李旭陽，劉慧燕，潘 琳，胡明珍，方海田，王 彤，王艷萍

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750021）

乳酸菌是一類對宿主有益的活性微生物，進(jìn)入并定植在胃腸道后，能夠與宿主共生，從而構(gòu)成一個復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境，對宿主發(fā)揮其益生作用，例如改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，維持腸道的微生態(tài)平衡，提高宿主的免疫力[1]。但是具有益生功能的乳酸菌多從酸奶中篩選得到，可應(yīng)用于植物基原料發(fā)酵的乳酸菌相對較少。傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜是潛在的優(yōu)質(zhì)乳酸菌的自然資源庫，為制備不同種類的乳酸菌發(fā)酵劑提供了選擇。從傳統(tǒng)發(fā)酵分離得到的乳酸菌不僅能改善食品原有的苦味、澀味等不良?xì)馕?，還可提高發(fā)酵食品的營養(yǎng)價值，而且還能進(jìn)一步提高發(fā)酵食品的生理保健機(jī)能[2?3]。

寧夏枸杞子（Lycium barbarumL.）可作為日常食用和藥用，枸杞果實(shí)中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，主要包括多糖、多肽、生物堿、黃酮類、萜烯類、有機(jī)酸、木脂素、酚酰胺、類胡蘿卜素等多種化合物，而多糖是枸杞果實(shí)中含量最豐富的活性成分，具有不同的藥理活性和保健作用[4]。由于枸杞自身并沒有突出的香味，并且藥味濃重，使用商業(yè)乳酸菌發(fā)酵劑發(fā)酵的枸杞汁風(fēng)味和口感不佳，影響了乳酸菌發(fā)酵枸杞汁飲品的生產(chǎn)和市場開發(fā)[5]。因此，開發(fā)新的發(fā)酵劑來改善枸杞汁的藥味濃重和口感不佳具有重要意義。

本研究從寧夏銀川市采集的泡菜中分離篩選乳酸菌，通過形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行鑒定，并對其耐酸、耐膽鹽及發(fā)酵性能進(jìn)行測定，篩選性能優(yōu)良的乳酸菌，最后將其應(yīng)用到發(fā)酵枸杞汁中。對發(fā)酵前后的枸杞汁中多糖及多酚含量進(jìn)行對比分析，以期改善發(fā)酵枸杞汁的品質(zhì)和風(fēng)味，為發(fā)酵枸杞汁的工業(yè)化生產(chǎn)和發(fā)酵劑的制備提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泡菜樣品 從寧夏銀川市采集3份不同家庭制作的發(fā)酵泡菜；寧夏中寧枸杞 市售；福林試劑（AR）沒食子酸（AR） 麥克林公司；NaCl（AR） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DPPH、ABTS苯酚 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛膽鹽、HCl 特正商貿(mào)有限公司。

FR980恒溫培養(yǎng)箱 上海復(fù)日科技有限公司；UV-752紫外可見分光光度計 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；HH-3A數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海丙林電子科技有限公司；DL-CJ-1N超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Agilent8890B-5977B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室pH計上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離篩選 將采集的樣品用生理鹽水稀釋至 10?6、10?7、10?8梯度，將其分為兩組進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，使用 MRS 培養(yǎng)基對不同樣品進(jìn)行 10?6、10?7、10?8梯度培養(yǎng)，涂布后的樣品在37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)36~48 h后，在兩組平行實(shí)驗(yàn)中選取不同形狀，顏色，大小和形態(tài)的單個菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)。劃線后在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36~48 h。將劃線培養(yǎng)后的菌傳到MRS液體培養(yǎng)基中置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~36 h[6]。將通過液體培養(yǎng)過的菌液接著在MRS的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，反復(fù)劃線提高菌株的純度以便于進(jìn)行篩選。劃線培養(yǎng)后進(jìn)行液體培養(yǎng)，一般液體傳代培養(yǎng)2~3代部分進(jìn)行乳酸菌的檢測實(shí)驗(yàn)，部分用脫脂乳保存后置于?80 ℃冰箱儲存。

1.2.2 菌株鑒定 初步鑒定：根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[7]有關(guān)細(xì)菌形態(tài)和生理生化特性等對分離出的菌株進(jìn)行鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：使用天根生化科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對挑選的乳酸菌進(jìn)行基因提取，采用16S rDNA的通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[8]。引物為：27F（5'-AACTGAGTTTGATC CTGGCTC-3'）、1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTAC GACTT-3'）其 PCR 擴(kuò)增體系為：模板 DNA 2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，2× Taq PCR Master Mix 0.5 μL，dNTP 4 μL，引物（F+R）3μL，雙蒸水（ddH2O）35.5 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 1 min，58 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 2 min，72 ℃末端延伸10 min，30個循環(huán)；72 ℃末端延伸10 min，4 ℃保存。將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Colibri核酸純度測定儀測定濃度，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，以確認(rèn)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增片段。若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1500 bp左右，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。DNA編碼用DNA star軟件中的Seq Man進(jìn)行序列拼接、校對；將處理好的測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information， NCBI） 的GenBank數(shù)據(jù)中進(jìn)行局部序列比對基本檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列[9?10]。采用 MEGA-X 軟件中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

1.2.3 乳酸菌生長曲線 取2%乳酸菌菌懸液接種于MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，從0 h開始，每隔2 h取樣一次，用分光光度法（波長600 nm）時測吸光度值（OD）。以空白培養(yǎng)基作為對照，一種菌液每次取樣做三次重復(fù)。以時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制作生長曲線[12]。

1.2.4 乳酸菌耐酸能力 用鹽酸將MRS液體培養(yǎng)基調(diào) pH至2.0，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。按合適的接種量將菌懸液接種到pH為2.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)4 h，每種乳酸菌做三個重復(fù)，采用平板菌落計數(shù)法測定各個乳酸菌的活菌數(shù)[13]。與未經(jīng)過酸化的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株做對比，計算乳酸菌的相對生長比率[14]。

式中：N2為酸耐受 4 h的活菌數(shù)，CFU/mL；N1為酸耐受前的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.5 乳酸菌耐膽鹽能力 稱取一定量的牛膽鹽于MRS液體培養(yǎng)基中，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%（空白）、0.3%、0.6% 和 0.9%，調(diào)節(jié) pH 至 6.5±0.2，121 ℃滅菌15 min，冷卻備用。按合適的接種量將菌懸液分別接種至含0%（空白）、0.3%、0.6%及0.9%含不同牛膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24~36 h后觀察不同濃度膽鹽培養(yǎng)液中菌體的生長情況，測定其波長為600 nm時OD值，計算乳酸菌對膽鹽的耐受力[15]。

式中：N1為不同濃度牛膽鹽的OD值，測定波長為600 nm；N0為未加牛膽鹽的OD值，測定波長為600 nm。

1.2.6 乳酸菌發(fā)酵枸杞汁的制備 將枸杞汁和水以1:5的比例混合浸泡5~6 h，浸泡時加入0.05%（w/v）異抗壞血酸鈉，在浸泡結(jié)束后加入0.15%（w/v）的果膠酶，混勻后進(jìn)行打漿，將打漿完的枸杞汁進(jìn)行過濾，濾去枸杞籽，并用檸檬酸將枸杞汁的pH調(diào)至4.5左右，加糖量為料液的4%，混勻后進(jìn)行55 ℃，25 min水浴巴氏殺菌。水浴完將培養(yǎng)好的乳酸菌菌懸液按5%的接種量接入枸杞汁中，輕輕搖晃，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。對發(fā)酵前后的枸杞汁進(jìn)行多酚含量測定、多糖含量測定、抗氧化性實(shí)驗(yàn)及感官評價。

1.2.7 多酚含量的測定 取采用福林酚法測定[16?17]。取1.0 mL適當(dāng)稀釋后的待測樣品于10 mL比色管中，加入2.5 mL福林酚試劑，搖勻，加入2.5 mL 15%Na2CO3溶液，其加入樣品、福林酚試劑、15%Na2CO3溶液的比例為1:2.5:2.5，后加水定容至刻度，搖勻。40 ℃水浴60 min，靜置冷卻20 min，測定其在波長778 nm時的吸光度值。其標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作為吸取200 mg/L沒食子酸 0.0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.5 mL分別置于10 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，得到?jīng)]食子酸工作液。然后分別取沒食子酸工作液1.0 mL于10 mL比色管中，再根據(jù)比例加入福林酚試劑和15% Na2CO3溶液。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.1252x?0.0148計算待測液中總多酚的濃度。

1.2.8 多糖含量的測定 使用苯酚-硫酸法測多糖[18?19]。取待測樣品 10 mL，加入 30 mL 95% 乙醇在4 ℃下靜置 24 h，用濾布過濾，用冷乙醇沖洗沉淀2次，待風(fēng)干后用40 mL水溶解沉淀。取上述水溶液1 mL加入1 mL 5%苯酚溶液，再向混合液中加入5 mL濃硫酸，充分混勻，靜置10 min，于40 ℃水浴鍋放置15 min，取出后立即冷卻至室溫。測定其在490 nm波長下吸光度值。其標(biāo)準(zhǔn)曲線測定為取葡萄糖（0.1 mg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于不同具塞試管中，每個具塞試管分別加水定容至2.0 mL，加1 mL 5%苯酚溶液，搖勻后加入5 mL濃硫酸搖勻，其余操作參照以上所述。帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.8243x?0.0098中計算枸杞汁中多糖的濃度。

1.2.9 DPPH自由基及ABTS自由基清除率的測定取2 mL DPPH無水乙醇溶液和0.2 mL樣品溶液加1.8 mL無水乙醇溶液，測定其在波長517 nm處的吸光度值記為A1。用等量的無水乙醇代替樣品溶液作為樣品對照組，并將吸光度值記為A0。用等量的無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液作為空白對照，并將吸光度值記錄為A2[20?21]。測定DPPH自由基清除率能力的計算公式：

取2.6 mmol/L過硫酸鉀與ABTS溶液等體積混合，室溫避光靜置16~18 h，制成ABTS儲備液。用磷酸緩沖液（PBS）將ASTS緩沖液稀釋至其在波長734 nm時的吸光度值為0.7左右記為A0，將2 mL的ABTS稀釋液與0.2 mL的不同樣品混合，室溫靜置反應(yīng)6 min后測定734 nm處的吸光度值記為A[22]。測定ABTS自由基清除率能力的計算公式：

1.2.10 感官評分標(biāo)準(zhǔn) 為進(jìn)行發(fā)酵枸杞汁的感官評價，由12人均具有食品感官研究背景的老師和學(xué)生組成感官評定小組，對發(fā)酵枸杞汁的色澤、口感、香氣和組織狀態(tài)進(jìn)行評定，評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard

1.2.11 發(fā)酵與未發(fā)酵枸杞汁中揮發(fā)性成分測定取1000 μL樣品加入800 μL乙酸乙酯；渦旋30 s混勻后，冰水浴超聲萃取30 min；將樣品于?20 ℃靜置 30 min，然后高速離心 15 min（4 ℃，13000 r/min）；取上清，裝入1.5 mL離心管中；再加700 μL乙酸乙酯重復(fù)萃取一次，合并兩次上清液，氮?dú)獯蹈桑患尤?00 μL乙酸乙酯復(fù)溶，渦旋2 min后，冰水浴超聲10 min，高速離心；取上清到進(jìn)樣小瓶中進(jìn)行GCMS代謝組學(xué)分析。色譜條件：進(jìn)樣量1 μL。樣品經(jīng) DB-5MS毛細(xì)管柱（40 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent 122-5532G）分離后進(jìn)入質(zhì)譜檢測。進(jìn)樣口溫度 260 ℃，升溫程序：初始溫度 60 ℃，平衡 0.5 min，然后以8 ℃/min 的速度升至310 ℃，并維持6 min。質(zhì)譜條件：傳輸線溫度為 310 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV。

將原始數(shù)據(jù)件經(jīng)MassHunter workstation Quantitative Analysis（v10.0.707.0）軟件進(jìn)行搜庫鑒定及數(shù)據(jù)預(yù)處理，該軟件首先將質(zhì)譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，根據(jù)質(zhì)譜匹配度鑒定代謝物。內(nèi)標(biāo)峰以及任何已知的假陽性峰（包括噪音、柱流失和衍生物化試劑峰）均已從數(shù)據(jù)矩陣中去除，并進(jìn)行去冗余和峰合并。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上取平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；用統(tǒng)計分析軟件SPSS 25.0的LSD法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)；Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析；用Graph Pad Prism 8.0.1軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖。MassHunter workstation Quantitative Analysis（v10.0.707.0）軟件進(jìn)行峰提取、對齊等數(shù)據(jù)預(yù)處理操作，最終得到代謝物鑒定結(jié)果及數(shù)據(jù)矩陣，結(jié)合T檢驗(yàn)和VIP（OPLS-DA）篩選出差異代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定 在MRS培養(yǎng)基上共挑選出五種最具特點(diǎn)的單菌落進(jìn)行純化，圖1是五種乳酸菌的菌落形態(tài)，根據(jù)其都為邊緣整齊、表面及邊緣光滑，乳白色凸起的圓形菌落，且通過革蘭氏染色初步判定這五種單菌落均為革蘭氏陽性菌，將其歸為乳酸菌類[23]，且在顯微鏡下均為桿狀。

圖1 乳酸菌平板菌落圖Fig.1 Lactic acid bacteria plate colony diagram

2.2 分子生物學(xué)鑒定

通過16S rDNA第一代基因測序在NCBI基因庫進(jìn)行比對其同源率均在99%以上，經(jīng)鑒定菌株NXU-19010為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株 NXU-19023為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus），菌株 NXU_19006為戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus），菌株 NXU_19022 為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus），菌株 NXU-19004為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）（圖2）。

圖2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains

2.3 乳酸菌的生長曲線

由圖3可以看出這五種菌在12 h后基本進(jìn)入穩(wěn)定期，在2~8 h間處于對數(shù)生長期。NXU_19006的生長能力較緩慢，NXU_19022的生長能力最好，最快進(jìn)去平穩(wěn)期。在達(dá)到平穩(wěn)期時在波長為600 nm時測定的OD值均在2左右。所測得菌株生長曲線與白長勝等[24]篩選的乳酸菌在24 h內(nèi)的生長趨勢一致。

圖3 五種乳酸菌的生長曲線Fig.3 Growth curve of five lactic acid bacteria

2.4 耐酸耐膽鹽能力

耐酸耐膽鹽作為乳酸菌重要的特征之一，耐酸耐膽鹽能力越好，定植于人體腸道的能力就越強(qiáng)。才會在腸道里生存并發(fā)揮其作用[25]。

從圖4可以看出，這五種乳酸菌對酸都有一定的耐受能力，均在pH為2的酸性培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h時的存活率均在90%左右。本實(shí)驗(yàn)所得乳酸菌的耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果與賀曉潔[26]的研究結(jié)果相似。其中NXU_19022菌株的存活率最高，NXU_19004此菌株的存活率較低。

圖4 五種乳酸菌的耐酸能力Fig.4 Acid tolerance of five lactic acid bacteria

從圖5中可以看出，在牛膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的液體培養(yǎng)基中，所有菌株的存活率較高，均在 90%以上，其中 NXU_19022的存活率最高，NXU_19023的存活率最低；在牛膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的液體培養(yǎng)基中，所有菌株的存活率明顯降低，存活率均在20%左右，其中NXU_19010的存活率最高，NXU_19006的存活率最低；在牛膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的液體培養(yǎng)基中，所有菌株的存活率也有明顯降低，其中 NXU_19006的存活率最高，NXU_19004的存活率最低。當(dāng)牛膽鹽質(zhì)量百分比為0.3%時，本實(shí)驗(yàn)所測得的結(jié)果高于李利等[27]測得的乳酸菌在此條件下的存活率；當(dāng)牛膽鹽質(zhì)量百分比為0.6%時，本實(shí)驗(yàn)所測得的結(jié)果與李利等[27]所測得的結(jié)果基本一致。

圖5 五種乳酸菌的耐膽鹽能力Fig.5 Bile salt tolerance of five lactic acid bacteria

2.5 乳酸菌發(fā)酵枸杞汁中多酚及多糖的含量測定及感官評分

枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharide，LBP）是枸杞中活性成分中的一種水溶性多糖，其是一種對人體健康有益的活性物質(zhì)，具有促進(jìn)免疫、抗氧化、降血糖血脂等作用[28]。實(shí)驗(yàn)表明不同菌株發(fā)酵枸杞汁，其多糖含量不同，發(fā)酵后的枸杞汁（除NXU_19010）中多糖含量與未發(fā)酵比較顯著增加（P<0.05），其中NXU_19022與其它發(fā)酵組呈顯著差異，多糖含量顯著提高（P<0.05）。多糖含量增多可能是菌株產(chǎn)生胞外多糖，NXU_19022菌株產(chǎn)胞外多糖的能力優(yōu)于其它幾株乳酸菌產(chǎn)胞外多糖能力。

從表中可以看出發(fā)酵枸杞汁中多酚含量與未發(fā)酵枸杞汁中多酚含量基本呈顯著下降趨勢（P<0.05），其中NXU_19010發(fā)酵枸杞汁中的多酚含量與未發(fā)酵及其它菌株發(fā)酵枸杞汁中多酚含量均呈不顯著差異（P>0.05）。NXU_19004發(fā)酵后多酚含量下降最多，為未發(fā)酵枸杞汁的84%，NXU_19010發(fā)酵后枸杞汁中多酚含量下降較少，為原來的92%。發(fā)酵后多酚含量下降可能是乳酸菌在發(fā)酵過程中將發(fā)酵液中的多酚物質(zhì)做為營養(yǎng)物質(zhì)代謝消耗了。

綜合來看，NXU_19010發(fā)酵枸杞汁中多酚含量下降不顯著（P>0.05），但多糖含量下降顯著（P<0.05），感官評分與未發(fā)酵枸杞汁相比顯著改善（P<0.05）。NXU_19022發(fā)酵枸杞汁中多糖含量顯著提高（P<0.05），感官評分中口感顯著改善（P<0.05），但與未發(fā)酵枸杞汁相比，多酚含量顯著下降（P<0.05），與其它發(fā)酵組無顯著差異（P>0.05），多酚含量降為原來91%。比NXU_19010發(fā)酵枸杞汁中多酚含量減少0.86%（表2）。

表2 未發(fā)酵及不同乳酸菌發(fā)酵枸杞汁后多酚、多糖含量和感官評分Table 2 Polyphenol, polysaccharide content and sensory evaluation of wolfberry juice fermented by non fermented and different lactic acid bacteria

2.6 DPPH自由基及ABTS自由基清除率

圖6、圖7是未發(fā)酵枸杞汁組（UFGJ）和不同乳酸菌發(fā)酵枸杞汁組對自由基DPPH和ABTS的清除能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，不同組對DPPH自由基的清除能力有顯著差異（P<0.05），與未發(fā)酵組相比NXU_19022發(fā)酵枸杞汁的DPPH自由基清除能力顯著提高（P<0.05），其它發(fā)酵組相較未發(fā)酵組顯著降低（P<0.05），可能是菌株間代謝產(chǎn)物差異較大，降低了發(fā)酵液中的抗氧化性物質(zhì)。另外，不同組對ABTS自由基的清除能力基本無明顯提高或降低，僅NXU_19022發(fā)酵枸杞組對ABTS自由基清除能力有顯著提高（P<0.05），其它發(fā)酵組與未發(fā)酵組變化不大?？赡苁怯捎诎l(fā)酵菌株的不同。

圖6 五種乳酸菌的DPPH自由基清除率Fig.6 DPPH clearance rate of five lactic acid bacteria

圖7 五種乳酸菌的ABTS自由基清除率Fig.7 ABTS clearance rate of five lactic acid bacteria

根據(jù)已確定的發(fā)酵條件使用優(yōu)勢菌株瑞士乳桿菌NXU_19022進(jìn)行發(fā)酵，共發(fā)酵12 h。每2 h取樣測一次乳酸產(chǎn)量，做六次重復(fù)。乳酸菌發(fā)酵過程中將原料的碳水化合物轉(zhuǎn)化成乳酸，乳酸產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間延長逐漸增加，故以乳酸產(chǎn)量作為發(fā)酵過程中的檢測指標(biāo)且認(rèn)為乳酸產(chǎn)量突增時發(fā)酵開始進(jìn)入對數(shù)期。選擇未發(fā)酵的枸杞汁與乳酸產(chǎn)量突增時（發(fā)酵6 h）的發(fā)酵枸杞汁進(jìn)行發(fā)揮發(fā)性成分分析[29]。

2.7 發(fā)酵前后揮發(fā)性成分分析

2.7.1 揮發(fā)性成分對比 表3可以看出，枸杞汁發(fā)酵前后共檢測出24種揮發(fā)性成分，其中醇類2種；脂類 1種；酸類 6種；酚類 1種；酮類 2種；烯烴類3種；烷烴類1種；其它類8種。與未發(fā)酵的枸杞汁相比，醇類物質(zhì)在發(fā)酵枸杞汁中含量均增加。酚類物質(zhì)含量下降，在酸類物質(zhì)中只有2-乙基己酸的含量增加，其余均為下降，酮類物質(zhì)中4-甲基傘形酮的含量增加，烯烴類物質(zhì)含量均下降，棕櫚酸甲酯含量增加。其中，醇類物質(zhì)通常呈現(xiàn)出令人愉快的香味及甜味，也可與酸類物質(zhì)反應(yīng)生成脂類物質(zhì)，使酸類物質(zhì)含量下降，脂類物質(zhì)含量上調(diào)，脂類物質(zhì)也常呈現(xiàn)出令人愉悅的甜香及果香[30?31]。隨著發(fā)酵時間延長，呈香物質(zhì)含量可能會隨之增加，進(jìn)而改善枸杞原來藥味重的缺點(diǎn)（表3）。

表3 發(fā)酵前后枸杞汁中揮發(fā)性物質(zhì)的組成、含量Table 3 Composition and content of volatile substances in wolfberry juice before and after fermentation

根據(jù)具有明顯差異代謝物（P<0.05，VIP≥1）繪制熱圖，如圖8 所示，未發(fā)酵組（UFGJ1）中有（R_1、R_2、R_3、R_4、R_5、R_6）6個平行組；發(fā)酵組（FGJR_6h）中有（R6h_1、R6h_2、R6h_3、R6h_4、R6h_5、R6h_6）6個平行組。從圖中可以看出未發(fā)酵枸杞汁與發(fā)酵枸杞汁中的代謝產(chǎn)物有顯著差異。共有20種代謝產(chǎn)物VIP≥1。其中發(fā)酵后物質(zhì)含量上調(diào)的有4種物質(zhì)，其余均為下調(diào)。可能是選擇的是發(fā)酵6 h時與未發(fā)酵枸杞汁作比較，物質(zhì)含量上調(diào)可能是NXU_19022代謝的產(chǎn)物使枸杞汁中物質(zhì)含量增加，物質(zhì)下調(diào)可能此時NXU_19022代謝正處于對數(shù)時期，對營養(yǎng)物質(zhì)消耗較大，與NXU_19022的生長曲線圖一致，此刻處于對數(shù)期。

圖8 發(fā)酵前后枸杞汁代謝產(chǎn)物變化熱圖Fig.8 Heat map of the composition content of wolfberry juice before and after fermentation

2.7.2 特征風(fēng)味主成分分析 對發(fā)酵前后的枸杞汁進(jìn)行主成分分析（PCA），觀察圖可得：前兩個主成分上方差累計貢獻(xiàn)率64.4%，其中第一主成分（PC1）是46.40%，第二主成分（PC2）是18.00 %。在主成分分析圖中，其中明顯可以看出（R_1、R_2、R_3、R_4、R_5、R_6）未發(fā)酵組（UFGJ1）聚在一起；（R6h_1、R6h_2、 R6h_3、 R6h_4、 R6h_5、 R6h_6） 發(fā) 酵 組（FGJR_6h）聚在一起。可以清晰的觀察發(fā)酵前后枸杞汁各自聚類，區(qū)分度較明顯，組內(nèi)差異較?。▓D9）。

圖9 發(fā)酵前后的枸杞汁進(jìn)行主成分分析Fig.9 Principal component analysis of wolfberry juice before and after fermentation

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)主要通過從寧夏當(dāng)?shù)匕l(fā)酵泡菜中篩選優(yōu)勢乳酸菌，分離篩選并對其進(jìn)行16S rDNA分子生物學(xué)鑒定。共得到五種不同的乳酸菌分別為植物乳桿菌NXU_19010，鼠李糖乳桿菌NXU_19023，戊糖乳桿菌NXU_19006，瑞士乳桿菌NXU_19022，副干酪乳桿菌NXU_19004。其中NXU_19022的生長性能及體外抗性實(shí)驗(yàn)?zāi)退崮湍扄}性能最好。并用分離得到的5種乳酸菌進(jìn)行枸杞汁發(fā)酵，其中NXU_19022發(fā)酵枸杞汁能顯著提高枸杞汁的多糖含量，感官評分也優(yōu)于其它組，在抗氧化性實(shí)驗(yàn)中顯著提高了DPPH和ABTS自由基的清除率（P<0.05），但發(fā)酵后會降低枸杞汁中多酚的含量，可采用復(fù)配其它菌株來提高發(fā)酵后枸杞汁中多酚的含量。通過對未發(fā)酵與NXU_19022發(fā)酵6 h的枸杞汁進(jìn)行揮發(fā)性成分分析，結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前后枸杞汁的組分含量變化顯著，通過熱圖也能較好看出各組代謝物含量的變化。共檢測出24類物質(zhì)，醇類2種；脂類1種；酸類6種；酚類1種；酮類2種；烯烴類3種；烷烴類1種；其它類8種。其中醇類物質(zhì)變化較為明顯，酸類物質(zhì)中2-乙基己酸的含量增加，脂類物質(zhì)含量上調(diào)，其它類物質(zhì)變化較小，其中呈香味及甜味物質(zhì)含量上調(diào)，可能隨著發(fā)酵時間的延長，呈香和甜味物質(zhì)含量也會隨之增加，進(jìn)而改善枸杞汁的風(fēng)味。在主成分分析中，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前后枸杞汁能較好的區(qū)分，發(fā)酵前后枸杞汁各自聚類，區(qū)分度較明顯，組內(nèi)差異較小，說明發(fā)酵6 h后組分含量發(fā)生顯著變化。綜上，乳酸菌NXU_19022可通過發(fā)酵有效的改善發(fā)酵枸杞汁的品質(zhì)，改善枸杞汁的組分含量，為提升發(fā)酵枸杞汁質(zhì)量提供了依據(jù)和思路。