趙 倩，羅洪斌,2，凌志峰，詹 杰

(湖北民族大學(xué) 1.醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室、2.神經(jīng)精神共患病研究所，生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，湖北 恩施 445000)

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是常見神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其重要病理改變有神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)及神經(jīng)元大量凋亡[1]。Tau蛋白對(duì)維持神經(jīng)元骨架功能至關(guān)重要[2]。糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)作為重要激酶，其表達(dá)增多會(huì)導(dǎo)致Tau蛋白過度磷酸化從而產(chǎn)生NFTs，最終發(fā)生AD[3]。

菟絲子(CuscutachinensisLam.)是旋花科菟絲子屬植物種子。文獻(xiàn)證明該藥具有延緩衰老、營養(yǎng)神經(jīng)作用[4]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)菟絲子可能通過PI3K-AKT-GSK-3β信號(hào)通路緩解AD發(fā)生[5]。本實(shí)驗(yàn)主要探討該藥是否能通過PI3K-AKT-GSK-3β信號(hào)通路改善AD模型大鼠認(rèn)知功能障礙，可為其臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料菟絲子購于巴東時(shí)珍堂藥業(yè)(湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部中藥學(xué)教研室胡澤華博士鑒定為正品)，批號(hào)：19071601。WT(Millipore)，GFX(Tocris)。Western blot抗體(Cell Signaling、SAB、Millipore、Abcam)。

1.2 水煎液制備稱量40 g藥品，煎煮并濃縮定量至100 mL，最終得到生藥濃度為0.4 kg·L-1溶液。低、中、高劑量組給藥劑量分別為0.1 g·kg-1、0.2 g·kg-1、0.4 g·kg-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將雄性SD級(jí)大鼠(購于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證號(hào):42000600017418)隨機(jī)分為一周組和二周組，每組再分為空白對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、菟絲子低、中、高劑量組，每組各10只。

1.4 給藥方法及水迷宮實(shí)驗(yàn)空白組常規(guī)喂養(yǎng)，對(duì)照組給予溫飲用水灌胃，給藥組用低、中、高劑量菟絲子水煎液灌胃。一周和二周組分別用藥7 d和14 d(100 kg·L-1)，用藥d 2和d 9起開始水迷宮訓(xùn)練5 d、d 7和d 14分別造模，24 h后水迷宮測(cè)試。

1.5 AD模型的建立在大鼠顱腦定位鉆孔，海馬處緩慢給藥WT+GFX混合液10 μL。

1.6 高爾基染色及尼氏染色對(duì)測(cè)試后大鼠灌流，部分灌流大鼠用4%多聚甲醛固定后，腦切片尼氏染色，另一部分灌流大鼠行高爾基染色和切片。所有腦片均脫水、透明、封片。

1.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)收集大鼠海馬組織，勻漿后提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，再進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。電泳后轉(zhuǎn)膜，加一抗孵育后清洗，再加二抗與其反應(yīng)，Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)檢測(cè)，比較各組蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 菟絲子改善AD大鼠空間學(xué)習(xí)能力與對(duì)照組比較，用藥組水迷宮檢測(cè)其逃避潛伏期明顯變短且呈劑量依賴性(P<0.05)。

2.2 菟絲子影響AD大鼠GSK-3β-AKT-PI3K信號(hào)通路與對(duì)照組比較，用藥組GSK-3β活性降低，PI3K、p-AKT與GSK-3β S9活性升高(P<0.05)，說明菟絲子可通過PI3K-AKT-GSK-3β信號(hào)通路上調(diào)GSK-3β S9活性。

2.3 菟絲子下調(diào)AD大鼠海馬Tau蛋白磷酸化水平與對(duì)照組比較，高劑量給藥一周和二周組Tau蛋白及p-T231位點(diǎn)磷酸化水平明顯下降(P<0.05)。

2.4 菟絲子增加AD大鼠海馬樹突復(fù)雜性和突觸相關(guān)蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，用藥組海馬CA1區(qū)樹突分支增多且樹突棘密度升高(P<0.01)，上調(diào)PSD95、Syn-1、Synaptophysin表達(dá)(P<0.05)。

2.5 菟絲子明顯增加AD大鼠尼氏小體，改善神經(jīng)元受損與對(duì)照組比較，用藥組神經(jīng)元尼氏小體數(shù)量明顯增多，細(xì)胞飽滿，染色變深。

2.6 菟絲子減少AD大鼠海馬凋亡與對(duì)照組比較，中、高劑量組海馬抗凋亡蛋白Bcl-2明顯增加(P<0.05)，表明菟絲子能減少神經(jīng)元凋亡。

3 討論

研究表明PI3K-AKT-GSK-3β信號(hào)通路是AD發(fā)病機(jī)制中一條重要信號(hào)通路[3]，而海馬神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體數(shù)量、樹突棘密度及突觸相關(guān)蛋白表達(dá)與其功能密切相關(guān)[6-7]。AD主要治法治則為補(bǔ)腎健腦。菟絲子是臨床常用補(bǔ)腎陽中藥，經(jīng)預(yù)測(cè)該藥可能通過PI3K-ATK-GSK-3β信號(hào)通路防治AD[4]。

本研究檢測(cè)了各組大鼠認(rèn)知功能、海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菟絲子正向調(diào)節(jié)PI3K、p-AKT及GSK-3β s9表達(dá)，降低Tau蛋白及其磷酸化水平，增加AD模型大鼠腦海馬樹突復(fù)雜性、突觸相關(guān)蛋白和抗凋亡蛋白表達(dá)，修復(fù)神經(jīng)元功能，抑制神經(jīng)元過度凋亡，最終改善AD模型大鼠認(rèn)知功能障礙。此研究證明菟絲子確能通過GSK-3β信號(hào)通路防治AD大鼠，可為該藥臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。