宋文天，盧紅妍，楊鏡琦，方 麗,2，閔偉紅,2，劉春雷,2,

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 吉林長春 130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室, 吉林長春 130118）

抗性淀粉（Resistant Starch，RS）為膳食纖維的組成成分之一，不能被健康人體小腸利用提供葡萄糖，但能由大腸中腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，有利于有益菌群生長、人體健康[1]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)RS可優(yōu)化腸道菌群組成[2]、作為糖尿病人的食品基料[3]、減緩慢性腎臟疾病[4]、在結(jié)腸健康方面起關(guān)鍵作用[5]，同時具有降低膽固醇[6]和Ⅱ型糖尿病患病的風(fēng)險[7]等生理功能，被廣大學(xué)者所關(guān)注，日益成為食品領(lǐng)域研究熱點。然而國內(nèi)商業(yè)化生產(chǎn)RS技術(shù)并不成熟，我國目前RS的供給大多數(shù)來自國外且費用偏高，吉林省作為玉米淀粉出產(chǎn)大省，對玉米抗性淀粉的研究，具有重要的實際應(yīng)用價值。

化學(xué)法制備RS多采用交聯(lián)法和酯化法。相比于物理法和酶法，化學(xué)法在處理過程中引入化學(xué)試劑，不適宜制備可食用的食品。本實驗選取的三偏磷酸鈉是一種無有害副產(chǎn)物且合成條件溫和的交聯(lián)劑[8]，可使一種或多種淀粉粒子間發(fā)生交聯(lián)作用而呈多維立體的空間“網(wǎng)絡(luò)”狀態(tài)，進而增大分子量，增強淀粉顆粒之間的聯(lián)合作用，使結(jié)構(gòu)變得緊密，淀粉性質(zhì)發(fā)生改變[9?10]。使用復(fù)合交聯(lián)劑制備出的交聯(lián)淀粉含量高于單一交聯(lián)劑，熱穩(wěn)定性與抗剪切穩(wěn)定性等功能優(yōu)于原淀粉[11?12]，但目前采取復(fù)合交聯(lián)劑制備RS的研究較少。

基于上述情況，本文以普通玉米淀粉為原料，結(jié)合復(fù)合交聯(lián)劑制備RS的單因素試驗結(jié)果，利用響應(yīng)面優(yōu)化獲得交聯(lián)淀粉制備的最佳工藝條件；在此基礎(chǔ)上，將交聯(lián)淀粉的理化特性與酯化淀粉和原淀粉進行對比分析，為玉米抗性淀粉工業(yè)化生產(chǎn)及功能食品開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，同時為玉米精深加工的創(chuàng)新發(fā)展提供了新的思路。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉 吉林省杞參食品有限公司；三偏磷酸鈉、檸檬酸、三聚磷酸鈉 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；耐高溫α-淀粉酶（45000 U/mL）和葡萄糖淀粉酶（45000 U/mL） Sigma公司；中溫α-淀粉酶（3700 U/g） 食品級，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

ZD-2自動電位滴定儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；WFJ 2100可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；71403372-17場發(fā)射掃描電子顯微鏡 PHENOM公司；AL-204電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IR-Prestuge-21傅里葉紅外光譜 日本島津；Z36HK高速冷凍離心機

HERMLE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗性淀粉制備方法

1.2.1.1 交聯(lián)法制備抗性淀粉 參照KAHRAMAN等[13]的方法，稍作修改，將一定質(zhì)量比的復(fù)合交聯(lián)劑（三偏磷酸鈉:三聚磷酸鈉=99:1）、10%無水硫酸鈉和玉米淀粉分散在70 mL蒸餾水中（添加劑的重量均基于玉米淀粉的質(zhì)量）。將淀粉乳pH調(diào)整至12.0，一定溫度下水浴加熱，反應(yīng)一定時間后，再將pH調(diào)整到6.5，以終止改性反應(yīng)；用蒸餾水（洗7次）洗滌，4000 r/min離心5 min，將沉淀物置于50 ℃烘箱去除水分。干燥后的樣品研磨后過100目篩，獲得的篩下物即為待測樣品。

1.2.1.2 檸檬酸酯化法制備抗性淀粉 參照REMYA等[14]的方法，稍作修改；稱取一定質(zhì)量檸檬酸溶于蒸餾水中，攪拌均勻，配置質(zhì)量分數(shù)為50%檸檬酸溶液。用 10 mol/L NaOH，調(diào)pH為3.3，加水稀釋至25 mL，再與25 g淀粉混合放到平皿中，室溫靜置16 h。靜置結(jié)束后于50 ℃干燥箱中干燥至水分含量5%~10%，研磨過60目篩后放入干凈平皿中，在146 ℃烘箱中反應(yīng)6 h后室溫冷卻，用蒸餾水（洗7次）洗滌，4000 r/min離心5 min。將制得的濕樣品45 ℃干燥，烘干后粉碎過100目篩，得到樣品。

1.2.2 單因素實驗設(shè)計

1.2.2.1 反應(yīng)時間對抗性淀粉含量的影響 固定12%交聯(lián)劑、0.71 g/mL底物濃度和70 ℃水浴加熱，研究分別反應(yīng)2、2.5、3、3.5、4 h對抗性淀粉含量的影響。

1.2.2.2 交聯(lián)劑濃度對抗性淀粉含量的影響 固定0.71 g/mL底物濃度、70 ℃水浴加熱和反應(yīng)3 h，研究分別加入8%、10%、12%、14%、16%交聯(lián)劑對抗性淀粉含量的影響。

1.2.2.3 底物濃度對抗性淀粉含量的影響 固定12%交聯(lián)劑、70 ℃水浴加熱和反應(yīng)3 h，研究0.57、0.64、0.71、0.79、0.86 g/mL底物濃度對抗性淀粉含量的影響。

1.2.2.4 溫度對抗性淀粉含量的影響 固定12%交聯(lián)劑、0.71 g/mL底物濃度和反應(yīng)3 h，研究分別采取 40、50、60、70、80 ℃水浴加熱對抗性淀粉含量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面中心組合實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以交聯(lián)劑濃度（A）、底物濃度（B）和反應(yīng)溫度（C）作變量，利用響應(yīng)面優(yōu)化獲得交聯(lián)淀粉制備的最佳工藝條件，具體設(shè)計見表1。

表1 三因素三水平響應(yīng)面中心組合實驗設(shè)計Table 1 Three-factor three-level response surface center combination experiment design

1.2.4 還原糖含量測定 測定還原糖含量的方法主要參考 3，5-二硝基水楊酸法[15?16]，移取 0.5 mL 樣品于試管中，再加入0.5 mL水楊酸，混勻，沸水浴5 min，立即冷卻至室溫，再加4 mL去離子水，混勻，測540 nm下樣品吸光度，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=3.4831x?0.0556）計算得還原糖含量。

1.2.5 玉米抗性淀粉含量測定 參照GONI等[17]的方法，并稍作修改；稱取1.00 g樣品抗性淀粉，溶于20 mL（pH為 6.0）磷酸氫二鈉緩沖溶液，混勻后加入10 μLα-淀粉酶，在 150 r/min 的振動頻率下，將待測樣品溶液置于離心管中并放入90 ℃恒振蕩器中振蕩30 min，隨即在3000 r/min轉(zhuǎn)速下離心分離10 min，棄除上清；再向樣品溶液中加入20 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH為4.5）后混勻，再移取0.1 mL葡萄糖淀粉酶加入并再次混勻，在60 ℃恒溫水浴振蕩30 min，之后在3000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min后棄除上清液，再水洗兩次去上清；再添加20 mL 4 mol/L KOH溶液充分溶解，冰浴振蕩20 min后調(diào)pH至6.0~7.0，加入 0.1 mL耐高溫α-淀粉酶，在 85~90 ℃水浴振蕩30 min后立即冷卻至室溫，調(diào)pH至4.5，再向該待測液中添加0.1 mL葡萄糖淀粉酶 ，混合均勻后放置在60 ℃恒溫水浴振蕩1 h；取出樣品立即冷卻至室溫后在3000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min再進行離心，水洗3次，收集上清液并定容至100 mL，最后測定溶液pH，再用水楊酸法測定還原糖。

1.2.6 理化性質(zhì)分析

1.2.6.1 透明度 參照郭澤鑌等[18]方法，稍作修改，稱取3種不同的淀粉樣品，加適量蒸餾水配成質(zhì)量分數(shù)為1.0%溶液，90 ℃水浴加熱30 min。在620 nm處用分光光度計測定淀粉糊吸光度，用吸光度表示透明度。

1.2.6.2 凍融穩(wěn)定性 稱取樣品置于離心管中，配制成5%淀粉乳溶液，95 ℃水浴30 min，取出冷卻至室溫，于?20 ℃ 下冷藏 24 h，室溫溶解，3500 r/min離心20 min，根據(jù)沉淀物質(zhì)量計算析水率[19]。

式中：m1表示淀粉糊質(zhì)量，g；m2表示沉淀質(zhì)量，g。

1.2.6.3 溶解度和膨脹度 參照MERAL等[20]方法，取1.0 g樣品加蒸餾水20 mL，沸水浴30 min，冷卻至室溫，4000 r/min，離心15 min，上清液烘干至恒重分別稱取溶出物質(zhì)量和管中沉淀物質(zhì)量。

式中：m1表示上清液溶出物質(zhì)量，g；m2表示離心后沉淀質(zhì)量，g。

1.2.6.4 持水力 參照馬麗萍等[21]方法，將100 mg淀粉樣品分散于10 mL水中，置于45、55、65、75、85 ℃水浴1 h，冷卻至室溫后，6000 r/min離心15 min，棄掉上清液，稱沉淀質(zhì)量，計算持水力。

式中：m1表示沉淀質(zhì)量，g；m2表示樣品質(zhì)量，g。

1.2.6.5 淀粉顆粒表面形態(tài)分析 測試電壓5 kV，噴金后使用電鏡觀察并拍攝顆粒形貌[22]。

1.2.6.6 紅外光譜分析 樣品和溴化鉀按1:100的比例進行壓片，在400~4000 cm?1波段進行掃描[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

做3次平行實驗，采用 Origin 8.5作圖、DPS進行顯著性分析(t檢驗)和Design Expert 8.0.6進行響應(yīng)面優(yōu)化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

如圖1a所示，當(dāng)改性反應(yīng)的交聯(lián)劑濃度為10%時，玉米抗性淀粉的含量達到最大峰值，顯著高于其它點（P<0.05），為47.32%，故選擇本條件做后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化指標(biāo)。因為交聯(lián)劑的作用使玉米抗性淀粉分子間作用力增強，在此作用下抗性淀粉的含量得到了進一步的提高，促進了反應(yīng)進行。繼續(xù)添加交聯(lián)劑，會使?jié)舛茸兏邥M而導(dǎo)致產(chǎn)物取代度提高，隨著取代度的提高, 破損的淀粉顆粒變得越來越多，對抗性淀粉的生成產(chǎn)生了抑制作用[24]。

如圖1b所示，當(dāng)改性反應(yīng)的底物濃度為0.71 g/mL時，玉米抗性淀粉的含量達到最大峰值，顯著高于其它點（P<0.05），為44.24%，隨后呈現(xiàn)下降趨勢，故選擇本條件做后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化指標(biāo)。底物濃度高或低，抗性淀粉的含量都會相應(yīng)下降，一方面是因為淀粉糊濃度低，黏度也低，淀粉分子相互分離；另一方面，淀粉糊濃度太高，流動性變差，且水分子進入淀粉的結(jié)晶區(qū)比較困難，抑制了反應(yīng)進行[25]。

如圖1c所示，當(dāng)改性反應(yīng)的溫度處于70 ℃時，玉米抗性淀粉的含量達到最大峰值，顯著高于其它點（P<0.05），為42.93%，隨后呈現(xiàn)下降趨勢，故選擇本條件做后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化指標(biāo)。適宜的反應(yīng)溫度會使淀粉分子擴散的速度加快進而會提高交聯(lián)劑的交聯(lián)效率，當(dāng)反應(yīng)溫度超越了臨界溫度后，交聯(lián)劑與淀粉間的有效碰撞在一定限度上會被削弱，導(dǎo)致交聯(lián)度下降，另有一部分淀粉會產(chǎn)生糊化反應(yīng)，進而會抑制反應(yīng)進行[26]。

如圖1d所示，當(dāng)改性反應(yīng)時間為3.5 h時，玉米抗性淀粉的含量達到最大峰值，為44.44%，顯著高于其它點（P<0.05），隨后呈現(xiàn)下降趨勢，但是顯著性較低，同時從能耗方面考慮，故選擇本條件作為固定的指標(biāo)。隨著反應(yīng)的時間延長可以提高淀粉分子與交聯(lián)劑的接觸，二者充分接觸后，玉米抗性淀粉的含量會加大；然而時間過長會招致交聯(lián)劑分子間彼此發(fā)生作用及水分的大批蒸發(fā)，導(dǎo)致淀粉糊化進而對抗性淀粉的生成產(chǎn)生了抑制作用[27]。

圖1 不同因素對抗性淀粉含量的影響Fig.1 The effect of different factors on the yield of resistant starch

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析 根據(jù)單因素實驗結(jié)果分析選擇反應(yīng)時間（3.5 h）為確定值。再以交聯(lián)劑濃度（A）、底物濃度（B）和反應(yīng)溫度（C）作變量進一步進行響應(yīng)面分析優(yōu)化出最優(yōu)的試驗指標(biāo)，響應(yīng)面試驗的結(jié)果見表2。

用Design Expert軟件的8.0.6版本對表2中的數(shù)據(jù)回歸解析,獲得回歸模型是: Y=44.55+6.67A+6.28B?14.69C+2.90AB?4.77AC?4.78BC?9.56A2?17.13B2?4.21C2；通過方差分析對所得的Y方程進行剖析見下表3。

表2 三因素三水平響應(yīng)面中心組合實驗結(jié)果Table 2 The result of three-factor three-level response surface center combination experiment

Y方程模型的P<0.01，說明此模型達到了極顯著水平，失擬項P為0.3393，失擬項的影響不明顯[28]，同時也意味著非試驗因素對本試驗結(jié)果的影響不是很大，決定系數(shù)R2=0.9877，表明本次建造的模型與實際實驗擬合度很好。因此，能夠運用上述Y方程來描述各變量與抗性淀粉含量之間的關(guān)系，進而來測評各變量對玉米抗性淀粉含量影響的顯著性。交互項中，AB、AC和BC項P>0.05，影響程度不顯著，交互項影響均較小。依據(jù)表3中的回歸方程的系數(shù)，可知影響玉米抗性淀粉的含量因素的順序為C(溫度)>A(交聯(lián)劑濃度)>B(底物濃度)。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)上述回歸擬合方程，將3個因素中的任意一個因素固定在不變值(即0水平面)，繪制等高線和響應(yīng)面曲線，得到另外2個因素彼此作用的結(jié)果，去研究相關(guān)變量之間的相互作用，并獲得最優(yōu)坐標(biāo)點。且等高線圖中的橢圓形意味著兩因素彼此交互作用明顯，而圓形則表示兩個因素之間交互作用不是很明顯[29]。

由圖2b、圖2d和圖2f可知，在某一因素作為中心點固定不變時，其余兩因素彼此交互作用都不顯著。

圖2 不同因素對抗性淀粉含量影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.2 Contour plot and response surface plot of the effect of different factors on the yield of resistant starch

2.2.3 驗證實驗 用 Design Expert軟件（V8.0.6）響應(yīng)面分析知，應(yīng)用玉米淀粉制備抗性淀粉的最佳改性條件是: 反應(yīng)時間3.5 h、底物濃度0.71 g/mL、交聯(lián)劑濃度11.31%、反應(yīng)溫度60 ℃。在上述優(yōu)化條件下，最高的含量可達60.87%。實際操作將條件調(diào)整為：反應(yīng)時間3.5 h、交聯(lián)劑濃度11.5%、底物濃度0.71 g/mL、反應(yīng)溫度60 ℃。之后進行了3次驗證實驗，含量平均值為(60.76%±0.45%)，該值與分析得到的預(yù)測值比較貼合, 表明本次實驗運用響應(yīng)面優(yōu)化而得到的最佳參數(shù)是可靠的。

2.3 理化性質(zhì)分析

2.3.1 透明度分析 淀粉的糊透明度是食品應(yīng)用中非常重要的參數(shù)，由于淀粉的分子結(jié)構(gòu)中無生色基團，因此以吸光度的值表示淀粉糊的透明度[30]。交聯(lián)淀粉的吸光度為1.246，顯著低于其余二者（P<0.05），這可能是由于交聯(lián)鍵數(shù)目的增加導(dǎo)致淀粉顆粒的致密性和分子量的增加，因為淀粉分子與交聯(lián)劑充分反應(yīng)后，分子之間更加緊密牢固[31]，進而使光線不容易透過淀粉乳，導(dǎo)致吸光度下降，與楊帆[32]和HU[33]等結(jié)果相一致。因此本法制取的交聯(lián)淀粉更適用在透明度低的飲料中，如高纖維飲料[28]中用來增加飲料的不透明度（圖3）。

圖3 不同淀粉透明度分析Fig.3 Transparency analysis of different starches

2.3.2 凍融穩(wěn)定性分析 樣品的凍融穩(wěn)定性是由析水率反映出來的，析水率與凍融穩(wěn)定性成反比，好的凍融穩(wěn)定性可以賦予食品良好的膨化度和良好的質(zhì)地。交聯(lián)法制得的抗性淀粉析水率為88.08%，顯著高于酯化淀粉和原淀粉（P<0.05），可能是由于分子間親水力增強，減弱分子間氫鍵強度，減小脫水縮合作用，降低淀粉冷凍后的穩(wěn)定性[34]（圖4）。

圖4 不同淀粉凍融穩(wěn)定性分析Fig.4 Analysis of freeze-thaw stability of different starches

2.3.3 溶解度和膨脹度分析 如圖5a可見，普通玉米淀粉經(jīng)交聯(lián)后，溶解度由10.02%提高至13.01%，顯著高于原淀粉（P<0.05）。因為在制備抗性淀粉的過程中它的結(jié)晶結(jié)構(gòu)會在加熱條件下被破壞，進而導(dǎo)致直鏈淀粉從結(jié)晶結(jié)構(gòu)中解離并且分散于水中，隨著溫度的提高，淀粉分子微晶束也變得松弛，淀粉也會不斷溶解[35]。

圖5 不同淀粉的溶解度和膨脹度分析Fig.5 Solubility and swelling analysis of different starches

而膨脹度是淀粉顆粒完整性的一個指標(biāo)。如圖5b所示，在沸水浴的條件下，導(dǎo)致原淀粉糊化成淀粉糊的同時大量吸水，由于氫鍵被破壞，與羥基結(jié)合的水分子被釋放，顆粒膨脹，因此玉米淀粉的膨脹度急速升高[36]；交聯(lián)淀粉的膨脹度408.02%顯著低于原淀粉1009.00%，可能是由于交聯(lián)反應(yīng)增強了淀粉鏈之間的鍵合，從而抑制了淀粉顆粒的溶脹[37]，可以更好的應(yīng)用于熱加工食品中。

2.3.4 持水力分析 在65 ℃之后原淀粉的持水力顯著高于兩種抗性淀粉（P<0.05），可能是在沸水浴的條件下，高于普通玉米淀粉的糊化溫度，導(dǎo)致原淀粉糊化成淀粉糊的同時大量吸水，因此玉米淀粉的析水率急速升高[37]。在制備抗性淀粉的過程中，檸檬酸與淀粉分子生成檸檬酸酐，而交聯(lián)劑與淀粉分子生成磷酸酯基，因此酯化淀粉持水力優(yōu)于交聯(lián)淀粉，本實驗制備出的交聯(lián)淀粉持水力較穩(wěn)定，與牛博文等[38]研究結(jié)果相一致，可以更好地適用于食品工業(yè)中（圖6）。

圖6 不同淀粉的持水性分析Fig.6 Water holding capacity analysis of different starches

2.3.5 淀粉顆粒表面形態(tài)分析 玉米淀粉顆粒表面較為平滑，大小不一，顆粒呈橢球形或者多邊形。發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)后，淀粉顆粒的形狀和大小沒有顯著差異。結(jié)果表明，玉米抗性淀粉交聯(lián)后，有輕微的凹陷，淀粉分子變成不規(guī)則多面體，分子表面變得不平滑，是由于復(fù)合交聯(lián)劑與淀粉分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)從而腐蝕了淀粉分子表面[39]；檸檬酸酯化后的淀粉原有顆粒形貌顯著被破壞，顆粒表面凹凸不平，說明淀粉分子表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)因乙酰基的加入而被破壞了顆粒表面[14](圖7)。

圖7 不同淀粉的掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron micrographs of different starches

2.3.6 紅外光譜分析 傅里葉紅外光譜儀可以在一定范圍檢測內(nèi)淀粉分子的結(jié)構(gòu)，尤其是分子鏈之間的構(gòu)象和雙螺旋結(jié)構(gòu)間的不同[40]。紅外光譜圖中在1200、1086和1026 cm?1附近的吸收峰是C-O鍵的伸縮，3400 cm?1附近的寬峰歸屬于－OH鍵的伸縮振動，在1700 cm?1附近對應(yīng)的是C=O酯鍵的特征峰[41]。如圖8所示，在1700 cm?1處與玉米淀粉相比酯化淀粉發(fā)生了伸縮振動，檸檬酸的確和淀粉發(fā)生了酯化反應(yīng)。在3400 cm?1處的-OH伸縮振動峰與玉米淀粉相比變寬，這說明-OH被交聯(lián)鍵取代，伸縮振動減少，隨著交聯(lián)反應(yīng)的進行，交聯(lián)淀粉引入的新的磷酸基團和玉米淀粉分子中天然存在的磷酸基團對應(yīng)的特征峰距離較小，互相重疊，因此峰值的增加是因為引入了磷酸基團引起的，反映出了交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。1022 cm?1和995 cm?1的值可反映出淀粉顆粒雙螺旋結(jié)構(gòu)的程度，從圖8中可以看到，與原料玉米淀粉相比，交聯(lián)淀粉和酯化淀粉峰值都有所下降，結(jié)合前文電鏡分析，可能是制備抗性淀粉的過程中玉米淀粉原有的結(jié)構(gòu)遭到了破壞，所以峰值與玉米淀粉比較之下相對較小。

圖8 不同淀粉的紅外光譜圖分析Fig.8 Infrared spectrum analysis of different starches

3 結(jié)論

優(yōu)化得到的玉米交聯(lián)抗性淀粉的改性條件為：反應(yīng)時間3.5 h、交聯(lián)劑濃度11.50%、底物濃度0.71 g/mL、反應(yīng)溫度60 ℃。在此最優(yōu)改性條件下可制出RS含量為60.76%、膨脹度為408.02%、和溶解性為13.01%的交聯(lián)淀粉。通過紅外光譜證實了交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，掃描電鏡結(jié)果表明交聯(lián)淀粉顆粒的形狀和大小與原淀粉對比沒有顯著差異，但是交聯(lián)法改性制取的RS凍融穩(wěn)定性不如原淀粉，有待日后進一步研究。