張 耀，吉克赤作莫，馮治平,2，張 獻(xiàn)，楊麗娟,2,

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院, 四川宜賓 644000；2.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川宜賓 644000）

木聚糖是植物半纖維素的主要成分，是廣泛存在于自然界的可再生資源[1?2]。廣義的木聚糖酶（Xylanse，EC3.2.1.8）是指可將木聚糖催化水解成低聚木糖的酶的總稱，如內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶、外切β-1，4-木聚糖酶、β-木糖苷酶等等，通常所說的木聚糖酶是指內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶（Endo-β-1，4-xylanase），主要功能是隨機(jī)切斷主鏈中的木聚糖苷鍵，生成分子量大小不同的木寡糖[3]。木聚糖酶的來源分布廣泛，許多微生物如細(xì)菌、真菌（霉菌和酵母）、放線菌都能產(chǎn)生木聚糖酶[4]。木聚糖酶具有良好的工業(yè)應(yīng)用價值，如造紙過程中可用于紙漿漂白、改善纖維性質(zhì)、廢紙脫墨；在啤酒釀造過程添加木聚糖酶有利于降低麥汁黏度、提高麥汁的得率以及提高麥汁的過濾速度以及在葡萄酒釀造中能改善葡萄酒質(zhì)量和穩(wěn)定性；在烘焙食品行業(yè)其能夠降低面包的老化率，使面包更加柔軟；在飼料工業(yè)中添加適當(dāng)木聚糖酶能夠改善飼料性質(zhì)從而提高飼料利用率[5?9]。

真菌所產(chǎn)木聚糖酶活性普遍高于細(xì)菌，但細(xì)菌的產(chǎn)酶周期短，酶的穩(wěn)定性相對較強(qiáng)，不同來源的木聚糖酶最適pH都有所不同，酸性木聚糖酶大多數(shù)來源于真菌，如吳仁智等[10]從廣西農(nóng)田中篩選具有酸性木聚糖酶活性的日本曲霉Aspergillus japonicusXYW5，其在 pH4.5條件下，木聚糖酶活可達(dá)26.26 U/mL。而大部分細(xì)菌所產(chǎn)的木聚糖酶接近于中性或偏堿性[11?12]。如鄭虹等[13]所篩選的腸桿菌RX-9，其木聚糖酶在pH7.5~9.5具有良好活性。制漿造紙時常需要在高堿性環(huán)境進(jìn)行，過程中常使用氯與次氯酸等進(jìn)行漂白，會向環(huán)境中排放出大量的氯氣造成環(huán)境的污染，而采用能夠耐堿性的木聚糖酶代替則規(guī)避了氯氣所帶來的危害，現(xiàn)如今關(guān)于細(xì)菌產(chǎn)酶木聚糖酶的報道很少，木聚糖酶酸性和中性的居多，大大制約了木聚糖酶在高堿性環(huán)境下的應(yīng)用[14?18]。竹鼠屬于草食性動物，日常主要以纖維素與半纖維素含量豐富的竹子、草根、草稈、甘蔗、玉米等為主要食物，消化粗纖維的能力突出，推測在竹鼠腸道及糞便的堿性條件中，可能存在能夠產(chǎn)耐堿性木聚糖酶的特色菌株。因此從竹鼠腸道中篩選出耐堿且酶活性高的木聚糖酶具有重要意義。本文對從竹鼠腸道及糞便中通過剛果紅褪色法和DNS法測定木聚糖酶活力，篩選得到的產(chǎn)木聚糖酶菌株進(jìn)行分子鑒定，觀察其生長與發(fā)酵產(chǎn)酶過程獲得最佳產(chǎn)酶時期，并對該菌株的粗酶液酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初探。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

竹鼠樣品 于2020年1月采自四川省宜賓市南溪當(dāng)?shù)剞r(nóng)家飼養(yǎng)的銀星竹鼠的腸道與糞便樣品；剛果紅、3，5-二硝基水楊酸、NaCl、蛋白胨、酵母浸粉、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、瓊脂粉 成都市科龍化學(xué)品有限公司；木聚糖（山毛櫸）、D-木糖 上海源葉生物科技有限公司。

UV-1800型紫外分光光度計 上海翱藝儀器有限公司；立式自動壓力蒸汽滅菌器 廈門致微儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；超凈工作臺 常州普天儀器制造有限公司；Eppendorf離心機(jī) 艾本德生命科學(xué)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母浸粉 5 g、NaCl 5 g、蒸餾水 1000 mL、pH7.0。

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g、酵母浸粉 5 g、NaCl 5 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1000 mL、pH7.0。

初篩培養(yǎng)基：蛋白胨 5 g、（NH4）2SO42 g、MgSO4·7H2O 0.25 g，KH2PO40.5 g、木聚糖 10 g，瓊脂 20 g、蒸餾水 1000 mL。

試管液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：木聚糖 0.1 g、KH2PO40.01 g、MgSO4·7H2O 0.005 g、（NH4）2SO40.02 g、蛋白胨 0.025 g、蒸餾水 10 mL、pH自然。

復(fù)篩產(chǎn)酶培養(yǎng)基：木聚糖 10 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、（NH4）2SO42.0 g、蛋白胨 2.5 g、蒸餾水 1000 mL、pH自然。

1.2.2 產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選 取1 g竹鼠腸道內(nèi)容物于50 mL無菌生理鹽水中，置于180 r/min、37 ℃搖床振蕩60 min。取2%體積搖勻的液體于LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取1 mL菌液加入9 mL無菌生理鹽水搖勻，梯度稀釋至 10?7，分別吸取 10?4、10?5、10?6、10?7等四個梯度的菌液 0.2 mL 涂布于初篩培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。在生長出的菌落中，挑取形態(tài)、顏色、大小不同的菌落于LB培養(yǎng)基平板劃線，純化3次后于甘油?80 ℃，斜面4 ℃保藏。

初篩采用剛果紅褪色法。菌株在平板上劃線純化后，選擇純化后的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，接種于試管液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，加入1 mL的1 mg/mL剛果紅溶液, 37 ℃、180 r/min培養(yǎng)3 d，每天觀察試管的顏色變化。

復(fù)篩采用酶活測定法，取1 mL初篩優(yōu)化后的菌株接種于復(fù)篩產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h后，取10 mL菌懸液于離心管中，4 ℃、8000 r/min離心10 min得到粗酶液，取1 mL粗酶液測定木聚糖酶活性。

1.2.3 木聚糖酶活力測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取試管6支，1%木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋10倍（1 mg/mL），用移液槍移取 0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，再加蒸餾水 2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0 mL，再移取加 DNS試劑1.5 mL混勻后在沸水浴中煮沸10 min，取出立即用冷水冷卻，再加蒸餾水至25 mL搖勻，測定OD540nm下吸光度值。以木糖濃度為橫坐標(biāo)(x)，吸光度為縱坐標(biāo)（y），繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

木聚糖酶活力測定：取1 mL的1%木聚糖溶液，1.5 mL的0.1 mol/L、pH4.8的檸檬酸緩沖溶液于試管中，50 ℃預(yù)熱 5 min，加入1 mL粗酶液于50 ℃下反應(yīng)10 min，加入2 mL DNS試劑混勻，沸水浴中反應(yīng)10 min滅酶，取出冷卻后加入蒸餾水定容至25 mL，在波長540 nm下檢測吸光度值，以空白對照調(diào)零[19?20]。

木聚糖酶酶活定義：1 mL酶液在50 ℃、pH5.0的條件下，每分鐘酶解木聚糖產(chǎn)生1 μg木糖所需要的酶量定義為1個酶活單位（U）。

1.2.4 菌株的分子生物學(xué)鑒定

1.2.4.1 形態(tài)鑒定 將菌株于LB固體培養(yǎng)基上劃線后，放置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，肉眼觀察菌落的形狀、大小、顏色等進(jìn)行觀察記錄。挑取單菌落制片后進(jìn)行革蘭氏染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)特征。

1.2.4.2 DNA提取及擴(kuò)增 用細(xì)菌基因組快速抽提試劑盒提取基因組。以細(xì)菌基因組DNA為模版，以16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’，將所得產(chǎn)物送至擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA序列測定，測序結(jié)果用美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）進(jìn)行 BLAST序列分析比較，并用MEGA7.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

PCR 反應(yīng)體系：2 μL 模版 DNA，1 μL 27F 引物，1 μL 1492R 引物，10 μL Mg2+Buffer，8 μL dNTP，0.5 μL Taq 酶，28.5 μL ddH2O。擴(kuò)增體系為：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃ 變性 30 s，54 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.5 生長曲線測定 將菌株接種于復(fù)篩產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，適當(dāng)稀釋后，以未培養(yǎng)LB培養(yǎng)基為空白對照，測定600 nm波長下菌體濃度，繪制菌株生長曲線。

1.2.6 產(chǎn)酶曲線測定 將菌株接種于復(fù)篩產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每隔12 h取樣一次，于540 nm波長下測定木聚糖酶活力，繪制菌株產(chǎn)酶曲線。

1.2.7 木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.7.1 最適pH和pH穩(wěn)定性 參照1.2.3中木聚糖酶活測定方法，取1 mL粗酶液與在不同pH的緩沖溶液（檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液pH3.0~8.0；Tris-HC1緩沖液pH8.0~9.0；甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液pH11.0~12.0)與1mL 1%的木聚糖反應(yīng)，比較得到最佳的pH（以最佳pH條件下的酶活力為100%）；采用上述緩沖溶液與粗酶液按1:1體積混合，50 ℃下保溫60 min后立即用冰水冷卻，研究酶的pH穩(wěn)定性（以未處理的酶活力為100%)。

1.2.7.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 將粗酶液在不同溫度 (20、30、40、50、60、65、70、80、90 ℃)下反應(yīng)，確定最佳反應(yīng)溫度(以最佳溫度條件下的酶活力為 100%)。粗酶液在（40、50、55、60、65、70、80 ℃）保溫60 min后測定酶活性，研究酶的溫度穩(wěn)定性（以未處理的酶活力為 100%）[21?22]。

1.2.7.3 金屬離子對酶活力影響 分別配制1.0 mmol/L的金屬離子溶液，于1mL粗酶液加入0.5 mL的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+，對照加水,于常溫下靜置1h后測定木聚糖酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，圖示采用Origin進(jìn)行作圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選

將選擇純化后的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，以2%接種量接種于試管液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，加入1 mL的1 mg/mL剛果紅溶液，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)3 d，定性分析菌株對于木聚糖分解能力如圖1所示，可觀察到試管的顏色變化，由于木聚糖隨著培養(yǎng)時間增加被分解，試管的顏色從起初的深紅色，12 h后轉(zhuǎn)變?yōu)闇\紅，3 d后可觀察已有試管成白色的現(xiàn)象。

圖1 試管剛果紅褪色圖Fig.1 Test tube Congo red fading diagram

將從初篩培養(yǎng)基生長得到的菌株分離純化3次后，挑選10株生長良好具有潛力的菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中37 ℃，180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng) 48 h，采用1.2.3方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與酶活測定。根據(jù)圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線計算木聚糖酶活性如表1。通過木聚糖酶活的測定可得10株菌株都具備木聚糖酶的活性，如表1中JZF菌株木聚糖酶活性相對較高，為15.17 U/mL。

圖2 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of xylose

表1 木聚糖酶酶活測定Table 1 Xylanase activity assay

將該菌株于LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，菌落呈圓形，乳白色，邊緣不平整，革蘭氏染色呈陽性，菌落形態(tài)為長桿狀，鏈狀排列，結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3 JZF菌株在平板上的菌落特征Fig.3 Colony characteristics of JZF strain on the plate

圖4 菌株JZF的顯微形態(tài)Fig.4 Microscopic morphology of strain JZF

2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

以JZF菌株的基因組為模板，PCR擴(kuò)增出16S rDNA序列后送擎科生物技術(shù)有限公司，大小約為1700 bp，電泳檢測結(jié)果如圖5、圖6所示。圖5表明基因組DNA提取成功，由圖6可知，擴(kuò)增片段分子量在1000~2000 bp范圍內(nèi)，條帶清晰明亮無非特異性擴(kuò)增，表示16S rDNA擴(kuò)增成功。

圖5 菌株JZF的總DNA電泳圖Fig.5 Total DNA electrophoresis of strain JZF

圖6 菌株JZF的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Electrophoresis of PCR products of strain JZF

將JZF的16S rDNA測序的DNA序列利用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，進(jìn)行相似性分析，結(jié)果顯示JZF的16S rDNA序列與NCBI基因庫中芽孢桿菌屬（Bacillus）的16S rDNA同源性最為接近，且一致性均在97%以上，從其中挑選10株的16S rDNA基因序列，通過比鄰法MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖7，JZF與蕈狀芽孢桿菌Bacillus mycoides親緣關(guān)系最為接近，因此命名為Bacillus mycoidesJZF。

圖7 菌株 JZF 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 The phylogenetic tree of strain JZF

2.3 菌株的生長與產(chǎn)酶曲線

將菌株接種于含木聚糖的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)中，繪制生長曲線與產(chǎn)酶曲線如圖8，可看出菌株在4~28 h時生長迅速，到28 h時OD600nm達(dá)到最大值，此后菌株生長緩慢，進(jìn)入穩(wěn)定期。將菌株接種發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，每間隔12 h測定其木聚糖酶活性，由圖可知菌株在12~36 h菌株產(chǎn)酶相對緩慢，隨著菌體的快速生長，酶活力指數(shù)也在快速增加到達(dá)72 h時酶活達(dá)到最大值為29.65 U/mL，72 h之后酶活力呈現(xiàn)出下降趨勢。與之前報道的木聚糖酶活性相比，如陳娜等[23]所得到的木聚糖酶發(fā)酵12 h后可到14.58 U/mL，董延娟[24]所得的木聚糖酶活性可達(dá)710 U/mL，本研究得到木聚糖酶的活力處在較低水平。

圖8 生長曲線與產(chǎn)酶曲線Fig.8 The growth curve and enzyme production curve

2.4 酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最適pH 將菌株JZF的粗酶液于不同pH下進(jìn)行催化反應(yīng)，檢測其酶活性得到最適反應(yīng)pH，以最大酶活力為100%計算相對酶活，結(jié)果如圖9。由圖9可以看出，菌株JZF粗酶液最適反應(yīng)pH為9.0，當(dāng)pH在7.0~10.0內(nèi)時具備90%以上的酶活性，當(dāng)pH在3.0~6.0與11.0~12.0內(nèi)時，保持70%以上的酶活性，現(xiàn)如今大多數(shù)木聚糖酶最適pH于6.0~7.0之間，本木聚糖酶最適pH為9，具備堿性木聚糖酶的特征。

圖9 木聚糖酶的最適pHFig.9 Optimal pH value of xylanase

2.4.2 pH穩(wěn)定性 由圖10可看出，菌株JZF所產(chǎn)的木聚糖酶在不同pH保持1 h后，在pH為9.0時，該酶具有最強(qiáng)的穩(wěn)定性，與之前研究的木聚糖酶

圖10 木聚糖酶的pH穩(wěn)定性Fig.10 pH stability of xylanase

pH穩(wěn)定性相比較，如張貝貝等[25]所得的木聚糖酶最適pH為6.0，在3.0~9.0具有一定的穩(wěn)定性。鄭亞倫等[26]源于解淀粉芽孢桿菌的木聚糖酶在pH5.0~7.0條件下培養(yǎng)1 h，殘余酶活力能保持在50 %以上具備一定的酸性穩(wěn)定性，而本研究的木聚糖酶當(dāng)pH在7.0~9.0內(nèi)時，仍能夠保持60%以上的酶活力，在其余pH條件下酶活力保持在60%以下，具備一定的堿性溫度性。

2.4.3 最適溫度 將JZF粗酶液于不同溫度下催化反應(yīng)10 min，測定其在對應(yīng)溫度下的酶活性，確定其最適反應(yīng)溫度，以最大酶活為100%計算相對酶活。如圖11所示，JZF的粗酶液在 20 ℃反應(yīng)具有85%以上的活性，隨著溫度的增加，酶活力逐漸升高到達(dá)50 ℃時達(dá)到最大值，當(dāng)溫度高于50 ℃后酶活力下降迅速，由此可見菌株JZF粗酶液的最適反應(yīng)溫度為50 ℃。

圖11 木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度Fig.11 Optimal reaction temperature of xylanase

2.4.4 溫度穩(wěn)定性 將該菌的粗酶液分別在40、50、55、60、65、70、80 ℃ 保溫 1 h 后，檢測其酶活力，以最大酶活為100%計算相對酶活，結(jié)果見圖12。由圖12可知，粗酶液在40 ℃下保溫具有最好的穩(wěn)定性，在40~50 ℃處理1 h仍具有90%以上的活性，隨著溫度上升，酶活力的變化趨勢與溫度成反相關(guān)，當(dāng)溫度高于70 ℃，其保持的相對酶活力已不到70%。

圖12 木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性Fig.12 Temperature stability of xylananse

2.4.5 金屬離子對酶活影響 在JZF的粗酶液中添加不同的金屬離子，檢測其酶活力，探究金屬離子對其木聚糖酶活力的影響，以不添加金屬離子的酶活為100%計算相對酶活，結(jié)果如圖13所示。由圖13

圖13 金屬離子對木聚糖酶活的影響Fig.13 The effect of metal ions on xylanase activity

可知，F(xiàn)e2+、Cu2+、Na+、K+、Zn2+、Mg2+對該酶都無促進(jìn)作用，其中Mg2+、K+對該酶有一定的抑制作用分別為97.02%、94.23%，Mn2+、Ca2+對其具有明顯的促進(jìn)作用分別為144.81%、113.80%。

3 結(jié)論

本研究從銀星竹鼠腸道及糞便中，通過液體剛果紅褪色法和DNS法篩選出了一株產(chǎn)耐堿性木聚糖酶的菌株JZF，通過形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides），酶活可達(dá)15.17 U/mL。該菌株在培養(yǎng)28 h后菌體量達(dá)到最大值，72 h后木聚糖酶活達(dá)到最大值為29.65 U/mL。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果表明，蕈狀芽孢桿菌JZF所產(chǎn)木聚糖酶最適合反應(yīng)溫度為50 ℃，最適pH9.0；40~60 ℃，pH8.0~9.0條件下相對酶活能保持在60%以上，金屬離子Mn2+與Ca2+對該菌株的木聚糖酶有明顯的促進(jìn)作用。

與之前研究所報道的木聚糖酶活性相比較，如姜立春等[27]從腐爛的木材中分離得到的纖維單胞菌屬（Celluomonassp.）其經(jīng)過優(yōu)化的木糖酶活性可達(dá)到62.8 U/mL。高志強(qiáng)與徐有權(quán)等[11,28]分別從土壤樣品與南方水稻及腐爛秸稈中中分離的高產(chǎn)木聚糖酶的短小芽孢桿菌（Bacuillus pumilus），其酶活性可達(dá)到1166 U/mL與85.12 U/mL。劉維等[29]土壤中篩選的枯草芽孢桿菌（Bacuillus subtillis），酶活達(dá)24.40 IU/mL。易旭東等[30]篩選的堿性木聚糖酶產(chǎn)生菌株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacuillus methylotrophicus）發(fā)酵后酶活為28.18 IU/mL。馮波[31]從篩選得到的康氏木霉（Trichoderma koningii）木聚糖酶活性為11.98 IU/g。何敏超等[32]所分離出高產(chǎn)木聚糖酶的黑曲霉（Aspergillus niger），木聚糖酶活性可高達(dá)10801.3 IU/g。本研究所得到的木聚糖酶活性較低，大多數(shù)報道中的木聚糖酶普遍適用于中性與弱酸性的環(huán)境，對于堿性環(huán)境適應(yīng)能力較差，而本研究所得到的木聚糖酶在堿性環(huán)境下仍有良好的耐受能力，具備進(jìn)一步開發(fā)利用的潛力。對木聚糖酶的異源表達(dá)與分子改造提高其酶活性以及穩(wěn)定性的研究，也是近年木聚糖酶的研究熱點(diǎn)之一[33?35]，后續(xù)研究將進(jìn)一步探究菌株的發(fā)酵條件與酶的異源表達(dá)研究，為菌株及木聚糖酶的工業(yè)化利用提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。