鄭國兵 梁睿 唐家彥 王德剛 梁少霞 謝豐華

作者單位：1.中山市博愛醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，廣東，中山528400

2.中山市博愛醫(yī)院兒科，廣東，中山528400

遺傳代謝病（Inherited metabolic disease，IMD）是因機體各代謝途徑部分酶缺陷，造成毒副產(chǎn)物過度堆積或必要代謝產(chǎn)物合成不足，而出現(xiàn)各種臨床癥狀的一組疾?。?-3］。該病雖單一病種發(fā)病率較低，但總體發(fā)病率及死亡率不低［4-5］。有研究報道，部分IMD 具有嚴重致死性，而另一部分存活患者，如不能在中樞系統(tǒng)發(fā)育之前或出現(xiàn)嚴重癥狀之前給予有效治療，將難以達到理想治療效果［6-7］。因此臨床對IMD 早發(fā)現(xiàn)、早治療十分重要。但常規(guī)篩查方式，由于體內(nèi)生化代謝物濃度受疾病、藥物、飲食等因素影響而不斷變化，因此檢查結(jié)果具有一定不確定性。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（Tandem mass spectrometry，MS/MS）可在2～3 min 檢測幾十種分子代謝產(chǎn)物，從而實現(xiàn)40 多種IMD 篩查［8-9］，繼而通過分子手段找到致病基因與致病突變，但目前國內(nèi)有關(guān)分子檢測研究報道較少。本研究探討MS/MS 在IMD 篩查中的應用價值?，F(xiàn)報道如下。

1 一般資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年10月至2020年10月于中山市博愛醫(yī)院產(chǎn)前中心就診的新生兒70 509 例，采用MS/MS 術(shù)篩查其遺傳代謝性疾病。接受MS/MS篩查的新生兒中，男39 364 例（55.83%），女31 145（44.17%）；足月兒（37～42）周68 543 例（97.21%），早產(chǎn)兒（＜37 周）1 966 例（2.79%）；采血日齡平均（5.48±1.76）天；體重平均（3.52±1.49）kg；正常體重（2.5～4）kg 新生兒60 542 例（85.87%），體重偏低（＜2.5 kg）新生兒3 480 例（4.93%），巨大兒（＞4 kg）6 487 例（9.20%）；單胎為69 959 例（99.22%），多胎550 例（0.78%）；來自鄉(xiāng)鎮(zhèn)地區(qū)為8 855 例（12.56%）。納入標準：本院產(chǎn)前中心自愿接受IMD 篩查者。排除標準：①出生時出現(xiàn)窒息、產(chǎn)傷、顱內(nèi)出血患兒。②藥物或母親原性肉堿缺乏等繼發(fā)因素造成IMD者。③芯片檢測拷貝數(shù)據(jù)異?；蛉旧wG 顯帶異常的已知IMD 綜合征患兒。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理會委員批準，新生兒家屬均知情，且簽訂同意書。

1.2 方法

1.2.1 采集標本

新生兒充分喂養(yǎng)后3 天，采集其足跟血及末梢血于專用篩查濾紙，血斑直徑＞8 mm，常溫下陰干，再將濾紙片送往新生兒疾病篩查中心待檢。

1.2.2 使用儀器與試劑

串聯(lián)質(zhì)譜檢測：采用美國Wocters 公司的TQD 質(zhì)譜儀，采用PE 公司NeoBuseTMNon-derivati zed MSMS Kit 非衍生化多種肉堿、琥珀酰丙酮、及氨基酸試劑盒及配套試劑檢測。試劑盒涵蓋13 種同位素標記的?；鈮A及游離肉堿標準品?；驕y序檢測：利用核酸（DNA）提取試劑盒（由艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司提供）提取基因組DNA，及基因測序儀NextSeqCN500 對富集文庫進行高通量測序。

1.2.3 實驗室檢測

串聯(lián)質(zhì)譜：從血濾紙片中取出直徑為3 mm 的圓形濾紙片，放于96 孔聚丙烯版（試劑盒由北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司提供）中進行肉堿、非衍生化多種氨基酸、及琥珀酰丙酮測定。非衍生化法：將100 μL 同位素內(nèi)標的?；鈮A與氨基酸加入孔中，運用微孔板封膜將其密封，震蕩萃取40 min，取70 μL 上清液加入96 孔聚丙烯板中，運用鋁膜將其覆蓋，上樣檢測。基因測序檢測：運用基因序列捕獲技術(shù)將患兒全基因組文庫與IMD 常見致病基因捕獲探針混合。當致病基因附著于探針上后，用洗脫方式洗掉非目標區(qū)域DNA 片段。對目標區(qū)域進行測序，再用Trim-Galore 程序處理便可獲得讀數(shù)。

1.2.4 召回及確診可疑陽性標本

通過電話及時召回篩查結(jié)果為可疑陽性新生兒，重新采集標本進行MS/MS 檢測。如第二次檢測依然呈陽性的標本，需及時送檢分析其基因突變，本次研究中663 例可疑陽性新生兒均接受定期檢測與隨訪，無失訪現(xiàn)象發(fā)生。

1.3 統(tǒng)計分析

運用EXCEL 表格匯總數(shù)據(jù)；可疑陽性率用n（%）表示，通過可疑陽性例數(shù)/總篩查例數(shù)計算出可疑陽性率；陽性總發(fā)病率、發(fā)病率及總發(fā)病率均用1/n 表示，通過等式：陽性確診例數(shù)/總篩查例數(shù)=1/n 可得出n 值；總構(gòu)成比用n（%）表示，各類型遺傳代謝性疾病確診例數(shù)/總確診例數(shù)，可得出不同類型代謝性疾病在總確診例數(shù)中的構(gòu)成比。

2 結(jié)果

2.1 串聯(lián)質(zhì)譜篩查陽性初篩率及陽性確診率

在參與篩查的70 509 例新生兒中，初篩住院陽性患兒為663 例，門診陽性患兒為26 例，陽性初篩率為0.98%，成功召回689 例，成功召回率為100%。被召回陽性可疑新生兒再次進行MS/MS 檢測，56 例依舊陽性，56 例患兒依據(jù)不同陽性可疑病種，均進行基因診斷與鑒別診斷，最終30 例新生兒確診為IMD，總發(fā)病率為1/2 350。在689 例初篩陽性新生兒中，最終確診僅為30 例，假陽性率為0.93%。其中有機酸代謝異常6 例，脂肪酸代謝異常8 例，氨基酸代謝異常16 例。見表1。

表1 串聯(lián)質(zhì)譜篩查陽性初篩率及陽性確診率［n（%）］Table 1 Specific conditions of tandem mass spectrometry screening in children with positive diagnosis［n（%）］

2.2 陽性確診患兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查具體情況

30 例確診病例中，有機酸代謝障礙6 例，即3羥-3 甲基戊二酸酸尿癥（3-hydroxy-3-methylglutaric aciduria，HMG）、異丁酰輔酶脫羥酶A 缺乏癥（Isobutyryl coenzyme dehydroxylase a deficiency，IBDD）、全羥化酶合成酶不足（Total hydroxylase synthase deficiency，HLCS）各1 例，甲基丙二酸血癥（Methylmalonic acidemia，MMA）3 例；脂肪酸代謝障礙8 例，即短?；o酶脫羥酶A 缺乏癥（Short acyl coenzyme dehydroxylase a deficiency，SCADD3）3 例、原發(fā)性肉堿缺乏癥（Hypermethylsulfatemia primary carnitine deficiency，PCD）5 例；氨基酸代謝障礙16 例，即鳥氨酸血癥（Ornithinemia，ORN）、Ⅰ型瓜氨酸血癥（Citrullinemia type I，CTLN1）各1 例，高甲基硫酸血癥（Hypermethylsulfaemia，MIM）4 例高丙氨酸血癥（Hyperalaninemia，HPA）12 例。見表2。

表2 陽性確診患兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查具體情況Table 2 specific conditions of tandem mass spectrometry screening in children with positive diagnosis

2.3 串聯(lián)質(zhì)譜篩查技術(shù)優(yōu)勢

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查病種豐富，篩查項目齊全，可實現(xiàn)對18 種氨基酸代謝性疾病、14 種有機酸代謝性疾病及14 種脂肪酸代謝性疾病的篩查。該技術(shù)篩查時間僅需5 h 左右。

3 討論

遺傳代謝性疾病治療難度較大，其治療效果與干預時間密切相關(guān)［10-11］。近年來遺傳代謝性疾病隨著新生兒出生缺陷率增加，有逐漸上漲趨勢，嚴重影響患兒身心健康，并對患兒家庭造成巨大經(jīng)濟負擔。因此早期對新生兒遺傳代謝性疾病進行篩查十分重要。從1981年我國首次開展新生兒疾病篩查以來，納入普篩的疾病為先天性甲狀腺功能降低癥。隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)及配套篩查試劑的發(fā)展，可篩疾病已達到40 余種，這將推動更多疾病納入普篩項目［12-13］。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能對多種疾病、多種指標進行篩查，能在2 min 內(nèi)實現(xiàn)多種游離肉堿、氨基酸、及?；鈮A的檢測［14］。

本研究對70 509 例新生兒采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行遺傳代謝性疾病篩查，可疑陽性為663 例，其中30 例被最終確診，總發(fā)病率達1/2 350，高于浙江地區(qū)1/5 626 的發(fā)病率，上海地區(qū)1/3 529 的發(fā)病率，鹽城地區(qū)1/4 384 的發(fā)病率，但低于淄博市1/1 683的發(fā)病率、及鄭州地區(qū)0.1%的發(fā)病率［14］。由此得出，遺傳代謝性疾病分布具有顯著地區(qū)差異性，分析原因可能為，不同地區(qū)采集標本方式、篩查標準、及基因多態(tài)性分布差異造成。本地區(qū)總體來說，為比較高發(fā)地區(qū)。因此對本地區(qū)新生兒遺傳代謝性疾病，運用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行篩查十分必要。

本文研究結(jié)果還表明，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有篩查病種豐富、篩查項目齊全及篩查時間短的特點。因為串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有高選擇性、高特異性、及高靈敏度等優(yōu)良性能，因此在檢測新生兒代謝疾病領(lǐng)域具有顯著優(yōu)勢。本研究串聯(lián)質(zhì)譜具體檢測結(jié)果顯示，高丙氨酸血癥（PHA），為氨基酸代謝障礙疾病中多發(fā)疾病。該病多為丙氨酸羥化酶突變造成相關(guān)酶活性降低而引發(fā)，臨床主要表現(xiàn)為小腦共濟失調(diào)、視神經(jīng)萎縮，肌張力降低等。

值得注意的是，本研究采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對新生兒代謝疾病進行篩查，假陽性率高達0.93%，相關(guān)研究指出，提升篩查性能，加強篩查質(zhì)量管理，降低篩查假陽性率?？赏ㄟ^保證血片質(zhì)量、控制實驗流程、檢驗程序、實驗室評估、判讀方法等質(zhì)量，及互相交流與數(shù)據(jù)共享，加強實驗室及區(qū)域協(xié)作而實現(xiàn)。因此通過嚴格質(zhì)量把控，與交流協(xié)作可降低串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查假陽性率。

綜上所述，新生兒遺傳代謝性疾病采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行篩查可提高篩查有效性與準確率。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能對遺傳代謝性疾病早發(fā)現(xiàn)，為后續(xù)治療贏得寶貴時間，從而改善患兒預后效果，使我國出生人口綜合質(zhì)量得到提高。且串聯(lián)質(zhì)技術(shù)具有篩查病種豐富，篩查項目齊全，且篩查時間短的特點。因此串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查新生兒遺傳代謝性疾病具有推廣價值。