柳家翠 黃奔 程慶元 蔡偉國 段怡平 陳梁玥 馬甜甜 朱翠雯 喻明霞★

作者單位：1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院基因診斷中心，湖北，武漢430071

2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院影像科，湖北，武漢430071

肺腺癌（Lung adenocarcinoma，LUAD）是肺癌主要的組織學(xué)類型［1］。肺癌患者五年生存率僅為15%，盡管治療取得一定進(jìn)展，但生存率僅小幅提升［2］。因此，深入認(rèn)識肺癌分子發(fā)病機(jī)制，尋求有效的新型標(biāo)志物進(jìn)行分子靶向治療，對改善肺癌患者的總體生存期具有重要意義。外紡錘體極樣蛋白1（Extra spindle poles-like 1 protein，ESPL1）具有半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性，其編碼的分離酶在染色體分離和細(xì)胞分裂過程中發(fā)揮重要作用［3］。分離酶的功能是在有絲分裂后期開始時(shí)裂解黏附素，從而釋放黏附的姐妹染色單體。分離酶還參與DNA 損傷修復(fù)、膜運(yùn)輸?shù)榷喾N基本生物功能［4］。ESPL1表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控以確保許多重要細(xì)胞生物學(xué)活動的正常運(yùn)行。由于其在細(xì)胞周期和DNA 損傷修復(fù)中的重要性，ESPL1的表達(dá)異?；蛲蛔儤O可能與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，ESPL1在乳腺癌［5］、前列腺癌［6］、子宮內(nèi)膜癌［7］等腫瘤中異常表達(dá)，并影響患者預(yù)后。但是該分子在肺腺癌中的表達(dá)與臨床相關(guān)性還未有討論。因此，本研究利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中的肺腺癌樣本數(shù)據(jù)，探索ESPL1在肺腺癌中的表達(dá)、突變及預(yù)后價(jià)值，并預(yù)測ESPL1在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 原始數(shù)據(jù)的下載及預(yù)處理

檢索并下載來自TCGA 官網(wǎng)（https：//portal.gdc.cancer.gov/）的肺腺癌（LUAD）的表達(dá)譜數(shù)據(jù)（535 例腫瘤組織樣本，59 例正常組織樣本）及相應(yīng)臨床信息。使用Strawberry Perl 5.30.1 軟件將原始基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)整理成基因表達(dá)矩陣文件并整理肺腺癌患者臨床資料。

1.2 ESPL1 表達(dá)、突變與患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性分析

通過R 4.0.2 軟件中“l(fā)imma”包、“beeswarm”包提取ESPL1在肺腺癌組織樣本和正常肺組織樣本中的表達(dá)量數(shù)據(jù)并分析比較兩組的表達(dá)差異；以ESPL1在肺腺癌患者中表達(dá)值中位數(shù)為界進(jìn)一步將腫瘤組樣本分為高、低表達(dá)水平兩組。使用IBM SPSS Statistics 25.0 軟件對ESPL1表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。利用R 4.0.2 軟件“survival”包分析兩組之間總體生存率（overall survival，OS）的差異；根據(jù)下載整理的臨床病理信息，結(jié)合ESPL1表達(dá)量，研究ESPL1與年齡、性別、TNM 分期等臨床相關(guān)性。通過單因素和多因素COX 回歸分析判斷ESPL1在肺腺癌中預(yù)后價(jià)值。通過cBioportal 在線軟件分析ESPL1在TCGA 數(shù)據(jù)庫中的突變情況以及突變患者的生存率。

1.3 在線工具驗(yàn)證ESPL1 在肺腺癌預(yù)后情況

使用GEPIA 在線數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancerpku.cn/）、Kaplan Meier-plotter 在線數(shù)據(jù)庫（https：//kmplot.com/analysis/）分析ESPL1在肺腺癌中的表達(dá)與OS 的關(guān)系，詳細(xì)參數(shù)設(shè)置如下：①GEPIA 數(shù)據(jù)庫，Gene：“ESPL1”；Methods：“Overall survival”；Group Cutoff：“Median”；Dataset：“LUAD”，其他為數(shù)據(jù)庫默認(rèn)條件；②Kaplan Meier-plotter 數(shù)據(jù)庫，Gene symbol：“ESPL1”；Survival：“OS”；Probe set options：“only JetSet best probe set”；COX regression：“multivariate”；其他條件選擇數(shù)據(jù)庫默認(rèn)條件。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與基因富集分析

使用檢索相互作用基因數(shù)據(jù)庫（STRING 11.0，https：//string-db.org/）搜索工具在蛋白質(zhì)水平上分析共表達(dá)基因之間的潛在交互作用，篩選條件為：中等置信分?jǐn)?shù)＞0.95。利用Cytoscape 軟件（3.6.0 版，https：//cytoscape.org/.）對蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。使用GSEA 4.0.3 軟件對ESPL1進(jìn)行基因富集分析。以Molecular Signature Database（MsigDB）數(shù)據(jù)庫中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集作為功能基因集進(jìn)行富集分析。將ESPL1的表達(dá)水平分為高、低表達(dá)兩組。采用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法，隨機(jī)組合次數(shù)設(shè)1 000 次，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，使用Excel 將肺腺癌患者年齡、性別、TNM 分期等臨床信息進(jìn)行量化賦值，采用單因素和多因素分析采用COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，生存分析采用KM 法，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESPL1 表達(dá)差異與突變分析

在肺腺癌組織中，ESPL1表達(dá)水平高于正常肺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1A-B。cBioportal 網(wǎng)站分析結(jié)果顯示，TCGA 數(shù)據(jù)庫的516 個(gè)腫瘤樣本中有8 個(gè)發(fā)生了ESPL1突變，突變率為1.6%。見圖1C。

圖1 ESPL1 在肺腺癌組織及正常肺組織中的表達(dá)差異分析及突變情況Figure 1 Expression and mutation rate of ESPL1 in lung adenocarcinoma and normal lung tissues

2.2 ESPL1表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)性分析

ESPL1表達(dá)水平與性別和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。Stage 分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期與I 期相比，均高表達(dá)ESPL1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）見圖2A，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者組ESPL1表達(dá)量顯著高于未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2D。

表1 ESPL1 與肺腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析［n（%）］Table 1 Correlation analysis between ESPL1and clinicopathological features of lung adenocarcinoma［n（%）］

圖2 ESPL1 表達(dá)量與肺腺癌患者臨床病理特征相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis between ESPL1 expression and clinicopathological characteristics of patients with lung adenocarcinoma

2.3 ESPL1 表達(dá)、突變與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

TCGA-LUAD 數(shù)據(jù)集中，ESPL1高表達(dá)與肺腺癌患者不良預(yù)后有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3A。GEPIA 數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，ESPL1高表達(dá)組具有不良預(yù)后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=1.6，P＜0.05），見圖3B；Kaplan Meier-plotter 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果同樣顯示高表達(dá)ESPL1組肺腺癌患者OS 較差（HR=1.56，95%CI：1.37～1.77，P＜0.05），見圖3C；cBioportal 分析結(jié)果顯示發(fā)生ESPL1基因突變組生存率較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3D。

圖3 ESPL1 在肺腺癌中的預(yù)后作用Figure 3 Prognosis of ESPL1in lung adenocarcinoma

2.4 單因素和多因素COX 回歸分析

stage 分期（HR=1.473，95%CI：1.196-1.814，P＜0.05）和ESPL1表達(dá)（HR=1.122，95%CI：1.014～1.241，P＜0.05）可以作為肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。見表2。

表2 單因素和多因素COX 回歸分析Table 2 Univariate and multivariate COX regression analysis

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與GSEA 富集分析

共表達(dá)基因預(yù)測結(jié)果顯示KIF18B 是與ESPL1相關(guān)性最強(qiáng)的基因（spearman 相關(guān)系數(shù)為0.92，P＜0.05），見圖4A，與ESPL1共表達(dá)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖4B。GSEA 結(jié)果顯示ESPL1主要富集在細(xì)胞周期、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、堿基切除修復(fù)以及Wnt 信號通路等。見圖4C。

圖4 ESPL1 的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及GSEA 功能富集分析Figure 4 PPI network construction of ESPL1 and GSEA functional enrichment analysis

3 討論

染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的正常是細(xì)胞正常存活和維持細(xì)胞后代遺傳穩(wěn)定性必不可少的基本條件。研究表明［8］，染色體的錯(cuò)誤分離會導(dǎo)致DNA 損傷以及非整倍體的產(chǎn)生而這些改變將會導(dǎo)致包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病的發(fā)生。而ESPL1基因表達(dá)的分離酶就是一種在細(xì)胞有絲分裂中促使姐妹染色單體分離從而防止染色體發(fā)生內(nèi)聚的酶，目前研究較多并且與ESPL1具有顯著相關(guān)性的KIF18B是驅(qū)動蛋白8 家族的成員，與微管運(yùn)動有關(guān)，和ESPL1一樣在細(xì)胞有絲分裂中發(fā)揮重要作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)在特異性誘導(dǎo)乳腺高表達(dá)ESPL1的轉(zhuǎn)基因小鼠［10-11］中發(fā)生了乳腺腫瘤并且導(dǎo)致了非整倍體的產(chǎn)生。Mukherjee［12］與Shepard［13］等人發(fā)現(xiàn)了在斑馬魚和小鼠的早期致死胚胎存在ESPL1的純合缺失，說明ESPL1的基因突變可能對機(jī)體產(chǎn)生致死性嚴(yán)重影響。由ESPL1在細(xì)胞周期以及DNA 損傷修復(fù)中的重要作用來看，研究其在肺腺癌腫瘤病人的表達(dá)以及突變情況，為深入了解患者發(fā)病機(jī)制以及尋找相應(yīng)治療靶點(diǎn)具有十分重要意義。

本研究結(jié)合多種生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)，ESPL1在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。研究表明，發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的特定抑制途徑或分子靶點(diǎn)是阻滯腫瘤進(jìn)展以及減輕副作用的最具前景方法［14］。ESPL1有潛力成為腫瘤治療中具有吸引力的分子靶點(diǎn)。目前，分離酶在多種腫瘤中過表達(dá)并參與腫瘤相關(guān)調(diào)控通路，比如，據(jù)報(bào)道約四分之一過度表達(dá)分離酶的乳腺癌是p53 功能改變的Luminal-B 亞型［15］。因此，抑制分離酶活性的藥物等抑制劑可為腫瘤治療提供新思路。另外，Zhang 等［16］已經(jīng)篩選出Sepin-1 作為分離酶靶點(diǎn)，Sepin-1 能夠抑制三陰性乳腺癌異種移植瘤生長，并且Sepin-1 的敏感性與腫瘤中ESPL1表達(dá)水平呈正相關(guān)。由此，可以通過檢測ESPL1在腫瘤病人的表達(dá)量并進(jìn)行表達(dá)和突變分析，以作為是否滿足使用分子抑制劑的使用條件，從而實(shí)現(xiàn)對患者的個(gè)體化治療。

綜上所述，ESPL1在肺腺癌中表達(dá)明顯上調(diào)，且具有一定突變率。該基因的過表達(dá)與突變均與肺腺癌患者的惡性進(jìn)展及不良預(yù)后有關(guān)。ESPL1有望成為腫瘤治療的新型分子標(biāo)志物。