)作用[12]。而且柴胡成分復(fù)雜，醇溶性浸出物中包含了多種有效成分，常被用作質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)，且柴胡醋炙后浸出物含量會(huì)略有增加[13?14]。

目前，大多數(shù)省市的炮制規(guī)范收錄了醋炙柴胡，但其炮制工藝的描述中，對(duì)醋炙柴胡醋用量、悶潤(rùn)、炒制等多用適量、文火等專業(yè)術(shù)語(yǔ)，對(duì)具體的炮制工藝參數(shù)并不明確，炮制過(guò)程中缺乏可量化的工藝參數(shù)，導(dǎo)致各省市炮制工藝參數(shù)均有差異，不利于飲片規(guī)范性生產(chǎn)[15?16]。并且有些省市對(duì)醋柴胡皂苷含量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有要求，只對(duì)其浸出物含量做出了標(biāo)準(zhǔn)，極大的影響了醋制柴胡的質(zhì)量[17]。以前對(duì)于柴胡的工藝優(yōu)化多數(shù)采用正交試驗(yàn)法[18?20]。正交試驗(yàn)主要側(cè)重試驗(yàn)次數(shù)與如何科學(xué)的安排實(shí)驗(yàn)，并且只能分析離散型數(shù)據(jù)，精度不高，預(yù)測(cè)性不佳。而響應(yīng)面法采用非線性模型，能求得高精度的回歸方程，進(jìn)行合理預(yù)測(cè)來(lái)找出最優(yōu)工藝條件[21]。

熵權(quán)法是一種客觀賦權(quán)法，相對(duì)于主觀賦權(quán)法，精確度高，客觀性強(qiáng)[22]。它通過(guò)樣本數(shù)據(jù)計(jì)算直接得出權(quán)重，不受人為主觀因素的影響，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類藥材、植物品質(zhì)評(píng)價(jià)中[23?24]。因此，本研究將SSA、SSD、浸出物等作為醋炙工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用熵權(quán)法計(jì)算各指標(biāo)的綜合評(píng)分，結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)法確信試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)在非線性影響條件下各因素與指標(biāo)之間的影響[25]，優(yōu)化北柴胡醋炙工藝。建立小鼠APAP誘導(dǎo)下急性肝損傷模型，研究柴胡醋炙后對(duì)藥物性肝損傷的作用變化，為醋柴胡在治療急性肝損傷的應(yīng)用上提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性ICR小鼠 SPF級(jí)，體重20~22 g，來(lái)源于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證：SYXK(吉)2018-0023，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在室內(nèi)溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（55%±5%），的無(wú)菌培養(yǎng)室中飼養(yǎng)，保持正常晝夜交替，給予充分的進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；柴胡 黑龍江齊齊哈爾肇源縣，經(jīng)吉林省鼎盛藥材檢驗(yàn)公司鑒定為北柴胡（Bupleurum chinenseDC.）的干燥根；柴胡皂苷A對(duì)照品 純度93.2%，批號(hào)：110777-201510、柴胡皂苷D對(duì)照品純度95.8%，批號(hào)：110778-201711 中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)乙酰氨基酚（Paracetamol, APAP） 阿拉丁試劑有限公司；N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine, NAC） 翌圣生物科技有限公司；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒

南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒 北京誠(chéng)林生物技術(shù)有限公司；其他試劑 分析純。

HC-2517高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；SPECTRO star Nano全波長(zhǎng)掃描式酶標(biāo)儀 德國(guó)BMG LABTECH公司；UltiMate 3000高效液相色譜儀 美國(guó)熱電公司；CY式滾筒炒藥機(jī) 康華制藥機(jī)械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生柴胡飲片制備 取北柴胡原藥材，除去殘莖及雜質(zhì)、洗凈、潤(rùn)透、切厚片、干燥、即得[26]。

1.2.2 醋炙柴胡炮制工藝 北柴胡飲片，置于槽內(nèi)，加入一定量的米醋，悶潤(rùn)至米醋吸浸，放入炒藥機(jī)內(nèi)炒制一定時(shí)間，取出、放涼。

1.2.3 SSA、SSD含量的測(cè)定

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：Amethyst C18-H（4.6 mm×250 mm，5 μm，120 ?)；流動(dòng)相：乙腈 (B)-水 (A)；洗脫梯度：0~50 min，75%~10% A；50~60 min，10% A；流速：1.0 mL/min；波長(zhǎng)：210 nm；柱溫為室溫，進(jìn)樣量：5 μL。

1.2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取柴胡皂苷A對(duì)照品 7.52 mg、柴胡皂苷D對(duì)照品 9.34 mg，置于20 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，備用。

1.2.3.3 供試品溶液的制備 將醋柴胡飲片粉碎后，過(guò)藥典四號(hào)篩。精密稱定0.5 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，用封口膜封好瓶塞，密塞，30 ℃水溫超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）30 min，濾過(guò)，用甲醇 20 mL分2次洗滌容器及樣品，洗液與濾液合并置蒸發(fā)皿中，水浴鍋加熱，回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（孔徑0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液置液相小瓶，在“1.2.3.1”色譜條件下檢測(cè)SSA、SSD含量。

1.2.4 浸出物含量測(cè)定 取醋柴胡粉末（過(guò)四號(hào)篩），精密稱取 2 g，置于 250 mL錐形瓶中，精密加95%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，保持微沸1 h。放冷后，密塞，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，至干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量[27]，計(jì)算其浸出物含量。

1.2.5 多指標(biāo)綜合評(píng)分法建立 熵權(quán)法是確定指標(biāo)權(quán)重的客觀賦權(quán)法，可用來(lái)確定多指標(biāo)評(píng)價(jià)系統(tǒng)中各指標(biāo)權(quán)重[28]。設(shè)有m個(gè)待評(píng)價(jià)對(duì)象，n個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，原始矩陣為 X= (Xij) m×n，i=1,2,···, m；j=1, 2, ···, n。對(duì)原始矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)歸一化處理，得到矩陣Y=(Yij) m×n。本實(shí)驗(yàn)中m=15，n=3，采用極值法對(duì)原始數(shù)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使矩陣Y中的任一數(shù)值處于[0, 1]之間[29]。

式中：Yij為第i個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象的第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化值；Xij為第i個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象的第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的原始數(shù)值；max Xij和min Xij分別表示第i個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象在第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)上的最大值和最小值。

對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后即可計(jì)算各指標(biāo)的信息熵。

式中：Hj為第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的熵值；Pij為第i個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象在j指標(biāo)下的概率。

式中：Wj為第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的熵權(quán)。

SSA、SSD、浸出物的權(quán)重分別為0.3318、0.3392、0.3290。綜合評(píng)分 M=SSA含量×0.3318＋SSD含量×0.3392＋浸出物含量×0.3290。

1.2.6 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 醋用量對(duì)綜合評(píng)分的影響 稱北柴胡生飲片5份，每份1 kg，分別加入15%、20%、25%、30%、40%的米醋，悶潤(rùn)3 h，于130 ℃炒藥機(jī)炒制15 min。研究醋用量對(duì)綜合評(píng)分的影響。

1.2.6.3 炒制溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響 稱北柴胡生飲片5份，每份1 kg，加入25%的米醋，悶潤(rùn)3 h，分別于 110、120、130、140、150 ℃ 炒藥機(jī)炒制 15 min。研究炒制溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響。

1.2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

1.2.7.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以醋用量、悶潤(rùn)時(shí)間、炒制溫度為考察因素，綜合評(píng)分M為響應(yīng)值，運(yùn)用 Design-Expert 8.0.6 軟件的Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)3因素3水平的試驗(yàn)條件。Box-Behnken響應(yīng)面法因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface testing

1.2.8 柴胡、醋柴胡保肝作用初探

1.2.8.1 藥物配制 稱取柴胡粉末（過(guò)四號(hào)篩）20 g，10倍量70%乙醇，浸泡40 min后，采用加熱回流的方式提取兩次，每次1.5 h，合并兩次濾液，水浴蒸干得干浸膏，配制成含柴胡生藥3 g·mL?1的水溶液。稱取醋柴胡粉末（過(guò)四號(hào)篩）20 g，以同樣的方法制取醋柴胡水溶液，含生藥 3 g·mL?1，備用。

1.2.8.2 APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型建立 取ICR小鼠40只，正常食水適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為5 組，每組 8 只。（1）空白對(duì)照組（C）；（2）模型對(duì)照組（M）；（3）陽(yáng)性對(duì)照組（NAC）；（4）柴胡組（S）；（5）醋柴胡組（VS）。S組每天灌胃柴胡水溶液3 g·kg?1；VS 組每天灌胃醋柴胡水溶液 3 g·kg?1；C組、M組灌胃同體積的生理鹽水；NAC組灌胃150 mg·kg?1N-乙酰半胱氨酸水溶液；連續(xù)灌胃 7 d，末次給藥1 h后給予M組、NAC組、S組、VS組小鼠一次性 APAP 腹腔注射（250 mg·kg?1）。C 組給予腹腔注射同體積的生理鹽水，24 h后，進(jìn)行眼球采血和解剖，造模和解剖前分別保證小鼠禁食不禁水12 h 以上[30]。

1.2.8.3 柴胡、醋柴胡對(duì)小鼠血清中ALT、AST水平的影響 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。

葡萄酒就像女人。女人可以帶給男人刺激、放松和撫慰。每一個(gè)成熟的女人都藏著無(wú)數(shù)個(gè)少女死去的生命。逝去的少女為葡萄酒般的女人而存在。葡萄酒般的女人為男人而存在。幾乎所有的一切：相貌、穿著、情緒、情感……甚至，每一個(gè)器官。女人沒(méi)有自我。世界充斥著各種各樣的謊言，男女平等就是最滑稽、最動(dòng)聽(tīng)、最虛偽并且最惡毒的謊言。

1.2.8.4 柴胡、醋柴胡對(duì)小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒中的說(shuō)明書檢測(cè)并計(jì)算小鼠血清中白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1，β型（Interleukin-1β）的炎癥因子水平。

1.2.8.5 柴胡、醋柴胡對(duì)小鼠肝組織中GSH、GSHPx和SOD活性及MDA含量的影響 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肝臟組織中的丙二醛（MDA）含量、還原型谷胱甘肽（GSH）水平、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）酶活力等。

1.2.8.6 H&E染色 取肝臟組織右葉石蠟包埋切片，進(jìn)行蘇木-伊紅染色，觀察其病理情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)變化顯著性分析。使用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制圖表，使用Design Expert 10進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSA、SSD含量測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 SSA、SSD 的色譜圖如圖1。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作線性回歸方程，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，SSA：y=8170532x?82372（r=0.9997）。線性范圍：0.376~7.52 μg；SSD：y=10338950x?170696（r=0.9968）。線性范圍：0.467~9.34 μg。

圖1 混合對(duì)照品（A）、醋柴胡樣品（B）和柴胡樣品（C）的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed reference（A）, vinegar Chai Hu sample（B）and Chai Hu sample（C）

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 醋用量對(duì)綜合評(píng)分的影響 當(dāng)醋量低于20%時(shí)，其綜合評(píng)分較低，可能柴胡飲片無(wú)法吸收到陳醋，內(nèi)部成分不能轉(zhuǎn)化完全；當(dāng)醋用量為25%時(shí)，綜合評(píng)分最高；超過(guò)30%時(shí)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，還有剩余陳醋未吸盡；因此選擇25%作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖2A。

2.2.2 悶潤(rùn)時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響 悶潤(rùn)時(shí)間2 h時(shí)，醋被吸盡，但評(píng)分較低；悶潤(rùn)時(shí)間為3 h時(shí)，醋已吸盡，綜合評(píng)分最高；在4 h和5 h時(shí)，評(píng)分未有顯著變化（P>0.05），故選擇3 h為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖2B。

圖2 醋用量、悶潤(rùn)時(shí)間、炒制溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響Fig.2 Effect of vinegar dosage, smothering and wetting time and frying temperature on the overall score

2.2.3 炒制溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響 120 ℃時(shí)，部分水分超過(guò)2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定的10%，因此舍棄120 ℃；130 ℃時(shí)，水分測(cè)定合格，符合藥典規(guī)定，但綜合評(píng)分較低；140 ℃時(shí)，水分合格，飲片顏色淡棕黃色，片型較好，有醋香氣，符合藥典規(guī)定，且綜合評(píng)分最高；150 ℃時(shí)，飲片顏色接近深黃棕色，有焦香氣，綜合評(píng)分降低。因此選擇140 ℃為中心點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖2C。

2.3 響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面模型與方差分析 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)表2進(jìn)行回歸分析，得擬合方程：M=5.43?0.026A?0.09892B+0.016C+0.048AB+0.011AC?0.01024BC?0.048A2?0.57B2?0.011C2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken trial design and results

對(duì)模型進(jìn)行方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，模型極顯著P<0.01，失擬項(xiàng)不顯著P>0.05。說(shuō)明模型擬合度好，試驗(yàn)與實(shí)際情況較貼合。模型中的A、C極顯著P<0.01，單項(xiàng)B顯著P<0.05；交互項(xiàng) AB極顯著P<0.01；A2、B2極顯著P<0.01。由F值可知三個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響為醋用量>炒制溫度>悶潤(rùn)時(shí)間。

表3 回歸模型方差結(jié)果Table 3 Regression model variance results

2.3.2 響應(yīng)面曲面分析 各因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分的影響見(jiàn)圖3。響應(yīng)面坡度越大表明該因素對(duì)響應(yīng)值影響越大，從圖3可知各因素對(duì)綜合評(píng)分影響排序?yàn)榇子昧?炒制溫度>悶潤(rùn)時(shí)間。從圖3A等高線可知悶潤(rùn)時(shí)間與醋用量的交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響較大；從圖3B中可知，炒制溫度與醋用量的交互作用較弱；從圖3C可知，悶潤(rùn)時(shí)間與炒制溫度交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響較弱。應(yīng)用軟件預(yù)測(cè)最佳炮制工藝為：醋用量22.93%，悶潤(rùn)時(shí)間2.79 h，炒制溫度145.0 ℃，綜合評(píng)分為7.285。

圖3 醋用量、悶潤(rùn)時(shí)間、炒制溫度兩兩交互作用的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface diagram of the interaction between vinegar dosage, smothering and wetting time and frying temperature

2.4 工藝驗(yàn)證

為便于實(shí)際生產(chǎn)，將工藝參數(shù)調(diào)整為醋用量23%，悶潤(rùn)時(shí)間2.8 h，炒制溫度145 ℃。使用此條件平行3次，各指標(biāo)含量的平均值分別為SSA 0.65%，SSD 0.74%，浸出物20.67%，綜合評(píng)分為7.128（RSD<1%），與預(yù)測(cè)值的7.285偏差為2.155%。說(shuō)明工藝穩(wěn)定性好，可重復(fù)性高。

2.5 柴胡、醋柴胡保肝作用初探

2.5.1 柴胡、醋柴胡對(duì)APAP誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠ALT、AST的影響 結(jié)果如圖4。ALT和AST是檢測(cè)肝損傷的兩種標(biāo)示性轉(zhuǎn)氨酶[31]。肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，大量的ALT、AST酶類物質(zhì)釋放到血液中，不同的ALT、AST水平可以表示肝損傷程度[32]。與C組相比，M組的ALT、AST水平顯著上升（P<0.05），由此可知，APAP誘導(dǎo)的肝損傷模型建立成功；VS組、S組、NAC組相較于M組，血清中的ALT、AST都顯著下調(diào)（P<0.05）；其中VS組與S組相比，VS組的各指標(biāo)下調(diào)更為明顯。

圖4 柴胡、醋柴胡對(duì)APAP誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠AST、ALT的影響(n=8)Fig.4 Effect of Chai Hu and vinegar Chai Hu on AST and ALT in APAP-induced acute liver injury mice (n=8)

2.5.2 柴胡、醋柴胡對(duì)小鼠血清中炎癥因子水平的影響 結(jié)果如圖5。IL-6、IL-1β、TNF-α是重要的細(xì)胞炎癥因子，當(dāng)其水平大幅度上升代表機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[33]。TNF-α是肝臟中的重要的促炎因子；IL-6是參與機(jī)體免疫應(yīng)答的炎癥因子；IL-1β也可預(yù)示著炎癥的發(fā)生，因此三種炎癥因子的水平可以表達(dá)APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷的受損程度[34]。APAP導(dǎo)致IL-6、IL-1β、TNF-α在M組小鼠血清中具有最高表達(dá)量（P<0.05）。VS組、S組與M組相比，IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)量顯著降低（P<0.05），但略高于NAC組。因此可以看出，柴胡、醋柴胡可以抑制血清中的炎性因子 TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)，并且醋柴胡的作用更為顯著（P<0.05）。由此可知，醋柴胡、柴胡可以通過(guò)調(diào)控APAP引起的炎癥反應(yīng)，改善肝損傷。

圖5 各組小鼠血清 IL-1β、IL-6、TNF-α 炎癥因子水平（n=8）Fig.5 IL-1β, IL-6 and TNF-α serum cytokine levels of mice in different groups (n=8)

2.5.3 柴胡、醋柴胡對(duì)小鼠肝組織中GSH、GSHPx和SOD活性及MDA含量的影響 結(jié)果如圖6。在APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中，氧化應(yīng)激也是發(fā)生機(jī)制之一，大量的氧自由基量生成和氧化應(yīng)激次數(shù)的增多會(huì)加重肝損傷過(guò)程[35]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物之一，它的水平多少可以直接表達(dá)脂質(zhì)過(guò)氧化程度。SOD含量的高低反映了機(jī)體抗氧化能力；GSH在APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷的過(guò)程中對(duì)NAQPI有著解毒的作用，而GSH-Px則可以較好的反映抗氧化能力[36]。與C組相比，M組的MDA顯著高于 C 組（P<0.05），SOD、GSH、GSH-Px顯著低于C組（P<0.05）。與M組比較，NAC組和VS組各項(xiàng)指標(biāo)均具有顯著性差異（P<0.05）。S組對(duì)GSH和GSH-Px改善不明顯。

圖6 柴胡、醋柴胡對(duì)小鼠肝組織中SOD、GSH-Px、GSH、MDA的影響(n=8)Fig.6 Effect of Chai Hu and vinegar Chai Hu on SOD, GSH-Px, GSH and MDA in mouse liver tissues (n=8)

2.5.4 H&E染色結(jié)果 小鼠肝組織病理圖像如圖7。C組具有完整的肝小葉結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞排列緊密。M組結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，細(xì)胞腫脹，有炎癥因子浸潤(rùn)和細(xì)胞出血的情況。NAC組肝細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常，組織結(jié)構(gòu)較完整。S組肝臟的肝小葉出現(xiàn)部分損傷，有一定面積肝壞死。VS組肝臟有小面積損傷，肝細(xì)胞邊緣較清晰，極大程度地緩解了APAP導(dǎo)致的肝損傷。

圖7 APAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠的肝組織病理圖像（400×）Fig.7 Histological images of the liver tissue of mice with APAP induced liver injury（400×）

3 結(jié)論

柴胡在醋制過(guò)程中經(jīng)過(guò)加熱、與米醋中成分反應(yīng)后活性發(fā)生變化，并且米醋的醋用量對(duì)柴胡肝保護(hù)有一定作用 。SSA、SSD均有一定的保肝作用，有學(xué)者從柴胡醋制生物學(xué)效應(yīng)方面發(fā)現(xiàn)，柴胡醋制后與生柴胡有顯著差異[36]。

本實(shí)驗(yàn)采用熵權(quán)法結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)的方式，優(yōu)化醋炙柴胡的炮制工藝，得到醋炙柴胡優(yōu)化的炮制工藝：醋用量23%，悶潤(rùn)時(shí)間2.8 h，炒制溫度145 ℃，其指標(biāo)含量分別為SSA 0.65%，SSD 0.74%，浸出物20.67%，綜合評(píng)分為7.128。并且通過(guò)工藝驗(yàn)證得出此工藝穩(wěn)定、可靠，可以為細(xì)化醋柴胡飲片標(biāo)準(zhǔn)提供一些參考。

研究結(jié)果表明，醋柴胡對(duì)APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有改善作用。醋柴胡可有效降低肝損傷小鼠血清中的AST、ALT活力水平，下調(diào)血清中的IL-6、IL-1β、TNF-α炎癥因子水平，使肝組織中的SOD、GSH、GSH-Px活性顯著上升（P<0.05），MDA含量顯著下降（P<0.05）。而柴胡飲片對(duì)于GSH和GSHPx水平作用不顯著（P>0.05）。由以上可知，醋柴胡對(duì)APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有治療作用，可能與SSA含量或浸出物中的其他組分增加有關(guān)，其機(jī)制可能是通過(guò)降酶保肝、抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥因子的釋放等途徑抑制急性肝損傷。柴胡醋炙后的其他組分對(duì)急性肝損傷的作用有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究對(duì)比了柴胡醋炙前后對(duì)APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷治療作用，為柴胡、醋柴胡治療APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷補(bǔ)充了理論依據(jù)，進(jìn)一步擴(kuò)大柴胡、醋柴胡的應(yīng)用。