藍鍇 鐘國升 劉宇陽 陳瑤 伍眾文 余學高 陳茶★ 黃彬★

作者單位：1.廣東省中醫(yī)院檢驗醫(yī)學部，廣東，廣州510120

2.廣東醫(yī)科大學醫(yī)學技術(shù)學院，廣東，東莞523770

3.中山大學附屬第一醫(yī)院檢驗醫(yī)學部，廣東，廣州510080

異質(zhì)性耐藥（heteroresistance，HR）意指同一克隆菌株中同時存在對某種抗生素耐藥和敏感亞群的現(xiàn)象，可能是導致臨床上患者用藥失敗甚至誘導耐藥菌株產(chǎn)生的重要原因［1］。多種臨床常見致病菌已被報道存在異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象［2］。長期以來，萬古霉素（vancomycin，VAN）是治療甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的首選藥物，隨著其在臨床中的廣泛應(yīng)用，MRSA對VAN 的敏感性逐漸下降，異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌（heterogeneous vancomycin-intermediateStaphylococcus aureus，hVISA）的檢出率愈來愈高，但異質(zhì)性耐藥的機制尚不清楚，因此研究MRSA 異質(zhì)性耐藥的機制顯得極其重要。葡萄球菌染色體mec 盒基因遺傳元件（staphylococcal cassete chromosome mec，SCCmec）分型是目前臨床較常用的分子分型方法。目前，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)MRSA 耐藥機制與SCCmec 元件整合mecA、mecC等相關(guān)耐藥基因、雙組分系統(tǒng)的調(diào)控以及生物膜的形成［3］等有關(guān)，但MRSA 異質(zhì)性耐藥的機制尚不十分清楚。替考拉寧（teicoplanin，TEC）與VAN 同屬于糖肽類抗生素，廣泛應(yīng)用于臨床，其治療效果與VAN 相當，但是MRSA對TEC 的異質(zhì)性耐藥情況并不清楚。因此，本文擬研究MRSA對VAN 和TEC 的異質(zhì)性耐藥情況，對其進行SCCmec 基因分型，并研究SCCmec 基因型是否與MRSA 的異質(zhì)性耐藥有關(guān)，為MRSA 異質(zhì)性耐藥的流行病學研究及防治提供實驗室依據(jù)，為MRSA 復雜的異質(zhì)性耐藥機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2016年1月至2020年12月間中山大學附屬第一醫(yī)院臨床分離的MRSA 305 株，剔除同一患者重復分離的菌株，凍存于-80℃?zhèn)溆?。菌株分離自血液、膿液、痰液標本。質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 25923 購自衛(wèi)健委全國臨床檢驗中心；SCCmec 分型標準菌株由上海肺科醫(yī)院檢驗科余方友教授惠贈。

1.2 主要儀器與試劑

VAN 粉末購自上海麥克林生化有限公司，TEC 粉末購自上海源葉生物科技有限公司，Brain Heart Infusion Agar 腦心浸液瓊脂、Brain Heart Infusion Broth 腦心浸液肉湯購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，Vitek 2 全自動微生物檢測系統(tǒng)購自法國生物梅里埃公司，Veriti 擴增儀購自美國Life Technologies 公司。Vilber Fusion FX7 凝膠成像儀購自法國VILBER 公司，DYY-6C 電泳儀購自北京市六一儀器廠，PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，2×Accurate Taq預混液購自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.3 菌株復蘇

將臨床分離的MRSA 從-80℃冰箱取出，解凍后用接種環(huán)挑取一環(huán)菌液，分區(qū)劃線接種于血平板，37℃培養(yǎng)18 h，得到MRSA 單個菌落。

1.4 SCCmec 分型

采用廣州達安基因股份有限公司核酸提取與純化試劑盒提取細菌的DNA。按照參考文獻［4］合成引物見表1，采用多重PCR 進行SCCmec 分型。多重PCR 反應(yīng)條件：預變性94℃5 min；變性94℃45 s，退火65℃45 s，延伸72℃90 s 共10 個循環(huán)；變性94℃45 s，退火55℃45 s，延伸72℃90 s 共25 個循環(huán)；最后延伸72℃10 min。取3 μL 反應(yīng)產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，在120 V、55 mA 條件下電泳40 min 后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照保存。

表1 SCCmec 基因分型所用的引物Table 1 Primers of SCCmec genotyping

1.5 異質(zhì)性耐藥初篩

以菌群譜型分析微量滴定法（microtitration population analysis profiling，MPAP）［5］對MRSA 進行異質(zhì)性耐藥表型初篩，分別配制7 個倍比稀釋濃度2-2～24mg/L 含VAN 和TEC 的BHI 平板。挑取復蘇的單個克隆菌落接種于3 mL BHI 肉湯培養(yǎng)基，37℃過夜增菌后，用BHI 肉湯調(diào)節(jié)菌液濃度分別為101、102、103、104、105、106、107CFU/mL。取10 μL 菌液滴定于梯度抗生素平板，每個克隆重復兩滴，每塊板滴10 株菌的菌液。實驗重復三次。37℃孵育48 h 后觀察細菌生長情況，菌落數(shù)量隨著抗生素濃度升高而緩慢下降，最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）與最高不抑菌濃度（the highest noninhibitory concentration，HNIC）的比值大于8，則為異質(zhì)性耐藥初篩陽性。

1.6 異質(zhì)性耐藥確證

采用菌群譜型分析法（population analysis profiling，PAP）［6］對MRSA 異質(zhì)性耐藥表型初篩陽性菌株進行確證。分別配制7 個倍比稀釋濃度2-2～24mg/L 含VAN 和TEC 的BHI 平板。挑取HR 陽性的單個克隆菌落接種于3 mL BHI 肉湯培養(yǎng)基，37℃過夜增菌后，用BHI 肉湯調(diào)節(jié)菌液濃度分別為101、102、103、104、105、106、107CFU/mL。取20 μL 菌液滴定于PAP 梯度抗生素平板，均勻涂布，重復三次。37℃孵育48 h 后菌落計數(shù)，并使用Graph-Pad Prism 軟件將菌落數(shù)量與抗生素濃度作圖，若MIC與HNIC 比值大于8，則為異質(zhì)性耐藥確證陽性。

1.7 統(tǒng)計學分析

利用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析；計數(shù)資料采用n（%）表示，采用χ2檢驗；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MRSA 的臨床特征

305 株MRSA 主要分離自患者痰液36.4%（111/305）、血液30.8%（94/305）、膿液32.8%（100/305）。分離科室主要為重癥監(jiān)護室26.6%（81/305）、外科26.9%（82/305）、內(nèi)科10.5%（32/305）、急診區(qū)7.5%（23/305）、皮膚科7.5%（23/305）。

2.2 SCCmec 分型

79 株為SCCmec Ⅱ型25.9%，31 株為SCCmecⅢ型10.2%，109 株為SCCmec Ⅳa 型35.7%，6 株為SCCmec Ⅳb 型2.0%，1 株為SCCmec Ⅳc 型0.3%，2株為SCCmec Ⅳd 型0.7%，17 株為SCCmec Ⅴ型5.6%，剩下60 株未能分型19.7%。部分MRSA SCCmec 分型電泳結(jié)果見圖1。血液和膿液標本中分離的MRSA 主要為SCCmec Ⅳ型；痰液標本中分離的MRSA 主要為SCCmec Ⅱ型（P＜0.05）。見表2。

表2 來源于不同標本類型MRSA 的SCCmec 分型結(jié)果［n（%）］Table 2 SCCmec typing results of MRSA from different types of specimens［n（%）］

圖1 部分MRSA SCCmec 分型結(jié)果（多重PCR）Figure 1 SCCmec typing results of partial MRSA（multiples PCR）

2.3 MRSA 異質(zhì)性耐藥初篩

305 株MRSA 中有12 株對VAN 耐藥，33 株對TEC 耐藥，6 株同時對兩者耐藥，后續(xù)實驗分別剔除對VAN 和TEC 耐藥的MRSA，剩下對VAN 敏感的MRSA 293 株，對TEC 敏感的MRSA 272 株。分別對VAN、TEC 敏感的MRSA 進行MPAP 異質(zhì)性耐藥初篩，見圖2。MPAP 結(jié)果顯示對VAN 異質(zhì)性耐藥MRSA（MRSA-VAN-HR）陽性菌114 株（114/293，38.9%），對TEC 異質(zhì)性耐藥MRSA（MRSA - TEC - HR）陽性菌166 株（166/272，61.0%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MRSA對VAN 和TEC 同時異質(zhì)性耐藥（MRSA-VAN-TECHR）陽性68 株。

圖2 MRSA-TEC-HR 與MRSA-VAN-HR 初篩的MPAP 結(jié)果Figure 2 The preliminary screening results of MRSA-TECHR and MRSA-VAN-HR by MPAP method

2.4 MRSA 異質(zhì)性耐藥確證

PAP 法顯示，114 株初篩對VAN 異質(zhì)性耐藥陽性菌中有104 株確證對VAN 異質(zhì)性耐藥陽性（MRSA-VAN-HR），異質(zhì)性耐藥率為35.5%（104/293）；166 株初篩對TEC 異質(zhì)性耐藥陽性菌中有163 株對TEC 異質(zhì)性耐藥陽性（MRSA-TEC-HR），異質(zhì)性耐藥率為59.9%（163/272），MRSA對VAN與TEC 的異質(zhì)性耐藥率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。62 株MRSA 表現(xiàn)為VAN 和TEC 同時異質(zhì)性耐藥（MRSA-VAN-TEC-HR）。見圖3。

圖3 MRSA-TEC-HR 與MRSA-VAN-HR PAP 法確證結(jié)果Figrue 3 The results of MRSA-TEC-HR and MRSA-VANHR by PAP method

2.5 SCCmec 分型與MRSA 異質(zhì)性耐藥情況的相關(guān)性分析

不同SCCmec 型別的MRSA對TEC 的異質(zhì)性耐藥率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），SCCmec分型與MRSA-TEC-HR 有一定相關(guān)性（r=0.22）。不同SCCmec 型別的MRSA對VAN 的異質(zhì)性耐藥率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），SCCmec 分型與MRSA-VAN-HR 不存在相關(guān)性。見表3。

表3 MRSA 的SCCmec 型別與異質(zhì)性耐藥相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between SCCmec typing and heteroresistance of MRSA

3 討論

SCCmec 分型是臨床常用的分子分型方法，可根據(jù)多重PCR 后電泳條帶的位置進行分子分型。SCCmec 元件也被稱為“耐藥島”，攜帶的多種耐藥基因可能也與MRSA 的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象存在一定的關(guān)聯(lián)。

本院2016 至2020年五年間臨床分離的MRSA 流行菌株以SCCmec Ⅳ型為主（38.7%），其次為SCCmec Ⅱ型（25.9%），提示臨床分離的MRSA 以SCCmec Ⅳ型為主要流行菌株，可能與SCCmec Ⅳ型元件相對較短更容易在不同遺傳背景的MRSA 中轉(zhuǎn)移有關(guān)［7］。本院2008年至2011年四年間560 株MRSA 分型主要為SCCmec Ⅲ型（占66%）［4］，提示這幾年間本院發(fā)生了MRSA 菌株從以SCCmec Ⅲ型為主到以SCCmec Ⅳ、Ⅱ型為主的轉(zhuǎn)變。國內(nèi)有關(guān)文獻報道MRSA SCCmec分型主要以Ⅲ型為主［8］，主要為院內(nèi)感染。本次研究有60 株（19.7%）未能分型，可能是除了SCCmecⅠ～Ⅴ型以外的SCCmec Ⅵ-ⅩⅣ型，但是否存在新的型別還有待進一步研究。本研究中來源于不同標本類型MRSA 的SCCmec 分型結(jié)果不同，血液和膿液標本都以SCCmec Ⅳ型為主，而痰液標本則以SCCmec Ⅱ型為主；提示SCCme Ⅳ型MRSA 更容易經(jīng)血源性及化膿性感染途徑傳播，而SCCmec Ⅱ型MRSA 更容易通過呼吸道傳播。

目前，有關(guān)MRSA 異質(zhì)性耐藥情況的報道相對較少，已有的研究主要為MRSA對VAN 的異質(zhì)性耐藥。VAN 作為臨床上治療MRSA 的最后一道防線，隨著其廣泛使用，全球MRSA-VAN-HR檢出率逐漸增高，2004年的一項研究［9］曾經(jīng)報道中國局部地區(qū)h-VISA 檢出率為6.7%；2009年濟南地區(qū)的h-VISA 分離率為13.4%［10］；2012 至2017年5年間鄭州大學附屬第一醫(yī)院h-VISA 檢出率為17.9%［11］。本研究結(jié)果顯示，中山大學附屬第一醫(yī)院2016 至2020年5年間MRSA-VAN-HR 檢出率為35.5%，相比于已有報道的檢出率更高，提示MRSA對VAN 的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象愈發(fā)嚴重。

TEC 與VAN 都作為糖肽類抗生素被廣泛應(yīng)用于臨床，TEC 治療效果與VAN 相當，但還未見MRSA-TEC-HR 檢出率的相關(guān)報道。研究結(jié)果顯示本院MRSA-TEC-HR 的檢出率為59.9%，提示MRSA對TEC 有較高的異質(zhì)性耐藥水平。

SCCmec 型別與MRSA 異質(zhì)性耐藥的相關(guān)性分析中，SCCmec 型別與MRSA-TEC-HR 存在一定的相關(guān)性，相關(guān)強度偏弱。SCCmec Ⅳ型MRSATEC-HR 陽性率高達69.7%，提示相對于其它SCCmec 分型，SCCmec Ⅳ型MRSA 更容易出現(xiàn)對TEC的異質(zhì)性耐藥。SCCmec 型別與MRSA-VAN- HR不存在相關(guān)性。

綜上所述，本院臨床分離MRSA 的流行菌株可能存在以SCCmec Ⅲ型為主到以SCCmec Ⅳ型為主的轉(zhuǎn)變，SCCmec Ⅳ型MRSA 的逐漸流行提示應(yīng)注重社區(qū)環(huán)境的衛(wèi)生檢測與衛(wèi)生習慣的培養(yǎng)，防止其暴發(fā)流行。MRSA對VAN 與TEC 都存在較高的異質(zhì)性耐藥水平，有必要定期監(jiān)測MRSA耐藥性的變化用于指導臨床用藥，以避免低劑量抗生素對MRSA 的長時間無效作用。MRSA 的SCCmec 型別與MRSA對TEC 的異質(zhì)性耐藥情況存在一定的相關(guān)關(guān)系。MRSA對TEC 與VAN 異質(zhì)性耐藥的分子機制值得深入探討，以防止異質(zhì)性耐藥菌株發(fā)展為耐藥菌。