徐 麗，劉姍姍，王 敏，劉 芳，張容秀，張 凱

蚌埠醫(yī)學院1第一附屬醫(yī)院口腔科，安徽 蚌埠 233004；2蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院口腔科，安徽 蚌埠 233040

齲病是最常見的會影響患者身心健康的慢性感染性疾病［1-3］。第四次全國口腔健康流行病學調(diào)查結果顯示，我國55～64 歲年齡組的恒牙患齲率高達95.60%。因此，齲病防治的任務在我國仍很艱巨［4］。變異鏈球菌（SM）是導致齲病發(fā)生的一種重要的微生物［5-7］。戈登鏈球菌又名格氏鏈球菌（SG），是一種牙面早期定植的先鋒菌，與齲病的形成呈負相關［8,9］。而變鏈素Ⅳ是變異鏈球菌產(chǎn)生的拮抗戈登鏈球菌的一種重要的細菌素［10］。

近年研究表明，細菌毒力因子的表達受細菌體內(nèi)小RNA（sRNAs）的廣泛調(diào)控［11,12］。細菌sRNAs通常長度小于300個核苷酸，位于基因組基因間區(qū)［12］，其主要通過堿基配對與靶基因結合發(fā)揮轉錄后調(diào)控作用［13,14］。1971年，Griffin等［15］通過在大腸埃希菌中首次發(fā)現(xiàn)了一些高度表達的sRNAs 如4.5S，轉運-信使RNA（tmRNA），RNaseP及Spot42等。隨著測序技術和生物信息學的發(fā)展，sRNAs 在其他多種細菌中也得到廣泛研究。例如，Toffano等［16］測序發(fā)現(xiàn)燦爛弧菌中存在成百上千種潛在sRNAs，與其他弧菌的保守性分析發(fā)現(xiàn)，大部分sRNAs 為燦爛弧菌特異性表達，其中有28 種sRNAs在所有弧菌中均有所表達；Howden等［17］對暴露于抗生素狀態(tài)的金黃色葡萄球菌進行RNA測序，結果發(fā)現(xiàn)409個潛在的sRNAs。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，變異鏈球菌中亦存在sRNAs的表達［18-20］，srn821798是其中成功鑒定的一種sRNA。然而，sRNAs是否在變異鏈球菌變鏈素Ⅳ的轉錄后調(diào)控中發(fā)揮關鍵作用，目前尚不清楚。研究報道sepM在變鏈素Ⅳ的表達中發(fā)揮重要作用［10］，鑒于3種靶基因預測軟件均提示sepM是srn821798的靶基因，本文旨在初步探索srn821798在變鏈素Ⅳ形成中的作用。

1 材料和方法

1.1 srn821798的靶基因預測和通路生物信息學分析

RNAhybrid、RNAPredator 和IntaRNA 軟件預測srn821798的候選作用靶基因；DAⅤID（http://david.ncifcrf.gov/）用于分析srn821798參與的ΚEGG通路；antiSMASH（bacterial version）（http://antismash.secondarymetabolites.org/）被用來分析srn821978用于預測變異鏈球菌的次級代謝產(chǎn)物。

1.2 srn821798及其候選靶基因在不同變鏈素Ⅳ表達組變異鏈球菌臨床菌株中的表達水平檢測

在實驗室前期保存的變異鏈球菌臨床株中篩選c血清型菌株，包括高變鏈素Ⅳ表達和無變鏈素Ⅳ表達的變異鏈球菌臨床菌株各10株。戈登鏈球菌是評估變鏈素Ⅳ表達水平的指示菌［21］。變異鏈球菌臨床株在腦心浸液肉湯（BHI）液體培養(yǎng)基中培育過夜，當培養(yǎng)至A600為0.3時，從每個分離菌株中取10 μL加入BHI瓊脂板中，37 ℃培育12 h，然后再接種相等量的戈登鏈球菌，在37 ℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，指示菌株清除區(qū)代表變鏈素Ⅳ的活性。

變異鏈球菌臨床株過夜培養(yǎng)后，用miRNA Mini 試劑盒（Qiagen）提取細菌總RNA。Mir-XTMmiRNA 第一鏈合成試劑盒（Takara）和Mir-XTMmiRNA qRT-PCR TB GreenTM試劑盒（Takara）分別被用于srn821798的聚合酶鏈反應（PCR）和逆轉錄定量聚合酶鏈反應（RTqPCR）。srn8217978的PCR反應條件為95 ℃10 s，95 ℃5 s 40個循環(huán)，50 ℃退火20 s。以16s rRNA的表達水平作為內(nèi)參。16s rRNA，sepM，comD，comE，nlmA，nlmB的PCR條件同之前研究［22,23］。

1.3 標準株中srn821798上、下調(diào)對候選靶基因表達水平的影響測定

由上海吉瑪生物設計并合成srn821798模擬物（GAUUAGUUAUCAGAUUUU，AAUCUGAUAAC UAAUCUU）和抑制劑（AAAAUCUGAUAACUAA UC）。變異鏈球菌UA159（ATCC 700610）在37 ℃，5%CO2下1000 μL BHI液體培養(yǎng)基（1∶100體積比）中培育過夜，然后用0.9%生理鹽水洗兩次，在新鮮的BHI中重懸。將40 μL的樣品和模擬物（8 μL模擬物原液和250 μL無酶水的混合物）或抑制劑（10 μL抑制劑原液和625 μL無酶水的混合物）共同加入1 mm間隙的預冷的電轉化杯，采用ECM（BTX，USA）進行電轉化。模擬物和抑制劑的原液濃度均為20 μmol。電轉參數(shù)：單脈沖2500 Ⅴ，電容25 μF，電阻200 Ω。細菌電穿孔后移至新鮮BHI液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8 h（指數(shù)期中期），然后進行總RNA的提純，即刻反轉錄PCR，并檢測srn821798和候選靶基因的表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence for qPCR of srn821798 and its candidate target genes

1.4 srn821798和sepM結合實驗

人工合成sepM 1（RNAhybrid）、sepM 2（RNApredator）、sepM 3（IntaRNA）以及srn821798小RNA片段（上海吉瑪生物），并對其分別進行瓊脂糖凝膠電泳。srn821798作為對照組；同時將（srn821798+sepM 1）、（srn821798+sepM 2）、（srn821798+sepM 3）進行預混孵育分別電泳，作為實驗組。

1.5 雙熒光素酶報告基因驗證srn821798對sepM的靶向調(diào)控作用

針對RNAhybrid、RNAPredator和IntaRNA軟件預測的sepM基因上與srn821798互作的序列，在psiCHECΚ2質(zhì)粒上構建sepM野生型和突變型質(zhì)粒，并將這些質(zhì)粒和合成的mimic及mimic NC轉染至293T細胞，建立如下分組：mimic NC+psiCHECΚ2-WT、mimic+psiCHECΚ2-WT組、mimic NC+psiCHECΚ2-RNAhybrid-MUT 組、mimic+psiCHECΚ2-RNAhybrid-MUT 組、mimic NC+psiCHECΚ2-RNAPredator-MUT 組、mimic+psiCHECΚ2-RNAPredator-MUT 組、mimic NC+psiCHECΚ2-IntaRNA-MUT組、mimic+psiCHECΚ2-IntaRNA-MUT組、mimic NC+psiCHECΚ2 組、mimic+psiCHECΚ2組。采用Dual-Luciferase雙熒光素酶檢測試劑盒檢測各組細胞相對熒光信號強度。

1.6 統(tǒng)計學分析

用IBM SPSS20.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，定量數(shù)據(jù)采用t檢驗方法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 已鑒定sRNAs的生物信息學分析

2.1.1 已鑒定sRNAs靶基因預測結果 3種靶基因預測專用軟件RNAhybrid、RNAPredator 和IntaRNA 對srn821798進行靶基因預測，結果提示，sepM，comD，comE，nlmA，nlmB是srn821798的候選作用靶基因（表2），其中3 種軟件的預測結果均提示sepM是srn821798的候選靶基因（表3）。

表2 3種軟件靶基因預測的srn821798-mRNA作用位點Tab.2 srn821798 mRNAaction sites predicted using 3 software

表3 3種軟件靶基因預測的srn821798-sepM作用位點Tab.3 srn821798-sepM action sites predicted by software

2.1.2srn821798參與的通路分析 ΚEGG通路分析提示，srn821798參與以次級代謝產(chǎn)物合成為主的多數(shù)通路，而次級代謝產(chǎn)物分析軟件antiSMASH（bacterial version）顯示變鏈素Ⅳ是變異鏈球菌中一種重要的次級代謝產(chǎn)物（圖1），這與靶基因預測結果一致。

圖1 srn821798 ΚEGG通路分析結果Fig.1 KEGG pathway analysis of srn821798.A:KEGG analysis of the target genes predicted by RNAPredator suggests that biosynthesis of secondary metabolites is one of the important pathways involving srn821798.B:KEGG analysis of the target genes predicted by IntaRNA suggests that biosynthesis of secondary metabolites is one of the important pathways involving srn821798.

2.1.3 變異鏈球菌臨床菌株中srn821798和靶基因的表達水平分析 高表達變鏈素Ⅳ組中sepM，comD，comE，nlmA及nlmB均有表達，且表達水平均顯著高于無表達變鏈素Ⅳ組（P＜0.05），而高表達變鏈素Ⅳ組srn821798的表達水平顯著低于無表達變鏈素Ⅳ組（P＜0.001）。低表達菌株，但兩組菌株中候選靶基因的表達水平均未存在顯著差異，其中sepM的表達水平在兩組間存在差異的趨勢，而前期3種靶基因預測軟件的交集結果亦提示srn821798可調(diào)控sepM的表達，并且RNAhybrid 和RNAPredator預測的srn821798-sepM結合位點高度一致。因此我們繼而檢測了3種軟件預測的srn821798-sepM結合能力，結果發(fā)現(xiàn)，RNAhybrid和RNAPredator預測的srn821798-sepM位點結合能力高（結合率分別為82.84%和85.19%）（圖3）。

圖2 變異鏈球菌臨床株中srn821798和靶基因表達水平分析Fig.2 Expression analysis of srn821798 and its target gene in clinical strains of Streptococcus mutans.A:Serotype test result.B:Expression map of mutacin IV in clinical strains with high or no mutacin IV expression.C:Relative expression level of srn821798.D-H:Relative expression levels of the candidate target genes(*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001).

圖3 srn821798過、低表達株中候選靶基因表達水平的檢測及srn821798-sepM預測結合位點的結合能力分析Fig.3 Detection of relative expression levels of the candidate target genes in srn821798 high expression and low expression strains and analysis of binding ability of srn821798 with predicted binding sites of sepM.A:High expression and low expression of srn821798 in srn821798 high expression and low expression strains group(*P＜0.05 vs S.mutans).B-F:Relative expression levels of the candidate target genes in srn821798 high expression and low expression strains group.G:Analysis of binding ability of srn821798-sepM;sepM 1,sepM 2 and sepM 3 represent the binding sequences of srn821798 and sepM gene predicted by RNAhybrid,RNAPredator and IntaRNA.H:Binding rates of srn821798 with sepM 1, sepM 2 and sepM 3 analyzed with SEPM 1,SEPM 2 and SEPM 3 as controls(***P＜0.001).

2.2 srn821798對sepM靶向調(diào)控的雙熒光素酶報告基因驗證

以mimic NC+psiCHECΚ2-WT為對照，srn821798模擬物與野生型載體（psiCHECΚ2-WT）共轉染293T細胞后，細胞熒光素酶活性明顯下降（RNAhybridP=0.003；RNAPredatorP=0.002）；以mimic NC +psiCHECΚ2-MUT為對照，srn821798模擬物與突變型載體（psiCHECΚ2-RNAhybrid-MUT 或psiCHECΚ2-RNAPredator-MUT）共轉染293T細胞后，細胞熒光素酶活性未見明顯差異（RNAhybridP=0.800；RNAPredatorP=0.292）。針對IntaRNA的預測結果，雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，以mimic NC+psiCHECΚ2-WT 為對照,以mimic NC+psiCHECΚ2-MUT 為對照，srn821798模擬物（mimic）與突變型載體（psiCHECΚ2-IntaRNA-MUT）共轉染293T細胞后，細胞熒光素酶活性亦明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.014，圖4）。

圖4 雙熒光素酶報告基因驗證srn821798靶向調(diào)控sepM的結果Fig.4 Targeted regulatory role of srn821798 in sepM expression detected by dual-luciferase reporter system.A:Dual-luciferase reporter assay for examining srn821798-sepM interaction according to the RNAhybrid prediction.B:Dual-luciferase reporter assay for examining srn821798-sepM interaction according to the RNAPredator prediction.C:Dual-luciferase reporter assay of srn821798-sepM interaction according to the IntaRNAprediction.*P＜0.05;**P＜0.01.

3 討論

齲病是口腔科最常見最高發(fā)的疾病之一，是由變異鏈球菌等細菌為主的多種因素作用下所造成的牙體硬組織分解、破壞［24］。變異鏈球菌形成齲壞的先決條件是對牙面的黏附，從而促進菌斑生物膜的形成，代謝碳源產(chǎn)生酸性終末產(chǎn)物，進而導致牙齒表面脫礦并最終形成齲洞［25］。戈登鏈球菌是一種與齲病的形成呈負相關的早期牙面定植菌，阻止齲齒形成的關鍵可能是一方面通過釋放氨平衡變異鏈球菌產(chǎn)生的酸性環(huán)境，另一方面其可直接拮抗變異鏈球菌的生長［21,26,27］。

細菌素是由細菌合成的抗菌肽，為細菌的自身生長提供競爭優(yōu)勢［28］。變鏈素Ⅳ是由變異鏈球菌中的nlmA和nlmB編碼產(chǎn)生的拮抗多種非變異鏈球菌如戈登鏈球菌、血鏈球菌進而保護變異鏈球菌生長的一種細菌素［29］。文獻報道，ComDE雙組份調(diào)控系統(tǒng)在變鏈素Ⅳ的表達中起著重要正調(diào)控作用，而該系統(tǒng)又進一步受上游SepM蛋白的影響［10］。且本課題組最近的研究結果表明，變異鏈球菌臨床菌株中SepM蛋白的編碼基因sepM中存在與變鏈素Ⅳ形成相關的突變類型［30］。

既往研究表明，sRNAs主要通過與目標靶mRNAs堿基配在轉錄后水平調(diào)控細菌毒力的表達，并且sRNAs有望成為評估臨床疾病狀況和嚴重程度的生物標志物［10,21,31］。已經(jīng)有許多細菌的sRNAs被證實［32］。然而，在齲病方面，關于致齲菌sRNAs的研究較少，Lee等［33］發(fā)現(xiàn)變異鏈球菌中15～26個核苷酸大小的sRNAs可能有數(shù)百種；Li等［34］通過生物信息學預測得到變異鏈球菌中存在sRNA L10-Leader，繼而通過實驗驗證并檢測了該sRNA在不同生長環(huán)境下的表達改變。我們前期在不同的糖（蔗糖和葡萄糖）濃度和初始PH5.5壓力下亦檢測發(fā)現(xiàn)變異鏈球菌中可檢測到大量的sRNAs［18-20］。但是是否存在調(diào)控變鏈素Ⅳ形成的關鍵sRNAs尚不清楚。我們針對前期已鑒定的sRNAs進行生物信息學預測，發(fā)現(xiàn)多數(shù)sRNAs可能參與調(diào)控變鏈素IⅤ的表達，我們隨機對其中一種sRNAsrn225147進行了分析，發(fā)現(xiàn)comD是候選靶標，但是進一步實驗檢測發(fā)現(xiàn)，其雖可雙向調(diào)控靶基因comD的表達，但是對變鏈素Ⅳ的調(diào)控能力微弱［29,35］。為了進一步尋找可能在變鏈素Ⅳ形成中起調(diào)控作用的sRNAs，本實驗中我們篩選了三種靶基因預測軟件均有相同靶標結果的srn821798，并且RNAhybrid和RNAPredator預測的srn821798和sepM的作用位點高度相似，這加強了srn821798調(diào)控變鏈素Ⅳ的可信度，因此，本文就srn821798在變鏈素Ⅳ中的作用進行重點分析。

本課題組利用生物信息學預測srn821798在變鏈素Ⅳ中的潛在作用后，進而在20株臨床分離菌株（高變鏈素Ⅳ表達組n=10；變鏈素Ⅳ無表達組n=10）中進一步檢測了srn821798和sepM，comD，comE，nlmA，nlmB候選靶基因的表達水平。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖可明顯影響變異鏈球菌小RNA的表達［10］。本次研究中，考慮到臨床菌株之間蔗糖利用率和蔗糖誘導毒力的差異尚不清楚，因此為了排除蔗糖可能引起的影響，我們在本次實驗中均未加入蔗糖。結果發(fā)現(xiàn)，在高變鏈素Ⅳ表達組中，sepM，comD，comE，nlmA，nlmB表達水平顯著高于無變鏈素Ⅳ表達組；高表達變鏈素Ⅳ組srn821798的表達水平顯著低于無表達變鏈素Ⅳ組。靶基因在高、低變鏈素Ⅳ表達組中呈正向表達，而srn821798在高、低變鏈素Ⅳ表達組中呈負向表達，這提示，srn821798可能通過調(diào)控候選靶基因在變鏈素Ⅳ中起重要作用，而且可能為負反饋調(diào)節(jié)。為進一步驗證我們的設想，我們進而在變異鏈球菌UA159標準株上成功構建了srn821798過、低表達菌株，并發(fā)現(xiàn)當srn821978的表達水平上調(diào)到約100倍時，候選靶基因在srn821798上調(diào)組和對照組中的表達均無明顯差異。電泳結果提示，RNAhybrid和RNAPredator預測的srn821798-sepM位點結合能力高，這與雙熒光素酶報告基因的檢測結果一致。雙熒光素酶報告基因檢測實驗發(fā)現(xiàn)，mimic NC+野生質(zhì)粒為對照，srn821798mimic 與野生型載體共轉染293T 細胞后，細胞熒光素酶活性明顯下降；以mimic NC+突變質(zhì)粒為對照，srn821798mimic 與RNAhybrid 或RNAPredator突變型載體共轉染293T細胞后，細胞熒光素酶活性未見明顯差異。這驗證了RNAhybrid 和RNAPredator軟件預測的srn821798-sepM作用位點的有效性。然而，srn821798mimic與IntaRNA突變型載體共轉染293T細胞后，細胞熒光素酶活性亦明顯下降，并且差異倍數(shù)與mimic NC+野生質(zhì)粒組和mimic+野生質(zhì)粒組的區(qū)別差異不大，這主要是因為，mimic與RNAhybrid 和RNAPredator 預測的位點有結合，但與IntaRNA預測的位點無結合能力或者結合效果微弱。因此，sepM確實是srn821798的直接作用靶標，主要作用位點為RNAhybrid和RNAPredator預測的區(qū)域。

綜上所述，我們的研究為變異鏈球菌在轉錄后水平上產(chǎn)生變鏈素Ⅳ提供了新的視角，結果提示srn821798通過調(diào)控靶基因sepM的表達進而調(diào)節(jié)變鏈素Ⅳ的形成。然而，srn821798介導的變鏈素Ⅳ產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用較弱。本結果雖與srn225147的研究結論相似，但存在明顯不同的地方。首先，srn821798在臨床菌株中高變異鏈球菌表達組中的表達水平約是低變異鏈球菌表達組的1萬倍，而srn225147在兩組的表達差異僅約4倍，這提示我們，srn821798對變鏈素Ⅳ的調(diào)控能力可能明顯優(yōu)于srn225147。其次，以往我們關于srn225147在變鏈素Ⅳ中的研究，僅針對兩個靶基因預測軟件（RNAhybrid和RNAPredator）得出的單一靶基因comD進行探索，而本次研究中，為了得到更精確的預測結果，我們采用三種靶基因預測軟件進行（RNAhybrid、RNAPredator 及IntaRNA）分析，對得出的所有已報道的與變鏈素Ⅳ形成相關的靶基因（sepM,comD,comE,nlmA,nlmB）進行了表達水平的探索，并對三種靶基因預測得到較為一致的sepM結果進行了小RNA-sepM結合片段的靶點驗證分析。故，本研究是我們既往研究的擴展和深入。雖然得到的結果也是srn821798介導變鏈素Ⅳ形成的能力微弱。但是，這可能與本實驗標準菌株中srn821798高、低表達組中srn821798的表達差異沒有達到臨床菌株的差異水平。因此，在后續(xù)的研究中，我們需進一步改善實驗條件，嘗試電轉得到更高的srn821798上調(diào)倍數(shù)來驗證我們的假設。此外，在本研究中，我們只關注srn821978，而其他未鑒定的sRNAs是否通過靶向sepM-ComDE通路相關基因在變鏈素Ⅳ的調(diào)控中發(fā)揮重要作用尚不清楚，還需進一步研究。