袁 林，曾 靜，郭建軍，魏國(guó)汶

（江西省科學(xué)院微生物研究所, 江西南昌 330096）

乳酸菌是一群革蘭氏陽(yáng)性、能夠發(fā)酵碳水化合物、以乳酸為主要代謝產(chǎn)物的各類細(xì)菌統(tǒng)稱，是人與大多數(shù)動(dòng)物腸道內(nèi)的常見優(yōu)勢(shì)菌群[1?5]。乳酸菌被廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)以及飼料工業(yè)等，是全世界公認(rèn)的安全級(jí)（Generally Recognized as Safe, GRAS）食品微生物，并逐漸成為微生物學(xué)研究的模式生物[6]?，F(xiàn)階段研究與開發(fā)乳酸菌食品級(jí)載體-受體系統(tǒng)，探索重要基因在乳酸菌中的克隆表達(dá)，已成為乳酸菌分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)[7?11]。

質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中染色體之外，能夠自主復(fù)制的共價(jià)閉合環(huán)狀雙螺旋的DNA分子或遺傳因子。已有研究表明，乳酸菌可攜帶數(shù)個(gè)質(zhì)粒，大小不一，其中多數(shù)質(zhì)粒為隱蔽性質(zhì)粒，少數(shù)質(zhì)粒則具有某些特殊功能[12]。乳酸菌的一些特性與其所攜帶的質(zhì)粒相關(guān)，并且這些特性可以通過質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)移至其他乳酸菌或其他細(xì)菌中[13]。目前已有許多研究對(duì)乳酸菌內(nèi)源性質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定和功能分析，并利用乳酸菌內(nèi)源性質(zhì)粒上重要元件構(gòu)建乳酸菌載體，其中獲得乳酸菌內(nèi)源性質(zhì)粒的復(fù)制子是構(gòu)建乳酸菌載體的關(guān)鍵[14?16]。例如，F(xiàn)ang 等[17]對(duì)來(lái)源于植物乳桿菌Lactobacillus plantarumLP3的質(zhì)粒pLP3進(jìn)行分離及測(cè)序分析，并基于質(zhì)粒pLP3的復(fù)制子成功構(gòu)建乳酸菌表達(dá)載體；Zuo等[18]對(duì)來(lái)源于糞腸球菌Enterococcus faecalisML21的高拷貝數(shù)質(zhì)粒pML21進(jìn)行分離及測(cè)序分析，然后采用分子生物學(xué)技術(shù)將質(zhì)粒pML21的復(fù)制子與大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭載體pAM1上包含紅霉素抗性基因Em和大腸桿菌復(fù)制子的DNA片段相融合，獲得了大腸桿菌-糞腸球菌穿梭載體。

本研究從本實(shí)驗(yàn)室前期分離純化的具有優(yōu)良益生特性的糞腸球菌Enterococcus faecalisEXW27中分離得到了內(nèi)源性質(zhì)粒pXW，擬對(duì)其進(jìn)行DNA序列的測(cè)定及分析，確定質(zhì)粒pXW的最小復(fù)制子，然后利用質(zhì)粒pXW的復(fù)制子構(gòu)建大腸桿菌-乳酸菌穿梭載體，并研究大腸桿菌-乳酸菌穿梭載體的宿主范圍、轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性。本研究所涉及的糞腸球菌E.faecalisEXW27的內(nèi)源性質(zhì)粒pXW可以為乳酸菌基因操作提供新工具，并可以為構(gòu)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乳酸菌表達(dá)載體提供基礎(chǔ)元件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌Escherichia coliDH5α、糞腸球菌E.faecalisEXW27、乳脂乳球菌LactococcuscremorisMG1363、乳酸乳球菌乳酸亞種Lactococcus lactissubsp.lactisLM0230、嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilusXW118、植物乳桿菌Lactiplantibacillus plantarumXW113、鼠李糖乳桿菌Lacticaseibacillus rhamnosusDB、副干酪乳桿菌Lacticaseibacillus paracaseiLG1、乳酸片球菌Pediococcus acidilacticiXW28 均由本實(shí)驗(yàn)室保存；KOD-Plus-neo DNA聚合酶 日本Toyobo公司；DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒 日本Takara公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、M17肉湯培養(yǎng)基 杭州百思生物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為分析純。

PCR 儀 (Mastercycler gradient) 美國(guó) Eppendorf公司；QuantStudio 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；TY04S-3C 凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；SP-752PC 紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒構(gòu)建過程中以及糞腸球菌內(nèi)源性質(zhì)?？截悢?shù)測(cè)定過程中涉及的引物及其序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer sequences

1.2.2 質(zhì)粒的提取與序列測(cè)定 挑取MRS平板上單菌落，接種于100 mL新鮮的 MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。8000 g離心10 min收集菌體，首先用10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA，pH8.0 緩沖液洗滌菌體沉淀，然后用含有30 mg/mL溶菌酶溶液（10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA，pH8.0）重新懸浮菌體，并于 37 ℃處理1 h，最后采用 Takara 質(zhì)粒 DNA 小量純化試劑盒提取質(zhì)粒。利用瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)所提取質(zhì)粒的大小，并將分離純化的質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.3 質(zhì)粒的序列分析及注釋 將測(cè)序完成的DNA 序列用 SnapGene Viewer（version 2.3.2）軟件進(jìn)行人工拼接，繪制質(zhì)粒圖譜，標(biāo)注重要酶切位點(diǎn)并分析質(zhì)粒DNA序列中的G+C含量。采用NCBI網(wǎng)站的 ORF finder （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找質(zhì)粒的開放閱讀框（open reading frame，ORF），結(jié)合質(zhì)粒啟動(dòng)子預(yù)測(cè)網(wǎng)站Promoter Pridition（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）確定各開放閱讀框的啟動(dòng)子序列。采用NCBI網(wǎng)站的 BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.ov/Blast.cgi）對(duì)各開放閱讀框所編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能。

1.2.4 質(zhì)?？截悢?shù)的測(cè)定

1.2.4.1 糞腸球菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 挑取MRS平板上單菌落，接種于100 mL新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。每間隔2 h取1 mL培養(yǎng)液，測(cè)定培養(yǎng)液于600 nm的吸光值，測(cè)定糞腸球菌的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4.2 糞腸球菌總DNA的提取 挑取MRS平板上單菌落，接種于100 mL新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。8000 g離心10 min收集菌體，首先用10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA，pH8.0緩沖液洗滌菌體沉淀，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[19]中細(xì)菌總DNA提取方法提取菌體的總DNA。

1.2.4.3 質(zhì)?？截悢?shù)的測(cè)定 采用相對(duì)定量 PCR法[20]測(cè)定內(nèi)源性質(zhì)粒在糞腸球菌EXW27中的拷貝數(shù)。選取糞腸球菌基因組上單拷貝基因gyrB作為內(nèi)參基因，內(nèi)源性質(zhì)粒上單拷貝基因repB作為目的基因。針對(duì)基因gyrB和repB分別設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物：gyrB-F、gyrB-R、repB-F、repB-R。引物對(duì)的設(shè)計(jì)要求是引物對(duì)的擴(kuò)增效率均高于95%，并且兩者的數(shù)值相差低于1%。采用所設(shè)計(jì)引物對(duì)以細(xì)菌總DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)熒光定量PCR反應(yīng)的產(chǎn)物。對(duì)糞腸球菌總DNA進(jìn)行系列梯度稀釋，取已稀釋的DNA樣品作為模板，測(cè)得各樣品的CT值，將CT值與log10C0（C0為稀釋度）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。將所得到的引物擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率代入引物擴(kuò)增效率E的計(jì)算公式（公式1）中，分別計(jì)算得到各引物對(duì)的擴(kuò)增效率。取不同生長(zhǎng)階段的糞腸球菌菌體，并按照如上方法提取總DNA，將總DNA等比稀釋至0.1~1 ng/μL，作為熒光定量PCR的模板。采用所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行熒光定量PCR，讀取熒光定量PCR反應(yīng)的CT值，并代入公式2計(jì)算質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

式中，k為擴(kuò)增擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

式中，E為引物的擴(kuò)增效率，△CT為用目的基因相關(guān)的引物和內(nèi)參基因相關(guān)的引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增得到的CT值的差值。

1.2.5 質(zhì)粒最小復(fù)制子的鑒定

1.2.5.1 大腸桿菌-糞腸球菌穿梭載體的構(gòu)建 通過分析質(zhì)粒的開放閱讀框，初步確定質(zhì)粒上的復(fù)制子信息。設(shè)計(jì)不同引物對(duì)（如表1所示），采用PCR技術(shù)擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的含復(fù)制子的DNA片段。擴(kuò)增F1片段所用引物對(duì)為F1-F、F1-R；擴(kuò)增F2片段所用引物對(duì)為F2-F、F1-R；擴(kuò)增F3片段所用引物對(duì)為F3-F、F1-R；擴(kuò)增F4片段所用引物對(duì)為F2-F、F4-R；擴(kuò)增F5片段所用引物對(duì)為F2-F、F5-R；擴(kuò)增F6片段所用引物對(duì)為F2-F、F6-R。以大腸桿菌-糞腸球菌穿梭載體pXWM1的構(gòu)建為例，采用引物對(duì)F2-F、F5-R擴(kuò)增F1片段，采用引物對(duì)pAM1-F、pAM1-R擴(kuò)增大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭載體pAM1上包含紅霉素抗性基因和大腸桿菌復(fù)制子的DNA片段。將得到的兩種DNA片段均用BamHI和XhoI雙酶切處理，酶切產(chǎn)物回收后酶連轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子酶切驗(yàn)證，獲得重組質(zhì)粒pXWM1。

1.2.5.2 糞腸球菌感受態(tài)制備及電擊轉(zhuǎn)化 糞腸球菌感受態(tài)制備及電擊轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[21?23]進(jìn)行。挑取 MRS 平板上單菌落，接種于100 mL新鮮的 GM17液體培養(yǎng)基 [0.5%（g/100 mL）葡萄糖、M17液體培養(yǎng)基]中，30 ℃靜置培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物以1%的接種量接種于100 mL新鮮的 SGM17 液體培養(yǎng)基 [0.5 mol/L蔗糖、0.5%（g/100 mL）葡萄糖、1%（g/100 mL）甘氨酸、M17 液體培養(yǎng)基 ]中，30 ℃靜置培養(yǎng)5~6 h。離心收集菌體沉淀，用冰浴的電擊緩沖液（0.5 mol/L蔗糖、10%甘油）洗滌兩次后，重懸于100 μL電擊緩沖液中，放置在冰上待用。向100 μL 感受態(tài)細(xì)胞中加入100 ng 重組質(zhì)粒，輕輕混勻，置于冰上備用。將含有重組質(zhì)粒的糞腸球菌感受態(tài)細(xì)胞混合液小心加入冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，然后進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。電擊轉(zhuǎn)化參數(shù)為1.8 kV、200 Ω、25 μF，脈沖時(shí)間為4.0 ms。電擊完成后，立即向電轉(zhuǎn)杯中加入900 μL新鮮的 SGM17 液體培養(yǎng)基，30 ℃靜置復(fù)蘇2 h。取復(fù)蘇后的菌液涂布于含2.5 μg/mL 紅霉素的 MRS 固體平板，30 ℃培養(yǎng)24~48 h。

1.2.6 穿梭載體的宿主范圍、轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性測(cè)定

1.2.6.1 穿梭載體的宿主范圍測(cè)定 參照1.2.5.2中方法制備多種乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞，將驗(yàn)證過的能夠有效復(fù)制的穿梭載體轉(zhuǎn)化乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子涂布于含2.5 μg/mL紅霉素的MRS固體平板，30 ℃培養(yǎng)48~96 h。觀察轉(zhuǎn)化平板上是否有穿梭質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子菌落，確定穿梭質(zhì)粒的宿主范圍。

1.2.6.2 穿梭載體的轉(zhuǎn)化效率測(cè)定 分別取 20、50、100 和 500 ng 重組質(zhì)粒與乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞混勻，電擊轉(zhuǎn)化乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞，每個(gè)濃度做3個(gè)平行。轉(zhuǎn)化子于 30 ℃ 靜置活化 3 h 后，將菌懸液稀釋至合適的濃度，涂布于含 2.5 μg/mL 紅霉素的 MRS固體平板，30 ℃ 培養(yǎng) 48 h 至菌落長(zhǎng)出。對(duì)平板菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，最終以這四個(gè)梯度中效率最高者作為穿梭載體的轉(zhuǎn)化效率。

1.2.6.3 穿梭載體的穩(wěn)定性測(cè)定 挑取轉(zhuǎn)化平板上單菌落接種至含25 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)。再以1%接種量接種至不含紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。再次按1%接種量接種至不含紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，依次傳代培養(yǎng)直至60代。稀釋培養(yǎng)好的菌液分別涂布于含紅霉素的MRS固體平板和不含紅霉素的MRS固體平板。將兩種固體平板上的菌落數(shù)代入公式3計(jì)算質(zhì)粒丟失率，并以此數(shù)據(jù)來(lái)表征質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)圖像的處理

以Primer premier 5.0的引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)引物的設(shè)計(jì)，以Tanon 1600全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)對(duì)DNA瓊脂糖電泳凝膠進(jìn)行采集及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒的分離與序列測(cè)定

從糞腸球菌EXW27中分離得到質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明從糞腸球菌EXW27提取得到的質(zhì)粒為單一條帶，大小約為8000 bp。將此質(zhì)粒命名為質(zhì)粒pXW，并將分離純化的質(zhì)粒樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

圖1 質(zhì)粒pXW的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of plasmid pXW

2.2 質(zhì)粒的注釋

將測(cè)序完成的DNA序列用SnapGene Viewer軟件進(jìn)行人工拼接，繪制質(zhì)粒圖譜，如圖2A所示。質(zhì)粒pXW是雙鏈環(huán)狀DNA分子，共8617 bp，GC含量為33.29%。經(jīng)BLAST分析顯示：質(zhì)粒pXW的核苷酸序列與來(lái)源于屎腸球菌E.faeciumFS86的質(zhì)粒（GeneBank登錄號(hào)：MT501398.1）的核苷酸序列具有最高的相似性，兩者的相似率為88.37%。并且兩種質(zhì)粒的核苷酸序列比對(duì)結(jié)果顯示：除了E.faeciumFS86來(lái)源質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜（圖2B）上紅色標(biāo)記出的四個(gè)額外片段（片段 1、2、3、4）外，兩種質(zhì)粒的核苷酸序列完全一致。其中片段1在E.faeciumFS86來(lái)源質(zhì)粒上的位置為2579~2794，片段2在E.faeciumFS86來(lái)源質(zhì)粒上的位置為4477~4647，片段3在E.faeciumFS86來(lái)源質(zhì)粒上的位置為 6996~7323，片段 4在E.faeciumFS86來(lái)源質(zhì)粒上的位置為9080~9498。以上結(jié)果表明，糞腸球菌和屎腸球菌之間可能通過水平基因轉(zhuǎn)移來(lái)獲得質(zhì)粒片段或質(zhì)粒。目前，有關(guān)E.faeciumFS86來(lái)源質(zhì)粒的序列分析未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究對(duì)自主分離得到的質(zhì)粒pXW進(jìn)行序列分析。

圖2 質(zhì)粒圖譜Fig.2 Physical map

對(duì)質(zhì)粒pXW進(jìn)行開放閱讀框（ORF）搜索，結(jié)果顯示質(zhì)粒pXW含有8個(gè)開放閱讀框。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)這些開放閱讀框進(jìn)行序列信息的比對(duì)，預(yù)測(cè)所有ORF的功能，各ORF編碼的蛋白質(zhì)信息如表2所示。ORF1編碼一個(gè)含159個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，為遷移蛋白質(zhì) MobC（Mobilization protein），該MobC蛋白的氨基酸序列與來(lái)源于屎腸球菌E.faecium24-10的MobC蛋白的氨基酸序列的相似性高達(dá)99%。ORF2編碼一個(gè)含304個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，為遷移蛋白質(zhì)MobA（Mobilization protein），該MobA蛋白的氨基酸序列與來(lái)源于屎腸球菌E.faeciumAcr4的MobA蛋白的氨基酸序列的相似性高達(dá)96%。MobC蛋白和MobA蛋白可能與質(zhì)粒的遷移作用相關(guān)[24]。ORF4編碼一個(gè)含245個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，為復(fù)制起始蛋白R(shí)epB（Replication initiation protein），該RepB蛋白的氨基酸序列與來(lái)源于E.faeciumC68的RepB蛋白的氨基酸序列的相似性高達(dá)99%。RepB蛋白的BLAST分析結(jié)果顯示，RepB蛋白屬于Rep_3超家族（pfam01051），預(yù)測(cè)與質(zhì)粒的θ型復(fù)制相關(guān)[24?26]。ORF5編碼一個(gè)含178個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，為DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)（DUF536 domain-containing protein），該DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)的氨基酸序列與來(lái)源于E.faecium的DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)的氨基酸序列的相似性高達(dá)99%。DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)屬于DUF536超家族，為未知功能蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)其與質(zhì)粒的 θ型復(fù)制相關(guān)[24?26]。ORF7編碼一個(gè)含403個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，為轉(zhuǎn)座酶（transposase），該轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列與來(lái)源于E.faecium64/3 xUW2774的轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列的相似性高達(dá)100%。ORF8編碼一個(gè)含567個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器ATP-結(jié)合蛋白（ABC transporter ATP-binding protein），該 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器 ATP-結(jié)合蛋白的氨基酸序列與來(lái)源于E.faecium的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器ATP-結(jié)合蛋白的氨基酸序列的相似性高達(dá)99%。ORF3和ORF6在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有搜索到與其相關(guān)的蛋白質(zhì)。質(zhì)粒pXW上除具有與質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)（復(fù)制起始蛋白R(shí)epB和DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)）外，還包含有與質(zhì)粒遷移作用相關(guān)的蛋白質(zhì)（遷移蛋白質(zhì)MobC和MobA），以及轉(zhuǎn)座酶和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器ATP-結(jié)合蛋白，因此質(zhì)粒pXW被歸為顯性質(zhì)粒。質(zhì)粒pXW在糞腸球菌EXW27中所起的作用有待進(jìn)一步研究確證。

表2 質(zhì)粒pXW的開放閱讀框信息Table 2 Open reading frame information for plasmid pXW

2.3 質(zhì)?？截悢?shù)的測(cè)定

本研究采用相對(duì)定量PCR法測(cè)定內(nèi)源性質(zhì)粒pXW在糞腸球菌EXW27中的拷貝數(shù)。選取糞腸球菌基因組上單拷貝基因gyrB作為內(nèi)參基因，內(nèi)源性質(zhì)粒上單拷貝基因repB作為目的基因。針對(duì)基因gyrB和repB分別設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物：gyrBF、gyrB-R、repB-F、repB-R。采用所設(shè)計(jì)引物以糞腸球菌EXW27總DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)熒光定量PCR的產(chǎn)物，結(jié)果如圖3所示。gyrB和repB的PCR產(chǎn)物大小分別為145 bp和150 bp。對(duì)糞腸球菌EXW27的總DNA進(jìn)行系列梯度稀釋，取已稀釋的DNA樣品作為模板，分別采用引物對(duì)gyrB-F/gyrB-R或repB-F/repBR進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，測(cè)得各樣品的CT值，將CT值與log10C0（C0為樣品的稀釋度）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。引物對(duì)gyrB-F/gyrB-R的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=?3.4327x+2.3219，R2=0.9995；引物對(duì)repB-F/repB-R的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=?3.4358x+5.4843，R2=0.9999。將所得的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率代入引物擴(kuò)增效率E的計(jì)算公式（公式1），計(jì)算得到引物對(duì)gyrB-F/gyrB-R和repB-F/repB-R的擴(kuò)增效率分別為95.57%和95.48%。引物對(duì)的擴(kuò)增效率均高于95%，而且兩者的數(shù)值相差僅為0.09%，低于1%。因此引物對(duì)gyrB-F/gyrB-R和repB-F/repB-R是可以作為相對(duì)定量PCR引物使用的。

圖3 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products

圖4 引物擴(kuò)增效率的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of amplification efficiency of primers

取不同生長(zhǎng)階段的糞腸球菌EXW27菌體，并提取其總DNA，將總DNA等比稀釋至0.1~1 ng/μL，作為熒光定量PCR的模板。采用所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行熒光定量PCR，讀取熒光定量PCR反應(yīng)的CT值，并代入公式2計(jì)算在糞腸球菌EXW27于不同生長(zhǎng)時(shí)期的質(zhì)粒pXW拷貝數(shù)。質(zhì)粒pXW的拷貝數(shù)隨糞腸球菌EXW27生長(zhǎng)的變化趨勢(shì)（圖5）為：糞腸球菌EXW27的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早中期時(shí)質(zhì)粒pXW的拷貝數(shù)最高，且基本保持穩(wěn)定，最高拷貝數(shù)為32.09±0.93；其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期至穩(wěn)定期時(shí)質(zhì)粒pXW的拷貝數(shù)逐漸降低，到生長(zhǎng)穩(wěn)定期時(shí)，質(zhì)?？截悢?shù)穩(wěn)定為12.75±0.79。因此糞腸球菌EXW27的內(nèi)源性質(zhì)粒pXW屬于高拷貝質(zhì)粒[27]。在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，質(zhì)?？截悢?shù)發(fā)生下降屬于普遍現(xiàn)象，其中的原因可能是細(xì)菌生長(zhǎng)后期時(shí)細(xì)胞生理代謝發(fā)生變化，細(xì)胞的生長(zhǎng)趨于停滯，胞內(nèi)DAN合成減慢，內(nèi)源性質(zhì)粒復(fù)制所依賴的DNA聚合酶合成量也隨之下降。雖然質(zhì)粒自身編碼的復(fù)制相關(guān)蛋白可以識(shí)別復(fù)制起始位點(diǎn)，但是缺乏必要的酶系，導(dǎo)致復(fù)制復(fù)合體無(wú)法形成，質(zhì)粒復(fù)制受到阻礙，質(zhì)粒的拷貝數(shù)下降。

圖5 質(zhì)粒pXW的拷貝數(shù)與糞腸球菌EXW27生長(zhǎng)曲線之間的關(guān)系Fig.5 Relationship between the copy number of plasmid pXW and the growth curve of E.faecium EXW27

2.4 質(zhì)粒的復(fù)制方式推定以及最小復(fù)制子的鑒定

通過對(duì)質(zhì)粒pXW上的開放閱讀框進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，確定了質(zhì)粒上與其復(fù)制相關(guān)的復(fù)制蛋白，一個(gè)是復(fù)制起始蛋白R(shí)epB，一個(gè)是復(fù)制起始蛋白R(shí)epB下游的DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)。本研究進(jìn)一步對(duì)復(fù)制起始蛋白R(shí)epB的上游DNA序列進(jìn)行詳細(xì)分析（如圖6所示），發(fā)現(xiàn)復(fù)制起始蛋白R(shí)epB的上游存在類似起始質(zhì)粒復(fù)制的反向重復(fù)序列和正向重復(fù)序列，推測(cè)復(fù)制起始蛋白R(shí)epB所在區(qū)域可能為復(fù)制子區(qū)域。根據(jù)以上分析，推測(cè)質(zhì)粒pXW含有1個(gè)復(fù)制子，包括復(fù)制起始子、復(fù)制起始蛋白R(shí)epB以及下游的DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)。復(fù)制起始子含有1對(duì)13 bp的反向重復(fù)序列IR（Invert repeats，IR）、2個(gè) 8 bp的正向重復(fù)序列DR1（Direct repeats，DR）、3.5個(gè) 12 bp的正向重復(fù)序列DR2以及4.5個(gè)22 bp的正向重復(fù)序列DR3。復(fù)制起始蛋白R(shí)epB屬于Rep_3超家族（pfam01051）。Rep_3超家族中RepB蛋白均與質(zhì)粒的θ型復(fù)制相關(guān)，例如糞腸球菌E.faecium226的質(zhì)粒pMBB1為θ型復(fù)制質(zhì)粒，其RepB蛋白屬于Rep_3超家族[26]。緊接其下游的DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)為未知功能蛋白質(zhì)， BLAST分析結(jié)果顯示其可能與質(zhì)粒的θ型復(fù)制相關(guān)。此外，質(zhì)粒pXW的復(fù)制子結(jié)構(gòu)屬于典型的θ型質(zhì)粒的復(fù)制子結(jié)構(gòu)[28?29]。因此推定質(zhì)粒pXW的復(fù)制類型為θ型復(fù)制。

圖6 質(zhì)粒pXW的復(fù)制區(qū)域分析Fig.6 Genetic context of the replication region of plasmid pXW

為了確定質(zhì)粒pXW的最小復(fù)制子，本研究構(gòu)建了含有不同長(zhǎng)度復(fù)制子片段的大腸桿菌-糞腸球菌穿梭載體，并將不同的大腸桿菌-糞腸桿菌穿梭載體分別轉(zhuǎn)化糞腸球菌感受態(tài)，驗(yàn)證質(zhì)粒pXW的最小復(fù)制子。如圖7所示，復(fù)制子片段F1包含一部分ORF3、完整的反向重復(fù)序列IR、完整的正向重復(fù)序列DR、ORF4、ORF5以及ORF5的下游區(qū)域；復(fù)制子片段F2包含完整的反向重復(fù)序列IR、完整的正向重復(fù)序列DR、ORF4、ORF5以及ORF5的下游區(qū)域；復(fù)制子片段F3包含完整的正向重復(fù)序列DR、ORF4、ORF5以及ORF5的下游區(qū)域；復(fù)制子片段F4包含完整的反向重復(fù)序列IR、完整的正向重復(fù)序列DR、ORF4、ORF5以及部分ORF5的下游區(qū)域；復(fù)制子片段F5包含完整的反向重復(fù)序列IR、完整的正向重復(fù)序列DR、ORF4以及ORF5；復(fù)制子片段F5包含完整的反向重復(fù)序列IR、完整的正向重復(fù)序列DR、ORF4以及部分ORF5。穿梭載體的轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示，含有復(fù)制子片段F1、F2、F4或F5的大腸桿菌-糞腸球菌穿梭載體電擊轉(zhuǎn)化糞腸球菌感受態(tài)后有菌落長(zhǎng)出，含有復(fù)制子片段F3或F6的大腸桿菌-糞腸球菌穿梭載體電擊轉(zhuǎn)化糞腸球菌感受態(tài)后無(wú)菌落長(zhǎng)出。因此，對(duì)于質(zhì)粒pXW的復(fù)制子，完整的反向重復(fù)序列IR、完整的正向重復(fù)序列DR、ORF4以及ORF5是必需的。質(zhì)粒pXW的最小復(fù)制子包括完整的反向重復(fù)序列IR、完整的正向重復(fù)序列DR、復(fù)制起始蛋白R(shí)epB以及θ型復(fù)制相關(guān)蛋白DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白。

圖7 質(zhì)粒pXW最小復(fù)制子的鑒定Fig.7 Minimal replicon identification of plasmid pXW

2.5 質(zhì)粒的宿主范圍、轉(zhuǎn)化效率及穩(wěn)定性測(cè)定

將確定最小復(fù)制子過程中構(gòu)建的含有復(fù)制片段F5的穿梭載體命名為pXWM1，其質(zhì)粒圖譜如圖8所示。為確定穿梭質(zhì)粒pXWM1的宿主范圍，將穿梭質(zhì)粒pXWM1電擊轉(zhuǎn)化至各種乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞中，利用紅霉素標(biāo)記進(jìn)行篩選，以確定穿梭質(zhì)粒pXWM1的宿主范圍，并計(jì)算其在各種乳酸菌中的轉(zhuǎn)化效率和穿梭質(zhì)粒的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，穿梭質(zhì)粒pXWM1均可在表3所示的乳酸菌中成功電轉(zhuǎn)，并獲得對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化子。這表明，質(zhì)粒pXW屬于寬宿主范圍質(zhì)粒。前面研究結(jié)果顯示質(zhì)粒pXW被推斷為θ型復(fù)制質(zhì)粒，質(zhì)粒較穩(wěn)定，并且質(zhì)粒pXW含有質(zhì)粒遷移蛋白MobC和MobA，這些因素與該質(zhì)粒屬于寬宿主質(zhì)粒是相符合的。

圖8 pXWM1的質(zhì)粒圖譜Fig.8 Physical map of pXWM1

穿梭質(zhì)粒pXWM1在表3所示的乳酸菌中的電擊轉(zhuǎn)化效率介于 1.96×102~8.96×104CFU/μg （質(zhì)粒DNA）之間，比普通乳酸菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率（10~105CFU/μg質(zhì)粒DNA）略低。穿梭質(zhì)粒比普通乳酸菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率略低的可能原因是[30]：乳酸菌宿主菌中存在限制性修飾系統(tǒng)，排斥未甲基化的外源質(zhì)粒；乳酸菌宿主菌內(nèi)可能存在不親和群的質(zhì)粒；不同乳酸菌宿主菌的DNA甲基化水平；以及其他限制轉(zhuǎn)化效率的因素如電擊電壓、電擊緩沖液、感受態(tài)細(xì)胞的狀態(tài)等。穿梭載體pXWM1在表3所示的乳酸菌中經(jīng)過60代連續(xù)傳代培養(yǎng)后，穿梭質(zhì)粒的丟失率介于28.54%~54.17%之間。穿梭載體pXWM1在不同乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞中電轉(zhuǎn)化效率和質(zhì)粒穩(wěn)定性的差異，可能與質(zhì)粒和宿主菌的相容性相關(guān)[14]。

表3 穿梭載體pXWM1在不同乳酸菌宿主中的轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性Table 3 Transformation efficiency and stability of shuttle vector plasmid pXWM1 in different hosts

3 結(jié)論

從具有優(yōu)良益生特性的糞腸球菌E.faecalisEXW27中分離得到了內(nèi)源性質(zhì)粒pXW，該質(zhì)粒大小為8617 bp，GC含量為33.29%。針對(duì)該質(zhì)粒DNA序列的BLAST分析結(jié)果顯示質(zhì)粒pXW為新質(zhì)粒。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該質(zhì)粒編碼8個(gè)ORF，其中包括質(zhì)粒遷移作用蛋白MobC（ORF1）和 MobA（ORF2）、質(zhì)粒復(fù)制起始蛋白 RepB（ORF4）、θ型復(fù)制相關(guān)蛋白DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白（ORF5）、轉(zhuǎn)座酶（ORF7）、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)器 ATP-結(jié)合蛋白（ORF8）以及假定蛋白質(zhì)（ORF3、ORF6）。根據(jù)復(fù)制起始蛋白R(shí)epB、緊接其下游的DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白以及復(fù)制子的序列分析，推測(cè)該質(zhì)粒的復(fù)制方式為θ型復(fù)制。質(zhì)粒pXW在糞腸球菌EXW27中拷貝數(shù)最高可達(dá)32.09±0.93，表明質(zhì)粒pXW屬于高拷貝數(shù)質(zhì)粒。本研究確定了質(zhì)粒pXW的最小復(fù)制子，并利用該復(fù)制子成功構(gòu)建大腸桿菌-糞腸球菌穿梭載體pXWM1。該穿梭載體的宿主范圍寬，實(shí)現(xiàn)了在多種乳酸菌中的成功轉(zhuǎn)化，并且轉(zhuǎn)化效率高，質(zhì)粒丟失率低。質(zhì)粒pXW的這些優(yōu)良特性有利于將其改造為具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乳酸菌工程載體。