趙彩良，常 璐，呂運(yùn)韜，張 潔，董靜靜，劉世芳，賈小云

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801；3.臨沂市河?xùn)|區(qū)湯泉高級中學(xué)，山東臨沂 276027）

甘薯（Ipomoea batatas（L.）Lam）塊根富含多種營養(yǎng)成分如維生素、蛋白質(zhì)以及花青素、類胡蘿卜素等，是重要的糧食作物。甘薯的種植具有操作簡單、成本低、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，其產(chǎn)量僅次于水稻、小麥和玉米[1]。

花青素屬于類黃酮物質(zhì)，是一種水溶性的可食用色素，存在于植物液泡中且在不同pH 條件下呈現(xiàn)粉色、紅色、藍(lán)色、紫色等顏色[2]?；ㄇ嗨夭粌H可以幫助植物抵抗不良的外界環(huán)境、吸引昆蟲傳播花粉，還在人類的醫(yī)療保健方面發(fā)揮著重要作用，如具有抗氧化、抗癌、預(yù)防心血管疾病等功能[3-5]?；ㄇ嗨氐纳锖铣墒艿蕉喾N因素的調(diào)節(jié)，包括結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、環(huán)境因子（光照、溫度、糖、激素、pH、干旱、肥料、病害等）以及microRNA 等。結(jié)構(gòu)基因是指編碼花青素生物合成途徑中的酶基因，包括CHS（查爾酮合成酶）、CHI（查爾酮異構(gòu)酶）、F3H（黃烷酮-3-羥化酶）、DFR（二羥基黃酮醇還原酶）、ANS（花色素合成酶）和UFGT（類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶）等。調(diào)節(jié)基因主要包括MYB、bHLH 和WD40 三類轉(zhuǎn)錄因子，它們通過形成MBW 復(fù)合體來參與調(diào)控花青素的生物合成。近年來也發(fā)現(xiàn)許多其他類型的轉(zhuǎn)錄因子參與了花青素生物合成的調(diào)控，包括NAC、WRKY、AP2、SPL等。楊慧珍[6]研究表明，IbANS 在紫色甘薯的塊根、莖和葉中的表達(dá)量均顯著高于白色甘薯，可能參與花青素的合成。CHU 等[7]研究表明，過表達(dá)IbMYB1 的轉(zhuǎn)基因擬南芥中花青素的含量上升且花青素合成相關(guān)基因CHI、F3′H、DFR 的表達(dá)量均上調(diào)。DONG等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，甘薯IbWD40 的表達(dá)量隨花青素的積累而升高。目前有關(guān)甘薯花青素的研究主要集中在MBW 復(fù)合體的調(diào)控機(jī)制上，而關(guān)于甘薯WRKY 轉(zhuǎn)錄因子對花青素調(diào)控的研究鮮有報道。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的N 端含有保守基序?yàn)閃RKYGQK 的WRKY 保守結(jié)構(gòu)域，C 端含有C2H2或C2HC 鋅指結(jié)構(gòu)[9-10]。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子一般通過與基因啟動子中的W-Box 作用元件特異結(jié)合而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控植物的生長發(fā)育過程[10]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和特征，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可分為GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ等3 類，Group I 有2 個結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2；GroupⅡ和GroupⅢ均只有1 個結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)分別為C2H2和C2HC。根據(jù)WRKY 結(jié)構(gòu)域外的其他保守結(jié)構(gòu)基序，GroupⅢ成員可進(jìn)一步分為IIa、IIb、IIc、IId 和IIe 等5 個亞類[9]。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育、新陳代謝、脅迫響應(yīng)及次生代謝中具有重要作用。擬南芥AtWRKY44 在毛狀體形成、花青素積累、種子色素沉著、胚乳發(fā)育、種子大小和根部有無毛細(xì)胞分化等生長發(fā)育進(jìn)程中均發(fā)揮作用[11-15]。HAN 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，GI-miRNA172E-AtWRKY44調(diào)控?cái)M南芥的糖信號通路從而加速植株開花。王熙然[17]在草莓中過表達(dá)FaWRKY44 后，果實(shí)中花青素含量顯著上升，原花青素含量下降；而減低表達(dá)FaWRKY44 后，花青素含量顯著下降，原花青素含量顯著上升。CHENG 等[18]在紅火龍果中研究發(fā)現(xiàn)，HpWRKY44 通過與HpCytP450-like1 啟動子中的W-Box 元件結(jié)合而激活其表達(dá)，二者在果實(shí)著色過程中含量逐步增加。楊樹等[19]研究發(fā)現(xiàn)，丹參SmTTG2（SmWRKY44）的表達(dá)量隨著花和種子的發(fā)育逐漸升高，推測其參與丹參種子的發(fā)育及萌發(fā)過程。PENG等[20]研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃的AcWRKY44 和AcMYBC1在煙草葉片中瞬時過表達(dá)會促進(jìn)煙草葉片積累花青素，但在獼猴桃愈傷組織中穩(wěn)定過表達(dá)后會促使F3′5′H 和原花青素合成相關(guān)基因及原花青素含量升高，說明AcWRKY44 和AcMYBC1 在平衡花青素與原花青素的含量方面具有重要作用。煙草NtTTG2 通過調(diào)控NtARF8、NtARF17 和NtARF19進(jìn)而影響煙草的生長發(fā)育[21]。目前尚未見到關(guān)于甘薯IbWRKY44 功能研究的相關(guān)報道。紫心甘薯塊根富含花青素，是研究植物地下器官中花青素生物合成調(diào)控機(jī)制的理想材料。

本研究從紫心甘薯塊根中克隆了IbWRKY44，通過生物信息學(xué)分析和表達(dá)特性分析，初步探究了IbWRKY44 在花青素生物合成中的作用，并且成功構(gòu)建了融合表達(dá)載體，為深入解析甘薯IbWRKY44在甘薯塊根中花青素合成調(diào)控機(jī)制的研究提供參考依據(jù)，對培育富含花青素的甘薯新品種具有重要的理論和指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紫心甘薯有徐紫薯3 號（XZS-3）、徐紫薯8 號（XZS-8）和寧紫薯4 號（NZS-4），白心甘薯有徐薯18 號（XS-18）和薯綠1 號（SL-1），淡黃心品種高系14（GX-14），均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院徐州甘薯研究中心提供，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)甘薯基地。本氏煙草（Nicotiana benthamiana Domin.）和Columbia型野生擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，擬南芥T-DNA 插入突變體種子（SALK-206852C 和SALK-204777C）購自AraShare 網(wǎng)站（www.arashare.cn）。煙草和擬南芥植株種植于人工氣候培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為溫度26 ℃，光照16 h（光照強(qiáng)度125 mmol/（m2·s）），黑暗8 h，濕度50%。

大腸桿菌菌株DH5α 和農(nóng)桿菌菌株GV3101均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 RNA 的提取與cDNA 的合成

取種植90 d 的XZS-3、XZS-8、NZS-4、XS-18、SL-1 和GX-14 的塊根，液氮研磨后用RNAiso Plus試劑提取RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白檢測儀NanoDrop 2000C（Thermo Scientifc）檢測RNA 的完整性和質(zhì)量后，按照TAKARA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。

1.3 IbWRKY44 基因的克隆

通過分析山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院賈小云課題組白心甘薯和紫心甘薯塊根的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，找到在紫心甘薯中高表達(dá)而在白心甘薯中低表達(dá)的序列（Tai6.25536.1），經(jīng)序列同源性比對，與擬南芥AtWRKY44 的相似性最高，命名為IbWRKY44。設(shè)計(jì)含有KpnⅠ（GGTAC|C）和SalⅠ（G|TCGAC）酶切位點(diǎn)的克隆引物（IbWRKY44-PF-KpnⅠ：GGGGTACC TTGAAGATGGAGATCAAAGAG；IbWRKY44-PRSalⅠ：GCGTCGACCCATCTCGGTTTTTGTCTG-AT），以XZS-3 塊根的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后與克隆載體PMD19-T 相連，獲得重組質(zhì)粒PMD19-T-IbWRKY44，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，在含氨芐青霉素（Amp）的固體培養(yǎng)基上挑選克隆進(jìn)行PCR 鑒定，提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA后送上海生物工程有限公司（中國，上海）測序。

1.4 IbWRKY44 的生物信息學(xué)分析

通過在線軟件對IbWRKY44的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，所用網(wǎng)址如表1 所示。

表1 IbWRKY44 序列分析所用網(wǎng)址及功能

1.5 IbWRKY44 的系統(tǒng)進(jìn)化分析

下載PlantTFDB 中注釋明確的擬南芥的69 個WRKY 家族成員的氨基酸序列，與IbWRKY44 的氨基酸序列利用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。同時，將NCBI 中與IbWRKY44 氨基酸序列相似度較高的牽?；ā⒎?、大豆等12 個物種的WRKYs 序列和IbWRKY44 利用DNAMAN 和MEGA 軟件分別進(jìn)行多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.6 IbWRKY44 啟動子的順式作用元件分析

在甘薯基因組數(shù)據(jù)庫（https://ipomoea-genome.org/）中比對獲得IbWRKY44 基因的DNA 序列。下載IbWRKY44 基因起始密碼子ATG 上游1 600 bp的序列，通過PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/search_CARE.html）進(jìn)行啟動子順式作用元件分析。

1.7 IbWRKY44 的表達(dá)模式分析

根據(jù)IbWRKY44 的序列設(shè)計(jì)定量引物：qRTPCR-IbWRKY44-PF：CACCGTGCTATCCCGTTACA；qRT-PCR-IbWRKY44-PR：GCCTTCTGCCTCCAAT CCTT。以XZS-3、XZS-8、NZ-4、XS-18、SL-1 和GX-14 塊根的cDNA 為模板，運(yùn)用BIO-RAD CFX 96 熒光定量儀對IbWRKY44 基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，IbActin 為內(nèi)參基因，每個樣品設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCt法，運(yùn)用SPSS Statistics v23 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

1.8 IbWRKY44 融合表達(dá)載體的構(gòu)建

將測序得到的IbWRKY44 序列去除終止密碼子后設(shè)計(jì)帶有SalⅠ酶切位點(diǎn)的后引物IbWRKY44-2PR-Sal Ⅰ：GCGTCGACTGATTTTTCCTTTGTGGC。以PMD19-T-IbWRKY44 質(zhì)粒DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物和pCAMBIA1300-GFP 表達(dá)載體分別用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切，回收目的片段，T4 DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α，挑選在添加卡那霉素（Kan）的LB 固體培養(yǎng)基上生長的克隆進(jìn)行PCR 鑒定。提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA，用KpnⅠ和SalⅠ對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，獲得35S：：IbWRKY44：：GFP 融合表達(dá)載體，4 ℃保存待用。

1.9 IbWRKY44 的煙草亞細(xì)胞定位

將空載體pCAMBIA1300-GFP 和構(gòu)建好的35S：：IbWRKY44：：GFP 融合表達(dá)載體分別通過熱激法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101 中，挑取在含有50 μg/mLKan 和50 μg/mL 利福平（Rif）的固體LB培養(yǎng)基上的克隆，經(jīng)PCR 鑒定為陽性克隆后（35SF：GACGCACAATCCCACTATCC 和 IbWRKY44-2PR-SalⅠ），于50 mL 相應(yīng)液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)至OD600為0.6，4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，棄上清收集菌體，用含有10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸（MES）和100 μmol/L 乙酰丁香酮（AS）的懸浮液重懸菌體至OD600為0.2，室溫孵育4 h 后注射長勢一致的28 d 煙草葉片，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d后撕取注射部位葉片，經(jīng)1 μg/mL 的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色5 min 后在Leica 熒光正置顯微鏡488 nm 的波長下觀察綠色熒光。亞細(xì)胞定位的預(yù)測根據(jù)表1 所列網(wǎng)址進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 IbWRKY44 基因的克隆

以XZS-3 塊根cDNA 為模板獲得的PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后條帶單一，大小約為1 400 bp，純化回收后與PMD19-T 克隆載體連接，得到的菌落PCR 檢測條帶也單一，且大小一致，約1 400 bp（圖1）。陽性菌落提取的質(zhì)粒DNA 經(jīng)測序后，得到長度為1 401 bp 的IbWRKY44 基因的ORF序列。

2.2 IbWRKY44 序列的生物信息學(xué)分析

SMART 網(wǎng)站對保守結(jié)構(gòu)域的分析顯示，Ib-WRKY44 的氨基酸序列中含有2 個WRKY 保守結(jié)構(gòu)域和2 個C2H2的鋅指結(jié)構(gòu)，共466 個氨基酸（圖2）。ProtParam 分析顯示，IbWRKY44 蛋白的預(yù)測分子質(zhì)量為51 083.08 u，分子式為C2192H3518N654O717S18，總原子數(shù)為7099，等電點(diǎn)為9.31，脂溶性指數(shù)為53.99，不穩(wěn)定系數(shù)為47.63，表明IbWRKY44 蛋白為堿性不穩(wěn)定蛋白。NetPhos 分析顯示，IbWRKY44存在67 個磷酸化修飾位點(diǎn)，其中，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)有40 個，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)有23 個，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)有4 個（圖3-A）。NetNGlyc 分析表明，IbWRKY44 在第36、64、266 個氨基酸位點(diǎn)的天冬酰胺可能存在3 個糖基化位點(diǎn)（圖3-B）。ProtScale分析結(jié)果表明，IbWRKY44蛋白的氨基酸分值介于-2.822～1.511 之間，且疏水區(qū)域的面積明顯大于親水區(qū)域，表明IbWRKY44蛋白為疏水性蛋白（圖3-C）。信號肽分析結(jié)果顯示，IbWRKY44蛋白沒有信號肽。TMHMM 分析結(jié)果表明，IbWRKY44 蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域（圖3-D）。Wolf Psort Prediction 結(jié)果顯示，IbWRKY44定位于細(xì)胞核內(nèi)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，IbWRKY44蛋白主要由α-螺旋（15.24%）、β折疊（3.65%）、無規(guī)則卷曲（70.39%）和延伸鏈（10.73%）組成（圖3-E）。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有典型的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的4β 折疊結(jié)構(gòu)（圖3-F）。

2.3 IbWRKY44 的系統(tǒng)進(jìn)化分析與多序列比對

采用鄰接法構(gòu)建IbWRKY44 與69 個擬南芥WRKYs 蛋白的進(jìn)化樹，結(jié)果顯示（圖4），Ib-WRKY44 與擬南芥AtWRKY44 聚為一支。利用DNAMAN 軟件對IbWRKY44 與12 個物種的WRKY44 氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示，序列相似度為61.38%，均含有2 個WRKY 結(jié)構(gòu)域，且鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2（圖5）；物種間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系顯示，IbWRKY44 與同為旋花科的甘薯二倍體ItWRKY44 和牽牛InWRKY44 親緣關(guān)系最近，與葡萄VvWRKY44 親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖6）。

2.4 IbWRKY44 啟動子的順式作用元件分析

通過在線軟件PlantCARE 分析IbWRKY44 上游1 600 bp 啟動子序列的順式作用元件，結(jié)果顯示，序列中除含有TATA-box 和CAAT-box 等啟動子基礎(chǔ)元件外，還含有G-Box、GT1-motif、MRE 等光響應(yīng)元件，脫落酸響應(yīng)元件ABRE，乙烯響應(yīng)元件ERE 等元件，以及MYC、MYB、AP1 等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)（表2）。

表2 IbWRKY44 啟動子的順式作用元件分析

2.5 IbWRKY44 的表達(dá)特性分析

IbWRKY44 在3 個紫心甘薯XZS-3、XZS-8 和NZS-4 和3 個非紫心甘薯XS-18、SL-1 和GX-14的塊根中的表達(dá)量有顯著差異。從圖7 可以看出，IbWRKY44 在不同甘薯品種中均表達(dá)，但在紫心甘薯中的表達(dá)量顯著高于非紫心甘薯，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。

2.6 IbWRKY44 表達(dá)載體的構(gòu)建

以PMD19-T-IbWRKY44 質(zhì)粒DNA 為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物和pCAMBIA1300-GFP 表達(dá)載體經(jīng)KpnⅠ和SalⅠ雙酶切，連接后轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α，提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA，用KpnⅠ和SalⅠ對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（圖8），酶切獲得2 條預(yù)期條帶，一條為pCAMBIA1300-GFP 載體片段，另一條目的條帶與IbWRKY44 基因的PCR 產(chǎn)物大小一致，表明Ib－WRKY44 序列已連接到pCAMBIA1300-GFP 過表達(dá)載體，命名為35S：：IbWRKY44：：GFP 融合表達(dá)載體。

2.7 IbWRKY44 的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位的預(yù)測結(jié)果顯示，IbWRKY44 基因位于細(xì)胞核。為驗(yàn)證這一結(jié)果，本研究注射煙草葉片進(jìn)行瞬時表達(dá)，觀察GFP 熒光部位。將DAPI 染色后的煙草葉片撕取表皮細(xì)胞，在488 nm 波長下觀察綠色熒光。由圖9 可知，轉(zhuǎn)化空載（pCAMBIA1300-GFP）的葉片細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜及細(xì)胞核中都存在綠色熒光，而轉(zhuǎn)化融合表達(dá)載體（35S：：IbWRKY44：：GFP）的葉片表皮細(xì)胞只在細(xì)胞核中有綠色熒光，表明IbWRKY44 蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，與預(yù)測結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與植物花青素及其他次生代謝物的合成，大麥HvWRKY23 可以與花青素合成通路基因HvPAL2、HvCHS1 的啟動子結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)花青素的合成[22]。YU 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，丹參中SmWRKY1、SmWRKY7、SmWRKY19、SmWRKY29、SmWRKY45、SmWRKY52、SmWRKY56、SmWRKY58和SmWRKY68 可能參與酮和酚酸的合成。同時，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在脅迫響應(yīng)方面也發(fā)揮著重要作用，WEI 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，GmWRKY54 通過激活轉(zhuǎn)基因大豆ABA 和Ca2+信號通路的基因從而提高植物的抗旱性。張鵬飛[25]在棉花中發(fā)現(xiàn)，枯萎病原菌和SA、ETH、JA 等激素的誘導(dǎo)能夠激活GhWRKY75基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物對枯萎病的抗性。趙曾強(qiáng)等[26]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)GhWRKY44 的煙草在枯萎病菌的侵染下能夠激活抗病相關(guān)基因的表達(dá)。此外，大量的研究還表明，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物的生長發(fā)育和衰老進(jìn)程。ZHENG 等[27]在蘋果中發(fā)現(xiàn)，MdWRKY9 通過抑制油菜素類固醇MdDWF4的轉(zhuǎn)錄，從而減少矮化調(diào)控因子油菜素類固醇的產(chǎn)生。擬南芥AtWRKY75 通過抑制下游基因的表達(dá)來調(diào)控根毛的發(fā)育[28]。

本試驗(yàn)從XZS-3 的塊根中克隆到IbWRKY44，其ORF 序列長度為1 401 bp，編碼的蛋白屬于GroupⅠ家族，鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2，含有2 個WRKY結(jié)構(gòu)域。IbWRKY44序列中含有67 個磷酸化位點(diǎn)和3 個糖基化位點(diǎn)，表明IbWRKY44 蛋白可能在蛋白激酶或糖基化作用的調(diào)控下，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期等方面發(fā)揮作用。本試驗(yàn)預(yù)測的IbWRKY44蛋白的三級結(jié)構(gòu)中包括4 個β 折疊，與WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的空間結(jié)構(gòu)相符。IbWRKY44的煙草亞細(xì)胞定位表明，該基因編碼的蛋白位于細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能。IbWRKY44與擬南芥WRKY 家族的AtWRKY44 親緣關(guān)系最近，在物種間的進(jìn)化關(guān)系上與同屬旋花科的甘薯二倍體三葉裂薯ItWRKY44和牽牛InWRKY44 的親緣關(guān)系最近，表明IbWRKY44可能具有與AtWRKY44、ItWRKY44 和InWRKY44相似的功能。多序列比對結(jié)果表明，IbWRKY44與其他物種的WRKY44 均含有2 個WRKY 結(jié)構(gòu)域，屬于Ⅰ類轉(zhuǎn)錄因子。

IbWRKY44 的啟動子序列中包含脫落酸、乙烯、厭氧和光響應(yīng)誘導(dǎo)元件，表明脫落酸、乙烯、厭氧和光誘導(dǎo)響應(yīng)機(jī)制中的相關(guān)因子可被IbWRKY44 的啟動子激活或抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，從而在植物的生長發(fā)育或在對環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮作用；包含調(diào)節(jié)胚乳發(fā)育的元件，推測IbWRKY44 參與調(diào)控植物胚乳的發(fā)育，且調(diào)控機(jī)制可能與擬南芥AtWRKY44 類似；還含有AP1、MYB 和MYC 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，說明IbWRKY44 還可能受AP1、MYB 和MYC 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

基因表達(dá)特性分析結(jié)果顯示，IbWRKY44 在紫心甘薯塊根中的表達(dá)量顯著高于非紫心甘薯，表明IbWRKY44 可能正調(diào)控甘薯塊根中花青素的合成。該結(jié)果為解析甘薯IbWRKY44 的功能提供了理論基礎(chǔ)，豐富了甘薯花青素合成的潛在調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，同時為紫心甘薯的分子育種提供了新的研究思路。為了深入研究IbWRKY44 在花青素合成中的功能及挖掘其他功能，后期將對構(gòu)建好的35S：：IbWRKY44：：GFP 過表達(dá)載體進(jìn)行擬南芥的轉(zhuǎn)化，篩選得到T3純合且IbWRKY44 高表達(dá)的植株，并測定轉(zhuǎn)基因植株中花青素的含量與花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)量；構(gòu)建CRISPR-IbWRKY44 敲除表達(dá)載體，將其與35S：：IbWRKY44：：GFP 過表達(dá)載體分別進(jìn)行甘薯懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，對得到的轉(zhuǎn)基因甘薯苗進(jìn)行基因?qū)用娴蔫b定及表型觀察，移至試驗(yàn)田中獲得薯塊，對薯塊進(jìn)行表型觀察及測序分析。同時，篩選與IbWRKY44互作的蛋白，研究其作用機(jī)制。