莊嬋芝, 潘志雄, 何素麗, 陳 翔, 謝澤娟, 陳嘉迪, 何文貞

(1. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院, 廣東 汕頭, 515041; 2. 廣東省汕頭潮南民生醫(yī)院, 廣東 汕頭, 515144)

癲癇是神經(jīng)元異常放電導(dǎo)致大腦功能短暫性失常的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。60%～70%癲癇患者可采用傳統(tǒng)抗癲癇藥物有效控制病情，但仍有20%～30%癲癇患者治療無效而發(fā)展為難治性癲癇[2]。相關(guān)研究[3]指出, 60%～70%癲癇患者存在明顯的認(rèn)知功能障礙(CD)。陳波[4]報(bào)道，神經(jīng)調(diào)節(jié)是癲癇發(fā)生的病理基礎(chǔ)。microRNA-221-3p (miR-221-3p)可影響神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)元的功能。LANG Y等[5]研究發(fā)現(xiàn), miR-221-3p可通過調(diào)控NPTX2導(dǎo)致帕金森病患者多巴胺神經(jīng)元的細(xì)胞活力降低。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG1)是信號(hào)蛋白，可調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞和其他細(xì)胞之間的聯(lián)系。楊振棟等[6]發(fā)現(xiàn), NRG1高表達(dá)對(duì)小鼠聽皮層神經(jīng)元具有保護(hù)作用。本研究探討了血清miR-221-3p、NRG1表達(dá)與難治性癲癇患者CD的相關(guān)性，以期為難治性癲癇合并CD患者的臨床評(píng)估提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2021年1月汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的64例難治性癲癇患者(難治性癲癇組)和58例抗癲癇藥物控制良好患者(藥物控制良好組)作為研究對(duì)象。難治性癲癇組男34例，女30例; 年齡30～70歲，平均(48.22±11.30)歲。藥物控制良好組男31例，女27例; 年齡30～70歲，平均(48.61±11.24)歲。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 符合國際抗癲癇聯(lián)盟關(guān)于癲癇的分類及診斷標(biāo)準(zhǔn)者[7]; ② 經(jīng)臨床表現(xiàn)、腦電圖檢查及神經(jīng)影像學(xué)檢查確診癲癇者; ③無語言表達(dá)功能障礙、意識(shí)障礙者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 有癲癇疾病家族遺傳史者; ② 合并除癲癇外的其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病及代謝性疾病者; ③合并肝、腎嚴(yán)重功能不全者; ④ 抑郁癥、焦慮癥、精神分裂癥等精神障礙所致CD者。另選取同期健康體檢者70例納入對(duì)照組，男36例，女34例，年齡30～70歲，平均(48.25±11.09)歲。3組受試者的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，且所有受試者對(duì)研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集: 體檢者于體檢當(dāng)天，難治性癲癇組和藥物控制良好組患者于入院當(dāng)天采集靜脈血3～4 mL, 離心，留上清液置于采血管中，存放于-80 ℃冰箱，待測(cè)。

1.2.2 血清miR-221-3p水平檢測(cè): 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清miR-221-3p水平。解凍血清樣本，依據(jù)RNA提取試劑盒(日本Takara公司)說明書提取總RNA，應(yīng)用NanoDropND-1000分光光度儀(NanoDrop Tech, 美國)檢測(cè)RNA濃度。遵照TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit(美國ThermoFisher公司)指導(dǎo)書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。應(yīng)用StepOne TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)對(duì)miR-221-3p及內(nèi)參基因U6進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。miR-221-3p、U6引物由上海生工合成。miR-221-3p正向引物為5′-GCTAGCGCTCGATGTCGAAATGTACTG-3′, 反向引物為5′-TACCTGTGGCGCAACGTGTACGCAT-3′; U6正向引物為5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′, 反向引物為5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min, 95 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 38個(gè)循環(huán)。miR-221-3p相對(duì)表達(dá)量(以U6為內(nèi)參基因)采用2-ΔΔCT法計(jì)算。

1.2.3 血清NRG1水平檢測(cè): 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)血清NRG1水平，按照NRG1 ELISA試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司)說明書指示進(jìn)行操作。

1.2.4 認(rèn)知功能評(píng)定: 采用蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(MoCA)評(píng)價(jià)認(rèn)知功能，包括空間與執(zhí)行能力、語言、記憶力、注意與集中、命名、抽象思維、計(jì)算力與定向7個(gè)方面，若受教育年限≤12年加1分，總分30分。分值越低，表示CD越嚴(yán)重。MoCA總分<26分，判為CD; MoCA總分為26～30分，判為非CD[8]。將難治性癲癇患者依據(jù)MoCA總分結(jié)果分為CD組40例和非CD組24例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 3組血清NRG1、miR-221-3p水平比較

難治性癲癇組血清miR-221-3p、NRG1水平高于對(duì)照組、藥物控制良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組血清NRG1、miR-221-3p水平比較

2.2 CD組與非CD組血清NRG1、miR-221-3p水平比較

CD組血清miR-221-3p、NRG1水平高于非CD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 CD組與非CD組血清NRG1、miR-221-3p水平比較

2.3 CD組與非CD組MoCA評(píng)分比較

CD組MoCA總分以及空間與執(zhí)行能力、語言、延遲記憶、計(jì)算力與定向評(píng)分均低于非CD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 CD組與非CD組MoCA評(píng)分比較 分

2.4 難治性癲癇CD患者血清NRG1、miR-221-3p水平與MoCA總分的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，難治性癲癇CD患者血清miR-221-3p水平與MoCA總分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.636,P<0.05), 血清NRG1水平與MoCA總分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.511,P<0.05)。見圖1、2。

圖1 血清miR-221-3p與MoCA總分的相關(guān)性分析圖

圖2 血清NRG1與MoCA總分的相關(guān)性分析圖

2.5 難治性癲癇患者發(fā)生CD的影響因素分析

依據(jù)miR-221-3p均值3.29, 賦值<3.29=0, ≥3.29=1; 依據(jù)NRG1均值21.39 pg/mL, 賦值≥21.39 pg/mL=0, <21.39 pg/mL=1; 依據(jù)MoCA總分均值20.20分，賦值≥20.20分=0, <20.20分=1。以難治性癲癇患者是否發(fā)生CD為因變量(發(fā)生=1, 未發(fā)生=0), 將賦值后的自變量NRG1、miR-221-3p、MoCA評(píng)分納入Logistic回歸分析。分析結(jié)果顯示, NRG1、miR-221-3p均是難治性癲癇患者發(fā)生CD的影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 難治性癲癇患者發(fā)生CD影響因素的Logistic回歸分析

3 討 論

癲癇是神經(jīng)科常見的慢性疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。CD是難治性癲癇患者常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)生機(jī)制目前尚未明確，可能與以下因素有關(guān): ① 神經(jīng)生長因子及炎癥因子表達(dá)異常和神經(jīng)細(xì)胞凋亡異常，導(dǎo)致神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變; ② 谷氨酸、多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常[9]。

miRNA是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，可通過調(diào)控靶基因表達(dá)而調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的狀態(tài)及細(xì)胞增殖與分化[10]。miR-221-3p位于X染色體p11.3區(qū)域，可通過調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞而參與血管生成及腫瘤發(fā)生[11]。范迎春等[12]研究發(fā)現(xiàn), miR-221-3p通過調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮功能而參與冠狀動(dòng)脈病變的發(fā)生、發(fā)展。此外, miR-221-3p還可參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)疾病。范崇桂等[13]研究發(fā)現(xiàn), miR-221-3p水平下調(diào)可導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率降低。QUERO L等[14]報(bào)道，與健康體檢者相比，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清miR-221-3p水平升高，且高水平miR-221-3p驅(qū)動(dòng)M2型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為M1型巨噬細(xì)胞，促進(jìn)機(jī)體炎癥。本研究中，難治性癲癇組血清miR-221-3p水平顯著高于藥物控制良好組與對(duì)照組, CD組血清miR-221-3p水平顯著高于非CD組，提示miR-221-3p可能影響難治性癲癇患者的認(rèn)知功能。ZHANG K等[15]研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者上皮細(xì)胞中miR-221-3p過表達(dá)可抑制CXC趨化因子配體17(CXCL17)表達(dá)，加劇氣道嗜酸性粒細(xì)胞的炎癥。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)難治性癲癇伴CD患者血清中miR-221-3p與MoCA總分呈負(fù)相關(guān)，提示miR-221-3p可能參與難治性癲癇患者認(rèn)知功能障礙發(fā)生。

NRG1屬于表皮生長因子家族，是一種可調(diào)節(jié)生長及分化的神經(jīng)生長因子，主要由上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及心肌細(xì)胞分泌，可調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)細(xì)胞突觸的強(qiáng)度和穩(wěn)定性，與認(rèn)知功能密切相關(guān)[16]。NRG1可與其受體酪氨酸激酶(ErbB)結(jié)合形成NRG1-ErbB信號(hào)通路，參與神經(jīng)的發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)受體的表達(dá)以及突觸可塑性的形成[17]。YOO J Y等[18]發(fā)現(xiàn)，高水平NRG1可顯著減輕氧葡萄糖剝奪海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞具有保護(hù)作用。HEI Y等[19]發(fā)現(xiàn)，高水平NRG1可減少大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，提高大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力，改善大鼠認(rèn)知功能。癲癇發(fā)生后，早期血腦屏障通透性增強(qiáng)，會(huì)促進(jìn)腦部炎癥反應(yīng)，加重癲癇病情，導(dǎo)致難治性癲癇發(fā)生及發(fā)展。高水平NRG1可減輕促炎介質(zhì)白細(xì)胞介素-1β引起的腦部微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增強(qiáng)，還可減輕腦部炎癥反應(yīng)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，難治性癲癇組血清NRG1水平顯著高于藥物控制良好組與對(duì)照組, CD組血清NRG1水平顯著高于非CD組, CD組患者血清NRG1與MoCA總分呈負(fù)相關(guān)，且NRG1為難治性癲癇患者發(fā)生CD的影響因素，提示NRG1可能影響難治性癲癇患者的CD過程。本研究中難治性癲癇CD患者血清NRG1水平升高的可能原因如下: 難治性癲癇CD患者機(jī)體發(fā)生應(yīng)激性調(diào)節(jié)，使得血清NRG1水平應(yīng)激性升高，雖然高水平NRG1對(duì)腦微血管具有正向作用，能一定程度減輕患者的認(rèn)知功能損傷，但這并不足以改變難治性癲癇患者的病情進(jìn)展及CD患者的認(rèn)知功能損傷過程。

綜上所述，難治性癲癇合并CD患者血清miR-221-3p、NRG1均呈高表達(dá)，且miR-221-3p、NRG1均與難治性癲癇合并CD患者的MoCA總分密切相關(guān)。檢測(cè)血清miR-221-3p、NRG1水平有助于臨床評(píng)估難治性癲癇患者的認(rèn)知功能，以便給予合適治療。但miR-221-3p和NRG1影響難治性癲癇患者發(fā)生CD的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚未闡明，后續(xù)還需進(jìn)一步深入探討。