陳 旭，申 穎，趙海霞，郭文奇

1內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院近視眼激光治療中心，內蒙古 呼和浩特 010059；2第二附屬醫(yī)院急診科，內蒙古 呼和浩特 010091

抗青光眼濾過術后，結膜和結膜下組織的切口誘導了中性粒細胞、巨噬細胞等促炎性因子局部浸潤、激活成纖維細胞大量增殖并促進彈性蛋白、膠原蛋白等加速合成，導致濾過道瘢痕化，手術失?。?］。纖維化過程由各類細胞因子如轉化生長因子-β（TGF-β）、TNF-α（腫瘤壞死因子-α）、ⅤEGF（血管內皮生長因子）等共同參與完成［2］。TGF-β是參與纖維化進程的關鍵控制因子，在抗青光眼濾過術中可使小梁網(wǎng)（TM）皺縮、細胞外基質（ECM）沉積，并增加膠原蛋白、生長因子的表達［3］。纖維化過程中主要由細胞因子TGF-β及其下游的Smad蛋白共同參與調控目的基因的表達TGF-β/Smad 途徑［4］。TGF-β在組織損傷修復過程中占主導地位，濾過性手術后眼組織促進成纖維細胞增殖活化并大量分泌生長因子會導致術后效果不理想［5］。目前尋找抗青光眼濾過術后抑制濾過道瘢痕化的藥物對提高手術成功率尤為重要。吡非尼酮（PFD）是一種廣譜抗纖維化藥物，具有抗炎作用并可以通過多種途徑抑制纖維化進程，包括抑制TGF-β、白介素-1β相關信號通路，調節(jié)脂質代謝途徑并減少α-SMA、膠原蛋白和纖連蛋白的表達［6］，從而減輕炎癥反應，抑制成纖維細胞增殖以及ECM沉積［7］。有研究表明PFD可抑制TGF-β/Smad通路上膠原和細胞外基質的表達并抑制成纖維細胞增殖能力［8］。

吡非尼酮可降低血管通透性、減少炎癥因子表達產(chǎn)生抗炎作用。作為一種小分子藥物，它能抑制膠原合成，下調多種細胞因子的產(chǎn)生。吡非尼酮在眼科相關的纖維增生性疾病的應用，可抑制炎性因子遷移、細胞過度增殖，改善角膜、結膜、晶狀體等眼部組織的纖維化進程［9］。吡非尼酮治療眼部纖維增生性疾病的主要機制：涉及抗纖維化、抗炎、抗氧化和抗膠原合成等多個方面［10］。通過調節(jié)各促纖維化通路介質，降低TGF-β、TNF-α、ROS（活性氧）和CollagenⅠ等因子的表達能力，防止或消除組織過度纖維化沉積［11］。本實驗選用PFD進行青光眼濾過術后抗瘢痕化的研究，通過抑制細胞信號通路TGF-β/Smad的表達情況及纖維蛋白的過分增殖，改善抗青光眼濾過術后濾過道的纖維化程度。本實驗在分子生物學方面為PFD在臨床眼科增殖性疾病的應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 RYTF的原代培養(yǎng)

兔眼Tenons囊組織選材取自健康無眼疾青紫藍兔2只（由內蒙古醫(yī)科大學動物研究中心提供，普通級，批號20200083/20200084，具有實驗合格證書），體質量為2.0～2.5 kg，月齡8～12周，常規(guī)飼養(yǎng)。無菌條件下取兔眼Tenons囊組織，在顯微鏡下盡量清除結膜上皮組織，充分浸洗在含青-鏈霉素的PBS液中，無菌顯微組織剪剪碎組織塊，向培養(yǎng)皿中加入10 mL完全培養(yǎng)液，吸出含小組織塊和細胞成分的培養(yǎng)液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱。24 h后見細胞逐漸貼壁生長。

1.2 RYTF的免疫組化鑒定

取對數(shù)期生長細胞重懸，將細胞接種于無菌24孔板，4%多聚甲醛4 ℃預冷將細胞固定20 min。每孔加300 μL過氧化物酶阻斷液（試劑A），室溫孵育10 min，。封閉30 min，加入一抗，二抗孵育。每孔加SABC 300 μL，37 ℃，30 min。每孔加DAB顯色液（試劑B）300 μL，20 min。蘇木素復染，1 min；PBS液洗3次，每次5 min，光學顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3 CCΚ-8 法檢測

取對數(shù)期生長細胞重懸后計數(shù)，重懸至細胞密度約5×103/孔，以后實驗均取此細胞密度。均勻接種于無菌96孔板中，在周邊孔中各加入100 μL PBS，分為A-H共7組，每組至少3個復孔。I組為對照組（為細胞和培養(yǎng)液），H組為調零組（為基礎培養(yǎng)液）；B-G組（為細胞和不同濃度的吡非尼酮溶液），濃度分別為0.01、0.1、0.2、0.3、0.5、1 mg/mL，藥物作用24 h后，吸棄孔內液體，分別加入CCΚ-8溶液100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內2 h后，檢測490 nm 波長下酶聯(lián)免疫檢測儀的每孔吸光度A490nm值。如此重復實驗至少5次，綜合各組實驗數(shù)據(jù)表明吡非尼酮抑制RYTF 增殖的起始作用濃度為0.1 mg/mL，吡非尼酮抑制RYTF增殖的最大無毒濃度為0.27 mg/mL。取各組吸光度均值并計算相應的抑制率：抑制率=（對照組-實驗組）/（對照組-調零組）×100%；存活率=1-抑制率。

1.4 免疫熒光法檢測起始作用濃度及最大無毒濃度吡非尼酮作用后TGF-β3、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達情況

取對數(shù)生長期細胞，重懸后將細胞接種于無菌96孔板，待其貼壁生長后加入不同濃度吡非尼酮（0.1、0.27 mg/mL），以未加藥孔作為對照組，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，在藥物作用24 h 后固定，通透，封閉。加入TGF-β3（1∶200）、CollagenⅠ（1∶200）、Collagen Ⅲ（1∶200）一抗稀釋液100 μL/孔，4 ℃過夜。加入熒光二抗（1∶300，避光）100 μL/孔，37 ℃條件下孵育30 min。DAPI染核5 min，避光條件下用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.5 蛋白印跡法檢測不同濃度吡非尼酮作用后TGF-β3、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表達變化情況

取對數(shù)期生長的細胞，重懸后將細胞接種于6孔板，對照組不加藥，實驗組分別加入不同濃度吡非尼酮溶液（0.1、0.27 mg/mL）作用24 h。提取可溶性蛋白，吸取可溶性蛋白上清液置于離心管。調整各組蛋白濃度一致，按上樣量20 μg/孔取蛋白溶液，按1∶4比例將5×蛋白上樣Buffer與樣品混合置于離心管中蓋緊，沸水浴加熱10 min。SDS-PAGE電泳：配置10%分離膠：體積共15 mL（兩塊），配置5%濃縮膠：體積共6 mL（兩塊）加電泳緩沖液，將蛋白樣品加入加樣孔底部。120 Ⅴ恒壓電泳后，全濕電轉移后加入一抗TGF-β3、CollagenⅠ、Ⅲ（1∶1000），4 ℃過夜；TBST洗膜3次。加入抗生物素二抗（1∶1000）置于搖床，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次。避光條件下，滴加顯影液和定影液在PⅤDF膜上，曝光、顯影并拍照記錄，GAPDH一抗（1∶5000）孵育，余同前。

1.6 RT-PCR 檢測不同濃度吡非尼酮作用后TGF-β3、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達情況

取對數(shù)期生長細胞，對照組不加藥，實驗組加入不同濃度吡非尼酮溶液（0.1、0.27 mg/mL），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱作用24 h。提取總RNA，檢測RNA樣品的質量、濃度及其完整性，再將各組RNA濃度調整至基本一致。逆轉錄反應：根據(jù)試劑盒說明書步驟操作，用移液槍輕微混勻樣品并短暫離心，置于冰上。配置PCR反應液，采用兩步法設定反應條件，TGF-β3、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ及內參的引物序列（表1）進行PCR反應，通過儀器配套軟件記錄各目的基因以及內參基因的Ct值，將各目的基因與內參基因相比較，利用2-△△Ct值，并進行半定量分析。

表1 PCR反應TGF-β3、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ及內參的引物及序列Tab.1 Primers used for RT-PCR of TGF-β3,collagen I and collagen III

1.7 統(tǒng)計學方法

結果采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，利用方差分析法分析結果，方差齊時采用LSD法進行多重比較，方差不齊采用Welch檢驗，將多個處理組與對照組相比時用DunnettT法，統(tǒng)計結果均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RYTF的體外培養(yǎng)

取兔眼Tenons囊組織塊體外培養(yǎng)，細胞呈梭形貼壁生長，胞核飽滿，細胞匯合度良好，生長走行呈羽毛狀或渦旋狀排列具有方向性（圖1）。

圖1 顯微鏡下體外培養(yǎng)RYTFFig.1 Morphology of cultured rabbit tenon fibroblasts(RTFs)showing adherent cell growth (A) and tightly connected monolayer of the cells (B) (Original magnification:×100).

2.2 RYTF免疫組化鑒定結果

RYTF波形蛋白染色呈陽性，細胞漿染呈棕黃色，細胞核染呈藍色。對照組細胞核和細胞漿均染呈藍色（圖2）；RYTF的角蛋白染色呈陰性，細胞核和細胞漿均染呈藍色（圖3）。

圖3 RYTF角蛋白染色結果Fig.3 Keratin staining results of the RTFs(×100).A:Negative staining for keratin in RTFs,which is the same as the control cells.B:Blue staining in the nuclei and cytoplasm of the RTFs.

2.3 CCΚ-8法檢測不同濃度吡非尼酮對RYTF增殖的抑制作用

重復CCΚ-8實驗法5次，檢測不同濃度吡非尼酮（0.01、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mg/mL）作用24 h后，RYTF的吸光度A值（表2）。

表2 不同濃度吡非尼酮作用RYTF 24 h后吸光度變化及抑制率Tab.2 Absorbance change and inhibition rate of RTFs treated with pirfenidone at different concentrations for 24 h

2.4 吡非尼酮抑制TGF-β3、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ表達的免疫熒光結果

利用免疫熒光法檢測起始及最適作用濃度吡非尼酮（0.1、0.27 mg/mL）作用于RYTF 24 h 后，各實驗組TGF-β3、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ的熒光表達量與對照組相比較均明顯減少（圖4）。

圖4 不同濃度吡非尼酮作用于RYTF 后TGF-β3因子的表達變化Fig.4 Expression changes of TGF-β3 in RTFs after treatment with different concentrations of pirfenidone (Immunofluorescence staining,×200).A1:Control group stained by FITC.A2:Control group stained by DAPI.A3:Merged images of A1 and A2.B1:RTFs treated with 0.1 mg/mL pirfenidone and stained by FITC.B2:RTFs treated with 0.1 mg/mL pirfenidone and stained by DAPI.B3:Merged image of B1 and B2.C1:RTFs treated with 0.27 mg/mL pirfenidone and stained by FITC.C2:RTFs treated with 0.27 mg/mL pirfenidone and stained by DAPI.C3:Merged image of C1 and C2.

圖5 不同濃度吡非尼酮作用于RYTF 后Collagen Ⅰ因子的表達變化Fig.5 Expression changes of collagen I in RTFs after treatment with different concentrations of pirfenidone (×200).A1:Control group stained by FITC.A2:Control group stained by DAPI.A3:Merged image of A1 and A2.B1:RTFs treated with 0.1 mg/mL pirfenidone and stained by FITC.B2:RTFs treated with 0.1 mg/mL pirfenidone and stained by DAPI.B3:Merged image of B1 and B2.C1:RTFs treated with 0.27 mg/mL pirfenidone and stained by FITC.C2:RTFs treated with 0.27 mg/mL pirfenidone and stained by DAPI.C3:Merged image of C1 and C2.

圖6 不同濃度吡非尼酮作用于RYTF后Collagen Ⅲ因子的表達變化Fig.6 Expression changes of Collagen III factor after different concentrations of pirfenidone are treat with RYTF(×200).A1:Control group stained by FITC.A2:Control group stained by DAPI.A3:Merged image of A1 and A2.B1:RTFs treated with 0.1 mg/mL pirfenidone and stained by FITC.B2:RTFs treated with 0.1 mg/mL pirfenidone and stained by DAPI.B3:Merged image of B1 and B2.C1:RTFs treated with 0.27 mg/mL pirfenidone and stained by FITC.C2:RTFs treated with 0.27 mg/mL pirfenidone and stained by DAPI.C3:Merged image of C1 and C2.

2.5 吡非尼酮抑制TGF-β3、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白表達的結果

利用Western blot法檢測起始及最適作用濃度吡非尼酮（0.1、0.27 mg/mL）作用于RYTF 24 h后，各實驗組TGF-β3、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表達量與對照組相比較均明顯減少（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義（圖7）。

圖7 不同濃度吡非尼酮作用于RYTF 24 h后TGF-β3、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ因子的蛋白表達情況Fig.7 Protein expressions of TGF-β3,collagen I and collagen III in RTFs treated with pirfenidone at different concentrations for 24 h.A:Western blots of the proteins.1:Control group;2:RTFs treated with 0.1 mg/mL pirfenidone;3:RTFs treated with 0.27 mg/mL pirfenidone.B-D:Quantitative analysis of the expression levels of TGF-β3(B),collagen I(C)and collagen III(D)compared with the control group.*P＜0.05,**P＜0.01.

2.6 吡非尼酮對TGF-β3、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ基因表達的影響

利用RT-PCR法檢測起始及最適作用濃度吡非尼酮（0.1、0.27 mg/mL）作用于RYTF 24 h 后，各實驗組TGF-β3、CollagenⅠ和CollagenⅢ的mRNA相對表達量與對照組相比較均明顯減少（圖8）。

圖8 不同濃度吡非尼酮（0.1、0.27 mg/mL）作用于RYTF 24 h后，TGF-β3、Collagen Ⅰ和Collagen ⅢmRNA相對表達量的半定量分析圖Fig.8 Semi-quantitative analysis of mRNA expression levels of TGF-β3,collagen I and collagen III in RTFs treated with pirfenidone at 0.1 and 0.27 mg/mLfor 24 h.*P＜0.05,**P＜0.01.

3 討論

非生理性的瘢痕形成過程，是由各種原因引起的組織損傷愈合后的病理性變化，其基質為結締組織，主要成分為膠原纖維，表層為淺薄的瘢痕上皮結構，與成纖維細胞和ECM大量沉積有關，也是大多數(shù)炎癥性疾病的特征性病理改變，這一過程可以發(fā)生于體內多種器官［12］。成纖維細胞過度增殖是導致青光眼濾過術后濾過區(qū)瘢痕化影響手術效果的主因。TGF-β作為參與纖維化過程調控的重要因子，其介導的TGF-β/Smad信號通路有望在眼組織抗纖維化進程中發(fā)揮效能［13］。膠原蛋白在傷口愈合的各個階段都是關鍵性成分，創(chuàng)傷發(fā)生后，暴露的膠原與血液接觸，促進血小板聚集，活化與創(chuàng)傷相關的趨化因子，而后膠原成為傷口內細胞外基質的基本成分，進入傷區(qū)的成纖維細胞合成并分泌CollagenⅠ、CollagenⅢ，構成傷口內基質［14］。所以阻斷膠原蛋白的產(chǎn)生及傳導通路有望抑制過分纖維化導致瘢痕形成。

持續(xù)的TGF-β過表達可引起纖連蛋白沉積于抗青光眼術后濾過道以及CollagenⅠ、Collagen Ⅲ增多，導致濾過道纖維化手術失敗。在兔眼抗青光眼手術中，TGF-β可促使成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞并引起手術部位結膜下纖維化［15］。PFD發(fā)揮作用的機制在于抑制TGF-β誘導的細胞轉分化過程以及細胞遷移、增殖和收縮能力［16］。在TGF-β家族中TGF-β3因子在各種纖維化疾病中均參與表達，是參與纖維化過程的關鍵因子，是參與調控修復創(chuàng)傷瘢痕化的主導因素［17］。研究發(fā)現(xiàn)在纖維化組織周圍通過產(chǎn)生TGF-β3因子，促進成纖維細胞的增殖及分化，從而幫助組織修復及瘢痕形成［18］。通過TGF-β3因子參與誘導的成纖維細胞多數(shù)增殖能力變強，細胞體積增大，細胞排列不規(guī)整。TGF-β3因子通過誘導炎癥刺激因子聚積，促使炎癥反應加劇，刺激纖維化進程導致瘢痕產(chǎn)生［19］。吡非尼酮的抗纖維化作用在臨床上某些領域已經(jīng)得到了認可，目前在臨床上已經(jīng)應用于控制肝、肺臟等組織纖維化，但在眼科增殖性眼病中的應用研究較少。吡非尼酮可通過抑制TGF-β因子及其通路上蛋白的表達發(fā)揮抗纖維化能力［20］。本實驗通過將吡非尼酮應用于體外培養(yǎng)兔眼Tenons囊成纖維細胞（RYTF）研究其抗纖維化的機制。

吡非尼酮抑制TGF-β3因子的表達，當有外界條件的刺激時，TGF-β3因子與靶細胞膜上的受體結合能力降低，使得細胞傳導通路受到抑制，影響TβR-II-配體-TβR-I 異源三具體復合物聚合，并在Smad4 協(xié)助RSmads向細胞核轉移過程被抑制，使其不能將信號轉導至細胞內，從而抑制了成纖維細胞的增殖進程［21］。表明在纖維化疾病中TGF-β及其下游Smad信號通路對瘢痕的產(chǎn)生具有重大影響。本實驗結果顯示，實驗組TGF-β3熒光表達量較對照組明顯減少，隨吡非尼酮藥物濃度增加，TGF-β3 熒光表達量降低，表明吡非尼酮通過對TGF-β3因子的抑制作用，達到了抑制組織纖維化進程的目的。在蛋白印跡實驗及RT-PCR中TGF-β3表達量與對照組相較均顯著減少，隨吡非尼酮藥物濃度增加，TGF-β3表達量降低。這表明TGF-β3因子在吡非尼酮抑制纖維化過程中作為通路中的重要影響因子。纖維化過程中主要由細胞因子TGF-β及其下游的Smad蛋白共同參與調控目的基因的表達TGF-β/Smad途徑［22］。吡非尼酮通過下調TGF-β/Smad通路信號傳導，從而抑制兔眼RYTF增殖［23］。TGF-β3因子持續(xù)過表達可導致纖連蛋白大量沉積，并使CollagenⅠ、CollagenⅢ增多［24］。在創(chuàng)面修復早期，CollagenⅠ、Collagen Ⅲ在瘢痕形成過程中起主導作用，Collagen Ⅲ早期大量分泌，隨后CollagenⅠ大量增殖，CollagenⅠ粗大且擴張能力強，使組織強度增高纖維化增強［25］。若CollagenⅠ、Collagen Ⅲ增殖遠超過正常組織，則會造成膠原過度沉積，瘢痕疙瘩產(chǎn)生。本實驗結果顯示，實驗組CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表達量均較對照組明顯減少，表明吡非尼酮能有效降低膠原蛋白表達，起到抗纖維化作用。吡非尼酮可在轉錄及翻譯水平抑制膠原活化因子產(chǎn)生及促進細胞外基質降解，從而降低CollagenⅠ和Collagen Ⅲ基因的表達，有效抑制瘢痕形成［26］。

實驗結果表明吡非尼酮可通過抑制TGF-β3、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ基因和蛋白的表達，影響TGF-β/Smad信號傳導通路，作為吡非尼酮抑制RYTF增殖的可能機制。綜上所述，吡非尼酮對體外培養(yǎng)的RYTF增殖具有抑制作用，且可通過抑制TGF-β/Smad介導的信號通路發(fā)揮作用，為今后吡非尼酮抗增殖作用在眼部疾病中的進一步應用提供分子生物學基礎。

綜上所述，本實驗證明吡非尼酮抑制RYTF增殖作用的分子生物學機制可能是：通過抑制TGF-β3分子表達，影響TGF-β/Smad通路傳導，從而降低CollagenⅠ、Collagen Ⅲ的表達，起到了抑制RYTF增殖的作用。生長因子、膠原蛋白表達下降可能作為抑制RYTF增殖、遷移的直接原因。