王麗華，陸葉飛，陸以靜，劉言龍，李杰勤

（安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院，安徽鳳陽(yáng) 233100）

高丹草作為高粱×蘇丹草雜交種（Sorghum bicolor×Sorghum sudanense），是一種以收獲莖稈、葉片為主的飼用作物[1]。我國(guó)高丹草遺傳研究從20 世紀(jì)90 年代陳才夫等[2]開(kāi)始蘇丹草×擬高粱種間雜種的細(xì)胞學(xué)分析，到現(xiàn)在多個(gè)遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及性狀定位等[3-5]，已取得了一些成就。

株高、穗長(zhǎng)、分蘗、莖粗、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量等性狀是與產(chǎn)量緊密相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀，這些性狀的QTL（Quantitative Trait Locus）定位已在水稻[6]、玉米[7]、小麥[8]、大豆[9]、油菜[10]、高粱[11]、花生[12]等作物中有相關(guān)研究，但高丹草相關(guān)農(nóng)藝性狀QTL 定位研究較少，于肖夏等[13]以170 個(gè)F2單株為作圖群體，利用50 對(duì)SSR 引物構(gòu)建了高丹草分子遺傳圖譜，并對(duì)莖粗、葉寬等8 個(gè)性狀進(jìn)行QTL定位。石悅等[3-4]利用305 個(gè)F2分離單株和444 個(gè)AFLP 標(biāo)記構(gòu)建了高丹草分子遺傳圖譜，并對(duì)莖粗、葉片數(shù)、分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀進(jìn)行了QTL 定位分析。房永雨等[5]利用高丹草F2分離群體構(gòu)建了包含284 個(gè)AFLP 標(biāo)記的分子遺傳圖譜，并對(duì)氫氰酸、單株干質(zhì)量、株高等10 個(gè)性狀進(jìn)行QTL 定位分析。LU 等[14]利用248 株F2∶3單株構(gòu)建了包含178 個(gè)標(biāo)記（170 個(gè)AFLP，8 個(gè)RAPD）的高丹草分子遺傳圖譜，并對(duì)株高、莖粗、葉片數(shù)等10 個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行QTL定位。

本研究利用在親本間具有多態(tài)性的138 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)株高、莖粗、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)、單株鮮質(zhì)量、單株干質(zhì)量6 個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行QTL 定位，構(gòu)建高丹草RIL 群體遺傳圖譜，對(duì)高丹草分子標(biāo)記輔助選擇育種具有指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以高粱不育系Tx623A 為母本、蘇丹草恢復(fù)系Sa為父本[15]和雜交F9的126 個(gè)RIL 群體為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在安徽省鳳陽(yáng)縣安徽科技學(xué)院進(jìn)行。于2018 年5 月20 日種植，小區(qū)采用隨機(jī)區(qū)組排列，種植密度為50 cm×25 cm，每行10 株，3 次重復(fù)，常規(guī)田間管理。

1.2.1 農(nóng)藝性狀測(cè)定 植株成熟后親本和126 個(gè)RIL 群體株系分別隨機(jī)選取5 株測(cè)定株高、莖粗、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量[16]。

1.2.2 DNA 提取和SSR 標(biāo)記分析 采用SDS（十二烷基硫酸鈉）法[17]提取父母本（各2 株）和126 株RIL群體株系的植株葉片，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的1050 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)親本進(jìn)行多態(tài)性篩選。PCR 反應(yīng)體系如表1 所示，PCR 程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min 結(jié)束。利用濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。銀染后讀膠，母本帶型記作“1”，父本帶型記作“2”，雜合帶型記作“3”，缺失記作“-”。

表1 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)Joinmap 4.0 軟件來(lái)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。第一步：建立數(shù)據(jù)文件，將Loc 文件轉(zhuǎn)到Joinmap 狀態(tài)下。第二步：利用LOD Groupings 命令分組，LOD 值默認(rèn)為2～10。使用Greate Groups for mapping 命令作圖，通過(guò)Kosambi 函數(shù)計(jì)算遺傳圖譜的距離[18]，使用QTL IciMapping 4.0 軟件定位產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL 位點(diǎn)。QTL 命名方法：q+性狀英文首字母+所在染色體。

2 結(jié)果與分析

2.1 RIL 群體6 個(gè)農(nóng)藝性狀表型值分布特征

對(duì)親本和RIL 群體的6 個(gè)農(nóng)藝性狀表型進(jìn)行比較分析（表2），RIL 群體的平均株高為（133.92±48.05）cm，高于母本Tx623A 的株高，但低于父本株高和雙親平均株高；莖粗的平均值為（14.72±2.58）mm，遠(yuǎn)低于母本Tx623A，且低于雙親莖粗的平均值；單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量均低于雙親的單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量；穗長(zhǎng)低于雙親穗長(zhǎng)均值；分蘗數(shù)高于母本Tx623A，但遠(yuǎn)低于雙親分蘗數(shù)均值。株高、莖粗、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量6 個(gè)農(nóng)藝性狀的偏度和峰度都不大，均呈連續(xù)性正態(tài)分布，適合進(jìn)行QTL 定位分析。

表2 RIL 群體及親本農(nóng)藝性狀的測(cè)定結(jié)果

2.2 RIL 群體農(nóng)藝性狀相關(guān)性分析

對(duì)6 個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明（表3），除莖粗外，株高、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)與其他4 個(gè)性狀均呈極顯著正相關(guān)。株高和單株鮮質(zhì)量、單株干質(zhì)量、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)均呈極顯著正相關(guān)，其中，株高與單株鮮質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)最大（r＝0.645）；單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)呈極顯著正相關(guān)，其中，單株鮮質(zhì)量與單株干質(zhì)量相關(guān)系數(shù)最大（r＝0.571）；單株干質(zhì)量和穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)呈極顯著正相關(guān)。莖粗和株高、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)呈負(fù)相關(guān)。

表3 RIL 群體6 個(gè)農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析

2.3 RIL 群體的分子遺傳圖譜構(gòu)建

用1 050 個(gè)SSR 標(biāo)記進(jìn)行親本間的多態(tài)性篩選。經(jīng)鑒定共有192 對(duì)引物能擴(kuò)增出清晰的條帶且在2 個(gè)親本間表現(xiàn)多態(tài)，多態(tài)性比例為18.29%。以篩選出的多態(tài)性引物對(duì)RIL 群體進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和檢測(cè)（圖1），其中138 對(duì)引物成功用于構(gòu)建連鎖圖譜。構(gòu)建的遺傳圖譜總長(zhǎng)度為1 606.7 cM，標(biāo)記間平均距離為11.6 cM（圖2）。1 號(hào)染色體上的標(biāo)記最多，共有31 個(gè)；9 號(hào)染色體上的標(biāo)記最少，僅有6 個(gè)。

2.4 重要農(nóng)藝性狀的QTL 分析

由表4 可知，本研究共檢測(cè)到60 個(gè)QTL 位點(diǎn)，解釋14.05%～68.58%的表型差異。其中，控制株高的QTL 位點(diǎn)有4 個(gè)，分別位于4、5、6 號(hào)染色體上，可以解釋24.75%～33.59%表型變異，LOD 值為4.56～5.60；qPH-5 位于5 號(hào)染色體，定位于S59-GS321 之間，其加性效應(yīng)為正值（5.47），表型貢獻(xiàn)率為27.02%，其他位點(diǎn)加性效應(yīng)均為負(fù)值?？刂扑腴L(zhǎng)的QTL 位點(diǎn)有27 個(gè)，單個(gè)QTL 解釋14.05%～68.58%表型變異，LOD 值為4.57～31.73。qEL-1 位于1 號(hào)染色體，定位于GS53-GS93 之間，加性效應(yīng)為正值，表型貢獻(xiàn)率為68.58%；qEL-5 位于5 號(hào)染色體，定位于S15-S56 之間，加性效應(yīng)為正值（11.88），表型貢獻(xiàn)率為29.40%?？刂品痔Y數(shù)的QTL 位點(diǎn)有1 個(gè)，位于5 號(hào)染色體，定位于S15-S56 之間，該位點(diǎn)表現(xiàn)出負(fù)加性效應(yīng)，表型貢獻(xiàn)率為30.39%?？刂茊沃牾r質(zhì)量的QTL 位點(diǎn)有13 個(gè)，單個(gè)QTL 解釋17.69%～36.40%表型變異，LOD 值為4.52～8.18。控制單株干質(zhì)量的QTL 位點(diǎn)有15 個(gè)，單個(gè)QTL 解釋20.32%～30.48%表型變異，LOD 值為5.15～9.77，單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量均表現(xiàn)負(fù)加性效應(yīng)。未檢測(cè)到控制莖粗的QTL 位點(diǎn)。

表4 RIL 群體的QTL 分析

續(xù)表4

更重要的是，8 個(gè)QTL 位點(diǎn)同時(shí)控制多個(gè)農(nóng)藝性狀。5 號(hào)染色體的S15-S56 區(qū)間控制穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)、單株干質(zhì)量和單株鮮質(zhì)量。3 號(hào)染色體的S248-S9 區(qū)間控制穗長(zhǎng)、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量。3 號(hào)染色體的S250-S11 區(qū)間、8 號(hào)染色體的TXP354-RAD8-4 區(qū)間、10 號(hào)染色體的S79-TXP129 區(qū)間，均控制穗長(zhǎng)和單株干質(zhì)量。1 號(hào)染色體的GS57-TXP204 區(qū)間控制單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量。5 號(hào)染色體的S56-GS325 區(qū)間控制株高和穗長(zhǎng)。6 號(hào)染色體的S236-TXP104 區(qū)間控制株高和單株鮮質(zhì)量。

3 結(jié)論與討論

皖草3 號(hào)是由母本高粱不育系Tx623A 和父本恢復(fù)系蘇丹草Sa 雜交而成，它既有高粱抗旱、耐澇、耐鹽堿和產(chǎn)量高的特征，又有蘇丹草適口性好、抗逆性強(qiáng)、分蘗能力強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的特點(diǎn)[19]。皖草3 號(hào)根系發(fā)達(dá)，莖稈粗壯，穗形松散，草質(zhì)柔軟，氰化物含量低，單株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，適應(yīng)范圍廣，是通過(guò)全國(guó)牧草品種審定委員會(huì)審定的品種[15]，在農(nóng)區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中具有很好的應(yīng)用前景[20]。

SSR 標(biāo)記因其數(shù)量豐富，提供信息量大等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建與目標(biāo)基因定位等研究中[18，21-23]。利用SSR 標(biāo)記構(gòu)建高粱遺傳圖譜及QTL定位已有成功應(yīng)用，董維等[24]利用T70×P607 雜交F6的RIL 群體和81 對(duì)SSR 標(biāo)記構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，并在第1、2、4、5、6 號(hào)染色體上檢測(cè)到7 個(gè)與分蘗數(shù)相關(guān)的QTL。王成等[25]利用63 對(duì)SSR 標(biāo)記和TAM428×Tx622B 的220 個(gè)F2單株構(gòu)建了高粱抗蚜性狀的遺傳連鎖圖，并發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)主效QTL。盧峰等[26]利用98 個(gè)SSR 標(biāo)記和28 個(gè)INDEL 標(biāo)記，定位了19 個(gè)與甜高粱莖汁混合錘度、莖稈質(zhì)量和出汁率性狀的相關(guān)QTL。但高丹草作為一種優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的牧草，利用SSR 標(biāo)記進(jìn)行高丹草遺傳圖譜構(gòu)建和QTL 定位的相關(guān)研究很少，于肖夏等[13]利用50 對(duì)SSR 引物建立了包含10 個(gè)連鎖群，總長(zhǎng)度為803.13 cM的高丹草遺傳連鎖圖；石悅等[27]利用10 對(duì)SSR 引物和11 對(duì)SRAP 引物構(gòu)建了包括10 個(gè)連鎖群，總長(zhǎng)度為1 273.4 cM的遺傳連鎖圖。本研究利用138 對(duì)SSR 引物對(duì)Tx623A、Sa雜交的F9126 個(gè)RIL 群體構(gòu)建的高丹草遺傳連鎖圖譜包含10 個(gè)連鎖群，總長(zhǎng)度為1 606.7 cM，標(biāo)記間平均距離為11.6 cM的高丹草遺傳圖譜，共定位了60 個(gè)與株高、莖粗、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量相關(guān)的QTL。

其中控制株高的QTL 主要分布于4、5、6 號(hào)染色體上，與于肖夏等[13]和LU 等[14]定位的株高QTL相比，本研究定位的5、6 號(hào)染色體上的3 個(gè)位點(diǎn)均為新位點(diǎn)，其表型貢獻(xiàn)率均較高（分別為24.75%、27.02%和27.76%），可能為該性狀的主效位點(diǎn)。本研究中控制分蘗數(shù)的QTL 位于5 號(hào)染色體上，與于肖夏等[13]研究結(jié)果一致。穗長(zhǎng)QTL 在10 條染色體均有分布，其中1 號(hào)染色體位于GS53-GS93 區(qū)間的QTL 位點(diǎn)貢獻(xiàn)率達(dá)68.58%，說(shuō)明該位點(diǎn)為該性狀的主效位點(diǎn)，可進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證和功能研究。單株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量QTL 在除4 號(hào)染色體的9 條染色體上均有分布，而LU 等[14]只在1、3、6、7、9 號(hào)染色體上檢測(cè)到相關(guān)QTL 12 個(gè)。莖粗性狀可能由于標(biāo)記數(shù)量較少或標(biāo)記分布不夠均勻，QTL 定位并沒(méi)有關(guān)聯(lián)到相關(guān)位點(diǎn)，在后續(xù)研究中將加大標(biāo)記密度或根據(jù)參考基因組設(shè)計(jì)新的引物再次定位。本研究中5 號(hào)染色體的S15-S56 區(qū)間為多效性位點(diǎn)，同時(shí)控制株高、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)、單株干質(zhì)量和單株鮮質(zhì)量5 個(gè)性狀。在1、3、8、10 號(hào)染色體上也存在多效性位點(diǎn)，這可能是“一因多效”或多個(gè)基因間緊密連鎖造成的[28]。本研究中60 個(gè)QTL 位點(diǎn)只有3 個(gè)是正向加性效應(yīng)，說(shuō)明RIL 群體的這6 個(gè)農(nóng)藝性狀的雜種優(yōu)勢(shì)主要來(lái)自于父本Sa。

本研究構(gòu)建了“高粱×蘇丹草”SSR 分子遺傳圖譜，總長(zhǎng)度為1 606.7 cM，包含10 個(gè)連鎖群，標(biāo)記間平均距離為11.6 cM。對(duì)株高、莖粗、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量性狀進(jìn)行QTL 定位分析；共定位了60 個(gè)QTL 位點(diǎn)，控制株高的4 個(gè)QTL，對(duì)表型的貢獻(xiàn)率為24.75%～33.59%，控制穗長(zhǎng)的27 個(gè)QTL 對(duì)表型的貢獻(xiàn)率為14.05%～68.58%，控制分蘗數(shù)的1 個(gè)QTL 對(duì)表型的貢獻(xiàn)率為30.39%，控制單株鮮重的13 個(gè)QTL 對(duì)表型的貢獻(xiàn)率為17.69%～36.40%，控制單株干重的15 個(gè)QTL 對(duì)表型的貢獻(xiàn)率為20.32%～30.48%，旨在為分子標(biāo)記輔助高丹草高產(chǎn)育種奠定基礎(chǔ)。