柴美靈，李 娜，喬宏萍，劉 地，張曉紅，曹貴東，武曉英,

（1.太原師范學(xué)院生物系，山西晉中 030619；2.山西瑞象生物藥業(yè)有限公司，山西太原 030000）

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch），別名甜草根，豆科甘草屬，味甘而藥性平和，被稱為“國(guó)老”（眾藥之王），為藥食同源的中藥材，常被中醫(yī)處方入藥，同時(shí)也作為食品、保健品、化妝品等原料在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[1]。甘草中主要含有三萜類、黃酮類、多糖類、香豆素類、揮發(fā)油類以及氨基酸等成分[2]，其提取物在抗炎、解毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等方面具有一定的藥理作用，也在保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等方面具有重要的研究意義[3]。甘草多糖是從甘草中提取出來(lái)的活性多糖，易溶于水，具有多種不同的功效，如調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、防治骨關(guān)節(jié)炎等作用[4]。陳橙等[5]分離純化脹果甘草多糖，測(cè)定得到的3種酸性雜多糖均是由阿拉伯糖（Ara）、鼠李糖（Rha）、半乳糖（Gal）、半乳糖醛酸（GalA）以不同摩爾比組成；薛薇[6]將甘草多糖（GPS）降解衍生化后，通過(guò)氣質(zhì)色譜分析出GPS由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖三種單糖組成。

現(xiàn)有多糖提取技術(shù)有溶劑提取法、超聲輔助提取法、滲流-大孔樹脂循環(huán)耦合提取法、微波輔助提取、酶提法和超臨界二氧化碳（CO2）萃取技術(shù)等[7]。目前超聲提取技術(shù)在實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用，其原理是利用超聲波具有的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)及熱效應(yīng)，加速溶劑流動(dòng)、滲透、溶解、擴(kuò)散等，達(dá)到提取分離的目的，提取過(guò)程實(shí)際是對(duì)植物細(xì)胞破碎而加速植物成分的提取[8]，具有提取充分且效率高、提取處理量大且耗時(shí)短、提取溫度低且能耗小、提取成本低且效益高、提取物易于分離和純化和提取適應(yīng)性廣泛等優(yōu)點(diǎn)[9]。

響應(yīng)面試驗(yàn)法（RSM）是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題，有助于快速建模、縮短優(yōu)化時(shí)間和提高工程應(yīng)用[10]。張光輝等[11]在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化甘草多糖提取工藝，表明甘草多糖的最佳提取工藝條件為提取溫度60.57 ℃、提取時(shí)間1.84 h、料液比1:30.92 g/mL，此條件下甘肅、內(nèi)蒙古、新疆甘草多糖得率分別為（19.89%±0.08%）、（11.25%±0.10%）、（9.60%±0.13%），當(dāng)甘草多糖濃度為0.50 mg·mL?1時(shí)，甘肅、內(nèi)蒙古、新疆甘草多糖對(duì)DPPH自由基的清除率分別為 27.17%、31.69%、58.68%。李德龍等[12]在響應(yīng)面優(yōu)化藥桑椹多糖超聲提取工藝研究中，表明多糖得率在提取3次時(shí)最高，分析可能是因?yàn)樘崛〈螖?shù)過(guò)多時(shí)多糖中的雜質(zhì)過(guò)多溶出導(dǎo)致得率下降，由此證明提取次數(shù)也是影響多糖提取工藝的因素之一，為接下來(lái)的研究提供有價(jià)值的參考。

本實(shí)驗(yàn)主要采用超聲輔助水提取法，提取3次并分別測(cè)定每次提取的多糖含量，考察提取過(guò)程中的多糖變化趨勢(shì)，再利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得粉碎粒徑、液料比、超聲溫度、超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響水平，得出最佳工藝參數(shù)；并采用DPPH與ABTS法在體外對(duì)其清除自由基的活性[13]進(jìn)行初步研究，以期為甘草多糖的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘草藥材 山西瑞象生物藥業(yè)有限公司（產(chǎn)地：甘肅寧夏）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、2, 2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS） 北京索萊寶科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙醇（批號(hào)：20200922）、苯酚（批號(hào)：20180328） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸（批號(hào)：20100901） 四川西隴科學(xué)有限公司；以上試劑均為分析純（AR）。

BSA223S-CW型賽多利斯精密天平 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；UF-123823H型超聲波清洗機(jī) 深圳市歌能超聲波重子聲學(xué)科技有限公司；SL-200型高速多功能粉碎機(jī) 浙江省永康市松青五金廠；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；V-1100型可見分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司；RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-III型循環(huán)水式多用真空泵 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 取一定量的甘草根切片，經(jīng)烘箱干燥后取出，由高速多功能粉碎機(jī)粉碎一定時(shí)間后，將其用不同孔徑大小的篩子篩出，分別用密封袋包裝儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 甘草多糖的提取 精密稱取干燥至恒重的不同粉碎粒徑的甘草粉末各1.0 g于50 mL離心管內(nèi)，按一定的液料比和超聲功率，在一定的溫度下反應(yīng)一定的時(shí)間，待冷卻至室溫后離心，得甘草多糖提取液。

1.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用苯酚-硫酸法[14]測(cè)定糖含量。精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品4 mg于小燒杯溶解后轉(zhuǎn)到容量瓶中定容至25 mL，搖勻得0.16 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取不同體積葡萄糖對(duì)照品溶液于潔凈的試管中，蒸餾水補(bǔ)足至0.2 mL，依次加入0.4 mL 5%苯酚和2.0 mL濃硫酸，搖勻后靜置反應(yīng)30 min，以蒸餾水加入0.4 mL 5%苯酚和2.0 mL濃硫酸作為空白對(duì)照，于490 nm處測(cè)吸光值。以葡萄糖質(zhì)量濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 單因素實(shí)驗(yàn)分別考察粉粹粒徑（75、150、180、250、880 μm）、液料比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g）、超聲溫度（35、45、55、65、75 ℃）、超聲時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、超聲功率（200、400、600、800、1000 W）對(duì)甘草多糖得率的影響，各因素固定值分別為180 μm、20:1 mL/g、55 ℃、30 min、600 W。以上實(shí)驗(yàn)分別提取3次，標(biāo)記為1提、2提、3提，將3次提取液合并得合并液。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design Expert 10.Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以影響顯著的粉碎粒徑（A）、液料比（B）、超聲溫度（C）和超聲時(shí)間（D）為影響因素，以多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平的29組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化甘草多糖提取工藝，其因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Experimental factors and level of response surface design

1.2.6 甘草多糖得率計(jì)算 精密稱取甘草粉末1.0 g進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，超聲提取后過(guò)濾提取液、離心取上清液備用。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，來(lái)計(jì)算甘草多糖的多糖得率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，按照以下式（1）計(jì)算多糖得率[16]：

式中：c表示根據(jù)吸光度值計(jì)算出的多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；v表示提取液體積，mL；n表示提取液稀釋倍數(shù)；m表示稱取的甘草粉末質(zhì)量，g。

1.2.7 甘草多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定精確配制一定質(zhì)量濃度梯度的甘草多糖溶液，分別取每個(gè)濃度的多糖樣品溶液0.3 mL于刻度試管中，在避光條件下依次在試管中加入2.7 mL 60 μmol/L的DPPH乙醇溶液，室溫條件下避光反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇溶液為空白對(duì)照，以BHT為陽(yáng)性對(duì)照[17]，于517 nm處測(cè)定溶液的吸光度值。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)式（2）計(jì)算多糖樣品對(duì)DPPH自由基的清除率，并計(jì)算半數(shù)抑制率IC50值[18]。

式中：A0表示0.3 mL蒸餾水+2.7 mL DPPH溶液的吸光度值；As表示0.3 mL樣品溶液+2.7 mL DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度值；Ar表示0.3 mL樣品溶液+2.7 mL無(wú)水乙醇溶液的吸光度值。

1.2.8 甘草多糖對(duì)ABTS自由基清除能力的測(cè)定精確配制7 mmol/L ABTS溶液與2.5 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液，室溫下將兩者等體積混合，避光處反應(yīng)12~16 h，獲得所需ABTS工作液備用，使用前以80%的乙醇稀釋，使其 734 nm處OD值為（0.7±0.02）。準(zhǔn)確配制不同濃度的樣品溶液，分別取每個(gè)濃度的多糖樣品溶液0.3 mL于刻度試管中，在避光條件下依次在試管中加入2.7 mL ABTS溶液，室溫條件下避光反應(yīng)30 min，于734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，無(wú)水乙醇調(diào)零，以BHT[16]為陽(yáng)性對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按式（3）計(jì)算甘草多糖對(duì)ABTS自由基的清除率，并計(jì)算半數(shù)抑制率IC50值[19]。

式中：A0表示0.3 mL蒸餾水+2.7 mL ABTS工作液的吸光度值；As表示0.3 mL樣品溶液+2.7 mL ABTS工作液反應(yīng)后的吸光度值；Ar表示0.3 mL樣品溶液+2.7 mL無(wú)水乙醇溶液的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)和抗氧化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 9.1進(jìn)行整理和繪圖；響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Design-Expert 10軟件中的Box-Behnken法進(jìn)行回歸模型方程的建立及方差分析，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

本實(shí)驗(yàn)建立的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：y=8.3949x?0.0115，R2=0.9970，葡萄糖在 0~0.16 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)可根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算甘草多糖中的多糖含量。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 粉碎粒徑對(duì)甘草多糖得率的影響 粉碎粒徑對(duì)甘草多糖得率的影響如圖1A所示，在3次提取過(guò)程中，多糖得率隨著粉碎粒徑的增大而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)粉碎粒徑為150 μm時(shí)，多糖得率最大?？赡苁且?yàn)榉鬯榱竭^(guò)小時(shí)，物料過(guò)細(xì)，使甘草粉末易結(jié)塊，從而增加傳質(zhì)阻力使傳質(zhì)速率降低，不利于甘草多糖分子的溶出[20]，當(dāng)粉碎粒徑繼續(xù)增大時(shí)，多糖得率降低，分析原因可能是粉碎粒徑過(guò)大，溶劑不能有效浸潤(rùn)樣品，無(wú)法完全提取，因而得率降低[21]。因此選擇粉碎粒徑為150 μm。

2.2.2 液料比對(duì)甘草多糖得率的影響 如圖1B所示，在液料比10~30 mL/g范圍內(nèi)，1提與合并液的甘草多糖得率呈現(xiàn)先增大后減少后增大的趨勢(shì)；2提與3提的甘草多糖得率均呈現(xiàn)先增大后逐漸減小的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榈谝淮翁崛r(shí)溶質(zhì)沒有完全浸透在溶液中，當(dāng)溶液體積過(guò)小時(shí)，多糖在水中溶解不完全而且黏度過(guò)大；水體積超過(guò)20倍時(shí)，多糖在大量溶劑中的傳遞效果和傳熱效果受到影響[22]，此外，過(guò)高的液料比也可能會(huì)導(dǎo)致其他雜質(zhì)的溶出從而抑制多糖的溶出[23]，當(dāng)液料比達(dá)到20 mL/g時(shí)，提取劑已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，再增大液料比多糖得率反而會(huì)下降，因此選擇液料比20:1 mL/g為宜。

圖1 粉碎粒徑、液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度和超聲功率對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effects of particle size, liquid-material ratio, ultrasonic time, ultrasonic temperature and ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

2.2.3 超聲溫度對(duì)甘草多糖得率的影響 如圖1C所示，隨著超聲溫度增加，1提與合并液的多糖得率呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，且55 ℃時(shí)甘草多糖得率最高；2提與3提的甘草多糖得率均呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)。這可能是由于：第一次提取時(shí)，隨著溫度的升高使分子運(yùn)動(dòng)加速了提取溶劑的滲入和細(xì)胞內(nèi)多糖的釋放，大部分多糖已經(jīng)釋放到溶質(zhì)中，但溫度過(guò)高會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)[24]，尤其對(duì)高溫較敏感的多糖；當(dāng)進(jìn)行2次和3次提取時(shí)，大部分對(duì)高溫較敏感的多糖已經(jīng)遭到破壞，胞內(nèi)較少量的多糖可能對(duì)高溫不敏感，從而隨溫度的增大而逐漸釋放。因此，選擇溫度55 ℃為宜。

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)甘草多糖得率的影響 如圖1D所示，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，1提與合并液的多糖得率呈現(xiàn)先增大后減少后增大的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間30 min時(shí)達(dá)到最大；2提與3提的甘草多糖得率均呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)。其原因可能是在第一次提取的過(guò)程中，甘草物料所含多糖在短時(shí)間內(nèi)不能完全溶解釋放，但隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，較多的多糖逐漸溶解并釋放到溶質(zhì)中，使得得率提高，當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加，持續(xù)的高溫與超聲作用可能在一定程度上破壞多糖分子的結(jié)構(gòu)，使多糖降解為單糖[25]。因此，選擇最佳提取時(shí)間為30 min。

2.2.5 超聲功率對(duì)甘草多糖得率的影響 如圖1E所示，隨著超聲功率的增加，1提的甘草多糖得率逐漸增大，2提、3提以及合并液的多糖得率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，可能是由于在第一次提取過(guò)程中，甘草細(xì)胞壁首次遭到超聲波的破壞，隨著功率的增大，越來(lái)越多的細(xì)胞遭到破壞，多糖分子被逐漸釋放到溶質(zhì)中，而在2提和3提的過(guò)程中，大多數(shù)甘草細(xì)胞壁已經(jīng)在超聲的過(guò)程中被破碎，隨著超聲功率的增大，超聲波直接作用于多糖分子，大分子多糖在超聲波的強(qiáng)剪切作用下發(fā)生斷裂，導(dǎo)致多糖得率降低[26]，因此選擇超聲功率600 W為宜。

通過(guò)以上單因素實(shí)驗(yàn)分析且綜合考慮多糖得率及實(shí)驗(yàn)成本等因素，最終確定甘草多糖提取的最佳基本條件為：粉碎粒徑150 μm、液料比20:1 mL/g、超聲溫度55 ℃、超聲時(shí)間30 min和超聲功率600 W。在以上5個(gè)單因素中，除超聲功率外，其余4個(gè)因素對(duì)甘草多糖得率的影響范圍均大于1%，因此，將粉碎粒徑、液料比、超聲溫度和超聲時(shí)間作為Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化參數(shù)。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝結(jié)果與分析

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)甘草多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，選擇超聲波功率600 W作為響應(yīng)面優(yōu)化恒定條件，對(duì)粉碎粒徑、液料比、溫度、時(shí)間4個(gè)影響顯著的因素進(jìn)一步優(yōu)化，以多糖得率為評(píng)定指標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示。

采用Design-Expert 10軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸擬合，得到甘草多糖得率響應(yīng)值（Y）和各因子（A、B、C、D）之間的二次回歸模型為：

表2 甘草多糖提取得率的Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results of the extraction rate of Glycyrrhiza polysaccharides

Y=8.98?0.75A?0.10B+1.67C+0.055D+0.080AB?0.80AC+0.045AD+0.041BC?0.17BD+（ 2.500E-010）CD-1.00A2?0.47B2?0.64C2?1.31D2。對(duì)該方程的回歸分析和方差分析如表3所示。

由表3可知，二次多項(xiàng)式擬合模型極顯著（P<0.0001），F(xiàn)值為 9.85，表明此模型極為顯著，即各因素與其響應(yīng)值之間有著極為顯著的相關(guān)性。其失擬項(xiàng)P=0.0955>0.05并不顯著，表明在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，該模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合性較好；擬合系數(shù)R2值為0.9078，可以認(rèn)為模型解釋了90.78%響應(yīng)值的變化。由此說(shuō)明，該模型可對(duì)甘草多糖得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

如表3所示，由F值可知單因素對(duì)甘草多糖得率的影響順序依次為：C（超聲溫度）>A（粉碎粒徑）>B（液料比）>D（超聲時(shí)間），一次項(xiàng)A和C差異極顯著（P<0.01），一次項(xiàng) B 和 D 不顯著（P>0.05）；交互項(xiàng) AC顯著（P<0.05），AB、AD、BC、BD和 CD不顯著（P>0.05）；二次項(xiàng) A2和 D2極顯著（P<0.01），C2顯著（P<0.05）。這表明粉碎粒徑和超聲溫度這兩個(gè)因素對(duì)甘草多糖得率具有顯著的影響，其交互作用也對(duì)多糖得率具有顯著的影響。

表3 響應(yīng)面方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.3.2 模型準(zhǔn)確性分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的殘差和響應(yīng)設(shè)計(jì)如圖2所示。圖2A顯示了不同水平甘草多糖響應(yīng)值的殘差正態(tài)分布概率圖，由圖可知，29組響應(yīng)值較為合理地分布于一條直線兩側(cè)，且其方差無(wú)偏差顯示。本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值非常接近（圖2B），表明本實(shí)驗(yàn)所建立的模型成功地加強(qiáng)了四個(gè)變量參數(shù)與響應(yīng)之間的聯(lián)系。通過(guò)建模擬合，對(duì)內(nèi)部學(xué)生化殘差與29組實(shí)驗(yàn)運(yùn)行數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（圖2C），結(jié)果顯示，所有數(shù)據(jù)點(diǎn)都位于極值之間，所有杠桿點(diǎn)的值都小于1，處于樣本空間中心，表明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袥]有有效誤差存在（圖2D）。相反，由dfbeta值差異圖（圖2E）可知，29組運(yùn)行數(shù)據(jù)對(duì)其回歸系數(shù)都沒有顯著影響；Cook’D用來(lái)發(fā)現(xiàn)對(duì)統(tǒng)計(jì)量影響較大的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)元素，圖2F顯示，Cook’D的值在確定的范圍內(nèi)，說(shuō)明29組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中沒有影響模型的觀察值。通過(guò)以上回歸診斷分析，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的甘草多糖提取工藝模型準(zhǔn)確性較高，可以用于甘草多糖的提取制備。

圖2 Box-Behnken 模型準(zhǔn)確性診斷圖Fig.2 Diagnostic plots for the Box-Behnken model accuracy

2.3.3 交互作用分析 三維響應(yīng)面圖和等高線圖是Box-Behnken響應(yīng)面法建立的多元非線性模型和回歸方程的直觀表示[27]，其等高線形狀的橢圓化程度與兩因素交互作用的顯著程度呈正相關(guān)，橢圓化程度越大，說(shuō)明交互作用越顯著[28]。

由圖3可知，等高線近似橢圓，曲面圖陡峭，說(shuō)明二者的交互作用顯著，結(jié)合表3中的方差分析顯示，粉碎粒徑與超聲溫度對(duì)多糖得率的交互作用與數(shù)據(jù)擬合較好，且隨著超聲溫度的增加，多糖得率逐漸增大，而多糖得率隨著粉碎粒徑的增大則表現(xiàn)為先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)粉碎粒徑為126.57 μm時(shí)，多糖得率最高。

圖3 粉碎粒徑與超聲溫度交互作用對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of particle size and ultrasonic temperature on extraction rate of polysaccharides

2.3.4 最佳提取工藝參數(shù)優(yōu)化及驗(yàn)證 采用Design-Expert 10軟件預(yù)測(cè)超聲輔助提取甘草多糖的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果顯示甘草多糖提取的最佳工藝參數(shù)為粉碎粒徑 126.57 μm，液料比 19.3175 mL/g，超聲溫度65 ℃，超聲時(shí)間30.1732 min，此條件下，甘草多糖的得率最高，預(yù)測(cè)值為10.6237%。為方便實(shí)驗(yàn)，在粉碎粒徑 127 μm，液料比 19.32 mL/g，超聲溫度65 ℃，超聲時(shí)間30.2 min的條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。上述實(shí)驗(yàn)條件下得到的甘草多糖的得率為（10.867%±0.53%），與理論預(yù)測(cè)值比較接近（RSD=0.179%），說(shuō)明用該模型可以較好地反映甘草多糖提取的條件。

2.4 甘草多糖的抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 甘草多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定如圖4A所示，隨著甘草多糖質(zhì)量濃度增大，其對(duì)DPPH自由基清除率也隨之升高，當(dāng)濃度達(dá)到6 mg/L時(shí)曲線趨于平緩，表明在一定濃度范圍內(nèi)，甘草多糖對(duì)DPPH自由基清除能力與其濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系，其最大清除率為91.00%，半數(shù)抑制率IC50值為2.80 mg/mL。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，BHT對(duì)DPPH自由基具有清除能力，且其清除率隨著BHT濃度的增大而呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，BHT對(duì)DPPH自由基清除能力的 IC50值為 4.10 μg/mL，其最大清除率高達(dá)95.89%。通過(guò)對(duì)比甘草多糖和BHT對(duì)DPPH自由基的清除作用可知，甘草多糖對(duì)DPPH自由基的清除效果顯著弱于化學(xué)合成的抗氧化劑BHT。

圖4 甘草多糖對(duì)DPPH自由基（A）和ABTS自由基（B）的清除率Fig.4 Clearance of DPPH radical（A）and ABTS radical（B） by crude polysaccharides from Glycyrrhiza

2.4.2 甘草多糖對(duì)ABTS自由基清除能力的測(cè)定如圖4B所示，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著甘草多糖和BHT濃度的增加，二者對(duì)ABTS自由基清除能力均呈現(xiàn)對(duì)數(shù)增加趨勢(shì)，二者對(duì)ABTS自由基清除能力的 IC50值分別為 1.96 mg/mL和 1.36 μg/mL，最大清除率分別為85.59%（甘草多糖濃度為6 mg/mL）和99.65%（BHT濃度為8 μg/mL）。由此可見，實(shí)驗(yàn)所制備的甘草多糖對(duì)ABTS自由基具有清除作用，且其清除能力與甘草多糖濃度呈量效關(guān)系，但實(shí)驗(yàn)所制備的甘草多糖對(duì)ABTS自由基清除能力顯著低于BHT，二者對(duì)ABTS自由基清除能力存在數(shù)量級(jí)差異。

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助提取技術(shù)，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化甘草多糖提取工藝，利用軟件建立回歸模型預(yù)測(cè)甘草多糖的最佳提取工藝條件，實(shí)驗(yàn)條件下得到的甘草多糖的得率為（10.867%±0.53%）。通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)制備的甘草多糖對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基均有清除作用，且清除能力的強(qiáng)弱與多糖樣品濃度存在量效關(guān)系，當(dāng)甘草多糖提取物濃度為14 mg/mL和6 mg/mL時(shí)，分別對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基清除效果最好，清除率分別為 91.00%、85.59%，其 IC50值分別 2.80 mg/mL和1.96 mg/mL，表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性。其創(chuàng)新之處在于分別測(cè)定三次提取液及合并液的多糖得率，優(yōu)化出最佳提取工藝，使甘草提取物充分釋放，有效避免了資源的浪費(fèi)。

近年來(lái)，隨著對(duì)中草藥藥效作用要求的提高，對(duì)中藥提取工藝的技術(shù)研究也越來(lái)越受重視，然而在提取工藝上還存在一些問(wèn)題，例如提取甘草以多糖得率為指標(biāo)，其提取方法不同，劑量差異也較大，提取次數(shù)和提取量都會(huì)影響得率，提取工藝不同其化學(xué)組分含量也不一致，因而提取次數(shù)對(duì)甘草多糖的化學(xué)組分造成的差異還有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。