朱秋華，張 健，王麗衛(wèi)，董 浩，曾仙童，郭曉華，申照華，宋 鋼，張德福, ，張 明, ，勵建榮,

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 渤海大學(xué)海洋研究院, 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心, 遼寧錦州 121013；2.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190；3.山東美佳集團(tuán)有限公司, 山東日照 276800；4.錦州市龍海馨港科技有限公司, 遼寧錦州 121211；5.凌海市達(dá)蓮海珍品養(yǎng)殖有限責(zé)任公司, 遼寧錦州 121211）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是海洋環(huán)境中常見的一種嗜鹽性革蘭氏陰性菌，屬于弧菌科弧菌屬[1?2]。該菌主要分布在海域和河口地區(qū)，是水產(chǎn)動物的主要致病性弧菌之一。據(jù)報(bào)道，溶藻弧菌可感染蝦、牡蠣、貝類等，給全球水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，這種現(xiàn)象已經(jīng)阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展[3]。在水產(chǎn)領(lǐng)域傳統(tǒng)的殺菌消毒的方式是使用抗菌藥物和化學(xué)消毒劑，但長時間使用抗菌藥物會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致嚴(yán)重的病害，而且藥物殘留還會產(chǎn)生食品安全問題[4]。因此，尋找綠色、健康的生物防治劑抑制水產(chǎn)品養(yǎng)殖環(huán)境中的致病菌對保持水產(chǎn)品的健康及食品安全具有重要意義。

噬菌體（bacteriophage）是能感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱[5]。噬菌體存在于多種生態(tài)環(huán)境中，種類繁多，數(shù)量巨大，達(dá)到1031（約為細(xì)菌數(shù)量的 10 倍）[6?7]。20 世紀(jì)初，噬菌體由英國微生物學(xué)家Frederick Twort 和加拿大微生物學(xué)家 Felixd’Herelle 發(fā)現(xiàn)[8?9]。噬菌體在治療動物、植物中的細(xì)菌性疾病、水產(chǎn)動物體內(nèi)凈化等方面有獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢[10?11]，尤其是自國家提倡“無抗養(yǎng)殖”以來，噬菌體作為抗菌藥物的替代品重新引起人們的重視。噬菌體在污水方面的應(yīng)用有，它可對水體環(huán)境進(jìn)行消毒（如噬菌體PTCC1399和SBSWF27處理城市污水等），可作為傳感器監(jiān)測水體、用于治理活性污泥絲狀膨脹等[12]。因此，噬菌體可用于細(xì)菌性疾病的防控。

本研究從錦州市水產(chǎn)品市場、超市、農(nóng)貿(mào)市場、筆架山海域、葫蘆島市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場、鞍山市某養(yǎng)殖場等采集的約60份海產(chǎn)品及其養(yǎng)殖環(huán)境污水中分離獲得一株溶藻弧菌噬菌體Va2001，并且對其基本的生物學(xué)特征和應(yīng)用進(jìn)行了研究，為制備溶藻弧菌的新型清除劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品來源 錦州市水產(chǎn)市場、農(nóng)貿(mào)市場、筆架山海域、超市及葫蘆島某水產(chǎn)養(yǎng)殖場、鞍山某養(yǎng)殖場的海產(chǎn)品及其養(yǎng)殖的污水；硫酸鎂（MgSO4·7H2O） 天津博迪化工股份有限公司；氯化鈉 美國MP公司；Tris-HCl 北京索萊寶科技有限公司；明膠 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉、LB培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2216E液體培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；Φ0.45 μm、Φ0.22 μm針孔過濾器 天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

5417R小型臺式高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；GI54DS自動壓力蒸汽滅菌器 致微（廈門）儀器有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 將?80 ℃保存的溶藻弧菌在含3.5% NaCl（以下方法中所描述的LB液體培養(yǎng)基均含3.5% NaCl，不再贅述）固體LB平板上劃線接種，28 ℃培養(yǎng)10 h，挑取溶藻弧菌單菌落接種于10 mL的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下130 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。

1.2.2 樣品采集 采集60份海產(chǎn)品及其養(yǎng)殖環(huán)境污水，之后置于無菌采樣袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 噬菌體的分離純化 參考Gencay等[13]的方法進(jìn)行改進(jìn)。將采集的海產(chǎn)品加入適量生理鹽水勻漿后同污水樣品都進(jìn)行8000 r/min離心30 min，上清液經(jīng)0.45 μm過濾器過濾，收集濾液。取40 mL濾液，加入10 mL LB液體培養(yǎng)基，同時加入10 mL對數(shù)生長期的溶藻弧菌，在28 ℃條件下130 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。次日，培養(yǎng)物4 ℃ 8000 r/min離心10 min，取上清液用0.45 μm針頭過濾器過濾，收集濾液。將濾液 10 倍梯度稀釋至 10?1~10?8，取 500 μL各個樣品的梯度稀釋液和等體積的溶藻弧菌菌液混合，室溫靜置10 min。將上述混合液傾注雙層平板，平板凝固后28 ℃倒置培養(yǎng)8 h。挑取單個噬菌斑置于 1 mL SM緩沖液（1 g/L明膠，0.1 mol/L NaCl，8 mmol/L MgSO4，1 mol/L Tri-HCl（pH7.5））的離心管中，4 ℃放置8 h。此步驟重復(fù)培養(yǎng)3~5次，使噬菌斑的形態(tài)一致，得到噬菌體液備用。

1.2.4 噬菌體的電鏡觀察 參考文獻(xiàn)[14]，采用3%醋酸鈾負(fù)染色法對噬菌體進(jìn)行染色。首先對噬菌體增殖液進(jìn)行純化，分別取100 μL噬菌體液（效價1010PFU/mL）、3%醋酸鈾分別滴在盛有潔凈封口膜的玻璃皿中。將銅網(wǎng)浸沒在噬菌體液中，懸浮10 min，用濾紙緩慢吸干銅網(wǎng)上的水分。將銅網(wǎng)在3%的醋酸鈾染料中負(fù)染5 min，用濾紙吸走多余的液體，室溫下自然晾干。用JEM1200EX透射電子顯微鏡觀察噬菌體的形態(tài)。

1.2.5 噬菌體裂解譜的測定 裂解譜測定采用雙層平板的方法并加以改進(jìn)[15]。取200 μL溶藻弧菌菌液與4 mL約50 ℃的2216E半固體培養(yǎng)基混合均勻，傾倒在下層固體瓊脂培養(yǎng)基上。待上層半固體培養(yǎng)基凝固后，取100 μL噬菌體液均勻滴在平板上。待上層液體全部吸收后將雙層平板倒置在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，觀察平板上是否有噬菌斑產(chǎn)生。

1.2.6 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）測定 感染復(fù)數(shù)是指噬菌體和細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的比值。將噬菌體和溶藻弧菌按照 MOI=1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001、0.0000001、0.00000001比例分別加入10 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃條件下130 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。培養(yǎng)液8000 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm針孔過濾器過濾，參照Addy等[16]的方法用雙層平板法測定其效價。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)。

1.2.7 噬菌體的一步生長曲線 一步生長曲線的測定的指標(biāo)有三個分別是潛伏期（噬菌體吸附宿主細(xì)菌后釋放子代噬菌體的時間）、爆發(fā)期（噬菌體開始釋放至完全釋放子代噬菌體的時間）、裂解量（宿主細(xì)菌被感染后子代噬菌體的釋放的量）。參照Kabwe等[17]的方法，略加改進(jìn)。具體步驟如下：取1 mL活化的溶藻弧菌菌液，按MOI=0.0001加入噬菌體Va2001，28 ℃ 培養(yǎng)箱中孵育 10 min，8000 r/min離心10 min，棄上清，用2 mL LB液體培養(yǎng)基重懸沉淀，重復(fù)上述操作三次后，然后依次等量分裝至離心管中，28 ℃條件下130 r/min振蕩培養(yǎng)，此刻時間記為 T0=0，每隔 10 min 取培養(yǎng)液 200 μL，經(jīng) 0.22 μm針頭過濾器過濾后用雙層平板法測定其效價。使用Origin 9.0以感染時間為橫坐標(biāo)，噬菌體的效價為縱坐標(biāo)，繪制一步生長曲線，裂解量的計(jì)算按照如下公式進(jìn)行計(jì)算。

1.2.8 噬菌體的熱穩(wěn)定性 各取1 mL噬菌體液體（效價達(dá)1010PFU/mL）于無菌的Ep管中，分別放入4、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80 ℃ 的水浴鍋中，不同溫度下孵育1 h后，立即進(jìn)行冰浴，雙層平板法測定噬菌體的效價。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.9 噬菌體pH的穩(wěn)定性 用氫氧化鈉和鹽酸將10 mL LB液體培養(yǎng)基調(diào)pH1~13，分別加入1 mL噬菌體（效價達(dá)1010PFU/mL），28 ℃條件下孵育1 h，雙層平板法測定噬菌體效價。每組實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行三次重復(fù)。

1.2.10 溶藻弧菌噬菌體Va2001的初步應(yīng)用 參考Zhang和Ren[3,18]的方法略加修改。以牡蠣為感染模型測定噬菌體對溶藻弧菌的清除作用。購買海水精配制人工海水，海水精X的用量計(jì)算方法見下文公式。在裝有人工海水的水箱中充氣24 h以上進(jìn)行除氯，之后用臭氧（3 L/min）對人工海水進(jìn)行除菌。

式中：X為海水晶的用量；水體當(dāng)前的鹽度及水體重量均為已知。

將購買的活體牡蠣暫養(yǎng)24 h后挑100只牡蠣分為5個處理組，每組20只：第1組，空白對照組，保持暫養(yǎng)狀態(tài)，不添加人工污染細(xì)菌，不添加噬菌體；第2組，陽性對照組，人工污染細(xì)菌，不添加噬菌體，在人工海水中加入溶藻弧菌菌液至終濃度為1×106CFU/mL，第3~5組感染相同濃度的細(xì)菌；第3組，人工污染細(xì)菌/噬菌體處理組，MOI=1；第4組：人工污染細(xì)菌/噬菌體處理組，MOI=0.1；第5組：人工污染細(xì)菌/噬菌體處理組，MOI=0.01。

在設(shè)置組別的過程中，因?qū)嶋H的應(yīng)用過程中，噬菌體需要大量制備，最佳感染復(fù)數(shù)越低時，實(shí)驗(yàn)過程的濃度不易控制，為了避免數(shù)據(jù)有較大的誤差，選擇易于控制的MOI，且趨向于最佳感染復(fù)數(shù)值，研究不同的MOI對溶藻弧菌的控制的效果。每組設(shè)置三個平行組，每隔6 h觀察不同的感染復(fù)數(shù)對牡蠣的保護(hù)效果，記錄并統(tǒng)計(jì)牡蠣的成活率，計(jì)算如下。

式中：Y為牡蠣的成活率；牡蠣的累計(jì)死亡數(shù)量通過實(shí)驗(yàn)過程中統(tǒng)計(jì)的數(shù)量進(jìn)行計(jì)算。

每組每隔12 h取出三只牡蠣，將其去殼后，牡蠣肉的重量為（50±0.1）g，放置于無菌的均質(zhì)袋中，拍打均質(zhì)后，用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)牡蠣中的溶藻弧菌的數(shù)量，拍打均勻后的牡蠣肉混合液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，雙層平板法測定噬菌體的效價。每組每隔12 h取2 mL的人工海水于無菌的Ep管中，用以上相同的方法測定溶藻弧菌和噬菌體的數(shù)量。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置三次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理（利用Duncan檢驗(yàn)，以P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），用Origin 9.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的分離純化

如圖1所示，以實(shí)驗(yàn)室保存的溶藻弧菌為宿主菌，從錦州市水產(chǎn)市場、農(nóng)貿(mào)市場、筆架山海域、超市及葫蘆島某水產(chǎn)養(yǎng)殖場、鞍山某養(yǎng)殖場等地方采集的約60份海產(chǎn)品及其養(yǎng)殖環(huán)境污水中分離到一株溶藻弧菌噬菌體，命名為Va2001。挑取單個噬斑用雙層平板法，純化噬菌斑3~5次后，得到Va2001的噬菌斑圓形透明，形態(tài)大小基本保持一致，培養(yǎng)10 h后形成直徑約0.32 mm的噬菌體斑。

圖1 噬菌體Va2001的噬菌斑Fig.1 Bacteriophage plaques formation of Va2001

2.2 噬菌體的電鏡觀察

噬菌體Va2001經(jīng)過負(fù)染后，透射電鏡下噬菌體的形態(tài)如圖2。透射電鏡下噬菌體的照片顯示為有尾的，頭部形態(tài)為六邊形，直徑約(46±5)nm，尾部不可收縮，尾長約(17±2)nm，尾寬約(10±1)nm。按照噬菌體的形態(tài)學(xué)分類，推斷該噬菌體為有尾噬菌體目(Caudovirales)，自復(fù)制亞科中的短尾噬菌體科（Podoviridae）。

圖2 噬菌體Va2001的電鏡圖Fig.2 Transmission electron microscopy of Va2001

2.3 噬菌體裂解譜的測定

結(jié)合雙層平板法測定噬菌體Va2001的裂解譜，結(jié)果如表1所示，所有受試菌株中，噬菌體對16株溶藻弧菌表現(xiàn)出陽性噬菌斑，對副溶血性弧菌、坎式弧菌、輪狀弧菌等均表現(xiàn)為陰性。這表明，該株噬菌體僅能夠裂解種內(nèi)的不同分離源的溶藻弧菌，不能裂解其他分離源的弧菌。這表明本次實(shí)驗(yàn)分離的噬菌體Va2001對宿主菌有高度的專一性。

表1 噬菌體Va2001的裂解譜Table 1 Analysis of bacteriophage Va2001 host rang

2.4 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）測定

用不同滴度的噬菌體Va2001感染宿主菌，用雙層平板法測定培養(yǎng)后的噬菌體效價，最佳感染復(fù)數(shù)的結(jié)果如表2所示。該噬菌體Va2001的最佳MOI是0.0001。

表2 噬菌體Va2001最佳感染復(fù)數(shù)的測定Table 2 Optimal multiplicity of infection determination of bacteriophages Va2001

2.5 噬菌體的一步生長曲線

以最佳感染復(fù)數(shù)（MOI=0.0001）測定噬菌體Va2001的一步生長曲線，它的增殖規(guī)律大體呈現(xiàn)“S”型（圖3）。噬菌體Va2001的潛伏期約是20 min，爆發(fā)期約是100 min，裂解量274 PFU/cell，一個裂解周期大約是120 min。

圖3 噬菌體Va2001的一步生長曲線Fig.3 One-step growth curve of bacteriophages Va2001

2.6 噬菌體的熱穩(wěn)定性

噬菌體Va2001的熱穩(wěn)定性顯示（圖4），噬菌體Va2001的活性在4~35 ℃較穩(wěn)定，效價為1010PFU/mL，在40~60 ℃時，噬菌體效價下降約1 lg PFU/mL；但噬菌體滴度達(dá)109PFU/mL，70 ℃處理后，噬菌體仍有一定的活性，但80 ℃處理后噬菌體全部失活。

圖4 溫度對噬菌體Va2001效價的影響Fig.4 Effect of temperature on bacteriophage Va2001 viability

2.7 噬菌體的pH穩(wěn)定性

噬菌體Va2001在不同pH條件下的穩(wěn)定性（圖5）表明，在 4 ≤pH≤ 9范圍，噬菌體 Va2001效價在108PFU/mL以上；在pH10和pH11條件下，噬菌體 Va2001效價略有下降。但是，當(dāng)pH≤2和pH≥13，噬菌體Va2001喪失活性。

圖5 pH對噬菌體Va2001效價的影響Fig.5 Effect of pH on bacteriophage Va2001 viability

2.8 噬菌體對牡蠣中溶藻弧菌的凈化

應(yīng)用牡蠣感染模型評價噬菌體Va2001對溶藻弧菌的清除效果，結(jié)果如下圖所示。圖6是不同的感染復(fù)數(shù)對牡蠣的保護(hù)效果，不同濃度的噬菌體對其保護(hù)效果不同。與對照組相比，隨著養(yǎng)殖時間的延長，實(shí)驗(yàn)組（MOI=1、MOI=0.1、MOI=0.01）中牡蠣的成活率不斷降低；感染復(fù)數(shù)越高，牡蠣的死亡率減少的快，但長時間作用后，低濃度組更能顯著(P<0.05)減少牡蠣的死亡。在第3 d時牡蠣的成活率均能接近85%；第4 d開始，成活率低于80%以下；在第10 d時，牡蠣的成活率在10%以下，說明在牡蠣在可控制的因素范圍內(nèi)，以牡蠣為感染模型應(yīng)用于小型實(shí)驗(yàn)中是可行的。

圖6 噬菌體Va2001不同的感染復(fù)數(shù)對牡蠣的保護(hù)效果Fig.6 Cumulative mortality of oysters at different V.alginolyticus bacteriophage Va2001 concentrations

圖7（a）是養(yǎng)殖環(huán)境中溶藻弧菌數(shù)量的變化，與單獨(dú)添加溶藻弧菌的處理組相比，在人工污染細(xì)菌/噬菌體處理組中溶藻弧菌的數(shù)量降低。當(dāng)時間延長至 48 h，實(shí)驗(yàn)處理組（MOI=1、MOI=0.1、MOI=0.01）中的溶藻弧菌的數(shù)量顯著(P<0.05)降低；到72 h時，MOI=0.1和MOI=0.01組中溶藻弧菌的數(shù)量約降低1×102CFU/mL。圖7（b）中牡蠣體內(nèi)溶藻弧菌數(shù)量的變化趨勢與養(yǎng)殖環(huán)境中的一致。結(jié)果表明，高濃度的噬菌體Va2001處理組與低濃度組相比，前者比后者的溶藻弧菌的數(shù)量顯著(P<0.05)降低，當(dāng)延長培養(yǎng)時間至72 h，噬菌體Va2001低濃度處理組中溶藻弧菌的數(shù)量約下降2個數(shù)量級。說明噬菌體Va2001能夠清除牡蠣體內(nèi)的溶藻弧菌；與高濃度處理組相比，低濃度組所需的噬菌體用量較少，更經(jīng)濟(jì)。

圖7 牡蠣感染模型中噬菌體Va2001應(yīng)用后溶藻弧菌數(shù)量的變化Fig.7 Number change of V.alginolyticus in oyster infection model by using bacteriophage Va2001

圖8（a）是養(yǎng)殖環(huán)境中噬菌體Va2001數(shù)量的變化，結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，噬菌體Va2001的數(shù)量上升。實(shí)驗(yàn)組（MOI=1、MOI=0.1、MOI=0.01）中噬菌體數(shù)量明顯升高；當(dāng)作用72 h，噬菌體數(shù)量約提高1×102PFU/mL。圖8（b）是牡蠣體內(nèi)噬菌體數(shù)量的變化，其變化趨勢與環(huán)境中的基本保持一致。當(dāng)培養(yǎng)時間延長，噬菌體的數(shù)量呈現(xiàn)上升的趨勢，這是因?yàn)樵陴B(yǎng)殖環(huán)境中宿主菌被噬菌體侵染，釋放了子代噬菌體；在流體環(huán)境中能加速噬菌體的擴(kuò)散的能力，若牡蠣在試驗(yàn)過程是活著的狀態(tài)，每隔一定的時間，殼處于伸張閉合狀態(tài)，另一方面，在取樣期間，用蠔刀去殼時很吃力，這能夠表明牡蠣是活著的狀態(tài)，從而噬菌體能夠清除牡蠣體內(nèi)的溶藻弧菌，因此，以上現(xiàn)象說明噬菌體數(shù)量的升高是由于裂解養(yǎng)殖環(huán)境中溶藻弧菌的緣故，同時也證明在取樣期間，牡蠣處于存活的狀態(tài)。

圖8 噬菌體Va2001應(yīng)用在牡蠣感染模型中噬菌體數(shù)量的變化Fig.8 Number change of bacteriophages in oyster infection model by using bacteriophage Va2001

3 討論與結(jié)論

噬菌體廣泛分布在海水、污水、土壤中，是生態(tài)系統(tǒng)中最豐富的生物[6?7,19?20]。因此，噬菌體可以從環(huán)境樣本中分離得到，如溶藻弧菌噬菌體、副溶血性弧菌噬菌體、嗜水氣單胞菌噬菌體、柱狀黃桿菌噬菌體、銅綠假單胞菌噬菌體等[18,21?26]。

按照噬菌體形態(tài)學(xué)的分類，目前文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道溶藻弧菌噬菌體的形態(tài)有多種，其中包括肌尾噬菌體科（Myoviridae）[14,27]、短尾噬菌體科（Podoviridae）[28]，本研究中分離到的溶藻弧菌噬菌體Va2001屬于有尾噬菌體目，短尾噬菌體科。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，以相同細(xì)菌為宿主，在不同地點(diǎn)分離的噬菌體的生物學(xué)特征可能是不同的[29?30]。本研究中的裂解譜結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)過程中分離到的噬菌體Va2001的裂解譜范圍較窄，但其能對宿主菌形成透亮的噬菌體斑，說明它具有高度的特異性。但是可以通過其他的方式如基因編輯、雞尾酒療法等方式解決噬菌體的裂解譜窄的問題，本文中的噬菌體有待于用其他的方法拓寬裂解譜，來殺滅其他的細(xì)菌[6,31?33]。本研究中利用噬菌體Va2001對宿主菌的特異性，為其在致病菌的檢測方面奠定理論基礎(chǔ)。

測定最佳感染復(fù)數(shù)可以指導(dǎo)噬菌體制劑等方面的研究。不同噬菌體的感染復(fù)數(shù)是不相同的。Kalatzis等[34]分離的溶藻弧菌噬菌體 phiSt2和phiGrn1的最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）分別是 10、100；Lin等[1]報(bào)道的噬菌體ФA318最佳感染復(fù)數(shù)為0.1，本研究中的噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）是0.0001，相比較而言，本實(shí)驗(yàn)中的噬菌體Va2001有較強(qiáng)的裂解能力。因此在實(shí)際應(yīng)用中所需的用量更少；同時，一步生長曲線測定結(jié)果顯示潛伏期約是20 min，裂解期約是100 min，裂解量274 PFU/cell，說明噬菌體Va2001的裂解效率高，可降低制備噬菌體制劑的生產(chǎn)成本。

在測定噬菌體Va2001溫度敏感性過程中，噬菌體的效價在70 ℃驟降，溫度高于80 ℃，噬菌體失活，與Constantina等[35]研究的噬菌體VEN 的結(jié)果一致。這一結(jié)果說明溫度過高，可能會使噬菌體的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而造成噬菌體的裂解性能降低。噬菌體Va2001在pH4~9范圍內(nèi)，穩(wěn)定性高；在pH12時，噬菌體有一定的活性；在pH≤2和pH≥13，噬菌體失活，表明在強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿的環(huán)境中不能存活，這與Kim等[15]研究噬菌體pVa-21結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)中分析噬菌體對溫度和pH的耐受性，可以為噬菌體制劑的生產(chǎn)及應(yīng)用提供指導(dǎo)作用。用噬菌體凈化牡蠣體內(nèi)的溶藻弧菌結(jié)果顯示：不同的感染復(fù)數(shù)對牡蠣的保護(hù)效果是有差異性的，并且其在裂解人工海水中的溶藻弧菌的同時也能夠清除牡蠣體內(nèi)的溶藻弧菌，為海產(chǎn)品中溶藻弧菌的清除劑的開發(fā)提供依據(jù)。