徐 薇，曹麗婷，石瑞麗，齊瑞芳，郝肖瓊，馬寶慧

(包頭醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

氟廣泛存在于日常飲用水、土壤和大氣層中，絕大多數(shù)以離子的形式存在于人體，是人體所必需的微量元素之一，大多分布在骨骼及牙齒。適量的攝入氟有利于齲齒的防治，還有利于骨骼及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。但如果長期攝入過量的氟化物會導(dǎo)致慢性氟中毒，骨相損傷表現(xiàn)為氟斑牙和氟骨癥[1]，氟也對非骨相造成損傷，如腎、肝、神經(jīng)系統(tǒng)等[2-3]。氟的累積可對心血管系統(tǒng)造成損傷，導(dǎo)致動脈粥樣硬化、心室舒張功能障礙、缺血性心臟病等[4-5]。慢性氟中毒的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其造成的心血管系統(tǒng)損傷可能是由于氟影響了心血管系統(tǒng)的信號通路，使心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生改變。但目前慢性氟中毒致心肌細(xì)胞損傷的具體分子機(jī)制仍不明確。

細(xì)胞凋亡是一種主動的細(xì)胞生理性的自殺行為。細(xì)胞凋亡通路包括內(nèi)源性線粒體介導(dǎo)的通路、外源性Fas介導(dǎo)的死亡受體通路及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的信號通路。Fas介導(dǎo)的死亡受體通路可參與多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。張佳勇等[6]在氟暴露致PC12神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as、FasL、caspase-8、FADD、caspase-3基因和蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組，但Bid基因和蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組，且呈氟暴露劑量依賴性，說明Fas介導(dǎo)的死亡受體通路可能參與了PC12細(xì)胞凋亡。Yuan等[7]的結(jié)果表明，F(xiàn)as/FasL介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑在鎘誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡中起重要作用。但氟暴露是否可通過Fas介導(dǎo)的死亡受體通路引起心肌細(xì)胞凋亡仍不明確。本研究通過體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，模擬氟染毒模型，檢測不同濃度的氟化鈉(sodium fluoride，NaF)對H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)、活力及相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，以闡明氟中毒對H9c2心肌細(xì)胞凋亡的作用和可能機(jī)制，為進(jìn)一步探討慢性氟中毒致心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與主要試劑NaF(分析純，201702)購于天津大茂化學(xué)試劑廠；DMEM高糖培養(yǎng)基(Lvn1001)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，A1019)，均購于北京利維寧生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)(AR1160)，TUNEL檢測試劑盒(MK1014-100)，DAB顯色試劑盒(AR1025)，均購于博士德公司；TRIzol(15596018)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622)，胰蛋白酶(25300054)，BCA定量試劑盒(23227)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑(34075)，均購于美國Thermo公司；caspase-8(ab108333)、caspase-3(ab32351)及caspase-1(ab179515)，β-actin(ab8226)，均購于美國Abcam公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(P1200-1)購于索萊寶生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系H9c2心肌細(xì)胞，購于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺。

1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，超速低溫冷凍離心機(jī)，NanoDrop-2000微量核酸蛋白定量儀，PTC-100 PCR儀，ELX-800全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo)；7900HT實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems)；Tanon4200SF化學(xué)成像發(fā)光儀(上海天能)；小型垂直電泳槽，電泳儀電源(美國伯樂)；TE2000-U倒置相差顯微鏡(日本Nikon)。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞造模 稱取4 mg NaF，溶解于50 mL含有10 %胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，配制成1.92 mmol·L-1的母液，濾頭過濾后，用含有10 %胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基配制不同濃度的NaF處理液，使NaF終濃度為0.24、0.48和0.96 mmol·L-1，以不加NaF作為對照組，各組培養(yǎng)24、48、72 h后，收集細(xì)胞待用。

1.4.2CCK-8法檢測NaF對心肌細(xì)胞活力的影響 收集對數(shù)期細(xì)胞，96孔板中每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，培養(yǎng)24 h后，棄掉舊的培養(yǎng)基，1× PBS輕輕清洗2次，加入含有不同濃度NaF的高糖DMEM培養(yǎng)基，再加入CCK-8試劑(CCK-8試劑 ∶DMEM=1 ∶10)，5 % CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和72 h后，使用酶標(biāo)儀于設(shè)置波長450 nm下檢測吸光度值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率/%=[(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)]×100 %。每組5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3TUNEL法檢測NaF對心肌細(xì)胞形態(tài)及凋亡的影響 收集對數(shù)期的細(xì)胞，在24孔板中放入細(xì)胞爬片，并將細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上，培養(yǎng)24 h后，加入0.24、0.48和0.96 mmol·L-1NaF，分別培養(yǎng)24、48和72 h，對照組不含NaF。根據(jù)說明書處理細(xì)胞后，顯色。蘇木精輕度復(fù)染。脫水、透明、封片。用熒光倒置顯微鏡觀察。

1.4.4Real-time PCR法檢測NaF對心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)24、48和72 h后，收集細(xì)胞于1.5 mL的EP管中，加入1 mL TRIzol裂解細(xì)胞。按照說明書提取總RNA，并測定RNA濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，2×real-time PCR Mix說明書對反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，按照2-ΔΔCt計(jì)算基因相對表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參，引物序列(目的基因與內(nèi)參基因引物序列)見Tab 1。

Tab 1 The sequence of primers

1.4.5Western blot法檢測NaF對心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞于1.5 mL的EP管中，提取蛋白，并用BCA定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定，計(jì)算上樣量，加入4× loading buffer，10× 抗氧化劑，混勻，金屬浴中100 ℃反應(yīng)10 min，使蛋白變性，置于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｌ崆爸苽溥m宜濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5 %脫脂牛奶封閉液封閉1 h，1× TBST洗滌3次后，加入一抗4 ℃孵育過夜，孵育完成后回收一抗，用1× TBST洗滌3次后，二抗室溫孵育2 h后，加入發(fā)光液，顯色發(fā)光，自動成像。用Tanon凝膠成像系統(tǒng)軟件進(jìn)行結(jié)果處理，以β-actin和α-tubulin為參照，用兩者灰度值代表內(nèi)參蛋白和目的蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 NaF對心肌細(xì)胞活力的影響采用CCK-8法檢測H9c2心肌細(xì)胞活力的情況。不同濃度的NaF處理H9c2細(xì)胞0、24、48和72 h后，測定其對細(xì)胞活力的影響。從Fig 1看出，與對照組相比，NaF處理24 h后，細(xì)胞活力降低，并且隨NaF濃度的增加，細(xì)胞活力也隨之降低；NaF處理48、72 h后，也有相似的變化。由此可以推斷，長期暴露于NaF可抑制H9c2細(xì)胞的活力，并且抑制程度與暴露時(shí)間及染毒劑量均密切相關(guān)。

Fig 1 Effect of NaF on viability of H9c2 *P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.2 NaF對心肌細(xì)胞形態(tài)及凋亡的影響用不同濃度NaF對同一批H9c2心肌細(xì)胞處理48 h后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)完整，呈長梭形或短柱形，細(xì)胞肌原纖維排列整齊，細(xì)胞間隙均勻，細(xì)胞核內(nèi)幾乎無顆粒；與對照組相比，隨NaF染毒劑量的增加，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞開始腫脹、變圓，細(xì)胞肌原纖維排列雜亂，細(xì)胞核內(nèi)逐漸有顆粒出現(xiàn)；在0.96 mmol·L-1NaF處理后，細(xì)胞形態(tài)明顯變得不規(guī)則，細(xì)胞明顯腫脹、變圓，細(xì)胞肌原纖維無序排列，并出現(xiàn)大面積的橫紋斷裂，細(xì)胞間隙明顯增大，有的貼壁細(xì)胞形狀變得更加不規(guī)則，細(xì)胞核內(nèi)明顯有顆粒出現(xiàn)。隨NaF濃度的增加，細(xì)胞凋亡程度明顯隨之增加(P<0.01)。結(jié)果表明，心肌細(xì)胞凋亡程度依賴于NaF劑量，見Fig 2。

Fig 2 Morphology and apoptosis of H9c2 cardiomyocytes after 48 hours of NaF A:control group;B:0.24 mmol·L-1 NaF;C:0.48 mmol·L-1 NaF；D:0.96 mmol·L-1 NaF，**P<0.01 vs control group

2.3 NaF致心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響NaF處理H9c2心肌細(xì)胞24 h后，與對照組相比，0.96 mmol·L-1NaF處理后心肌細(xì)胞中Fas mRNA表達(dá)量明顯增加(P<0.01)；NaF處理48 h后，與對照組相比，0.48 mmol·L-1和0.96 mmol·L-1NaF處理后心肌細(xì)胞中Fas mRNA表達(dá)量明顯增加(P<0.01)；NaF處理72 h后，與對照組相比，0.24、0.48和0.96 mmol·L-1NaF處理后心肌細(xì)胞中Fas mRNA表達(dá)量均明顯增加(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果可見，F(xiàn)as mRNA表達(dá)量隨NaF處理濃度的增加及處理時(shí)間的延長而增加，見Fig 3A。與對照組相比，隨NaF濃度及處理時(shí)間的增加，caspase-1和caspase-3 mRNA表達(dá)量均逐漸增加(P<0.05或P<0.01)，見Fig 3B、C。與對照組相比，NaF處理24、48、72 h后，心肌細(xì)胞caspase-8 mRNA表達(dá)量明顯增加(P<0.05或P<0.01)，見Fig 3D。

Fig 3 Effects of NaF on the mRNA expression of Fas,caspase-8,caspase-1 and caspase-3 in H9c2 cells after 24,48 and 72 *P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.4 NaF致心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4.1NaF對心肌細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)的影響 不同濃度NaF處理48 h后，與對照組相比，隨NaF濃度的增加，H9c2心肌細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)量也隨之增加(P<0.05或P<0.01)，見Fig 4。

2.4.2NaF對心肌細(xì)胞caspase-8、caspase-1及caspase-3蛋白表達(dá)的影響 不同濃度NaF處理H9c2心肌細(xì)胞48 h后，與對照組相比，隨NaF濃度的增加，H9c2心肌細(xì)胞caspase-8、caspase-1蛋白表達(dá)量均隨之增加(P<0.05或P<0.01)；0.48和0.96 mmol·L-1NaF染毒組H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.01)，見Fig 5。

Fig 4 Effect of NaF on protein expression of Fas in H9c2 *P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 5 Effects of NaF on protein expression of caspase-8,caspase-1 and cleaved-caspase-3 in H9c2 cells after 48 *P<0.05,**P<0.01 vs control group

3 討論

氟的化學(xué)性質(zhì)活潑，是人體常見微量元素之一。

在慢性氟中毒非骨相損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，氟易與血液中的微量元素鈣、鎂等相結(jié)合，使鈣磷代謝平衡紊亂，抑制脫氫輔酶Ⅰ、Ⅱ系統(tǒng)的活性，從而引起一系列的心血管系統(tǒng)疾病[4]，導(dǎo)致嚴(yán)重的心功能障礙，如心輸出量降低、出現(xiàn)心律失常和動脈粥樣硬化等[5,8]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性氟中毒可引起心臟組織的炎癥，對心肌纖維有明顯損傷[9]。Cicek等[10]研究發(fā)現(xiàn)，氟中毒會導(dǎo)致心肌代謝、功能和結(jié)構(gòu)均發(fā)生一定程度的損傷。本研究結(jié)果也顯示，對照組心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈長梭形或短柱形，肌原纖維排列整齊，細(xì)胞間隙均勻；隨NaF染毒劑量的增加，細(xì)胞形態(tài)明顯變得不規(guī)則，逐漸腫脹、變圓，肌原纖維無序排列，細(xì)胞間隙也隨之增大，并且隨著NaF染毒劑量及染毒時(shí)間的增加，細(xì)胞活力降低，這說明暴露于高濃度NaF可明顯損傷心肌細(xì)胞，抑制心肌細(xì)胞生長。

然而，目前氟中毒對心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制仍不十分明確。大量研究結(jié)果表明，過量氟可誘導(dǎo)機(jī)體各器官組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生。氟化鈉對成骨細(xì)胞的損傷與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)[11]，骨骼肌細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞的損傷也與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平上升有關(guān)[12-13]。本研究通過TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度NaF處理48 h后，NaF染毒組心肌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)明顯有顆粒出現(xiàn)，即出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡，且隨著NaF濃度的增加，細(xì)胞凋亡明顯增加，表明氟染毒呈劑量依賴性誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞損傷。這與Yan等[14]的結(jié)果一致。

死亡受體通路是細(xì)胞外的信號因子與細(xì)胞膜表面的相關(guān)受體結(jié)合，通過一系列凋亡信號的傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)Fas介導(dǎo)的死亡受體途徑被激活時(shí)，F(xiàn)as被FasL誘導(dǎo)發(fā)生三聚體化，形成連接器蛋白(Fas-associated death domain protein，F(xiàn)ADD)，F(xiàn)ADD與caspase-8的酶原相結(jié)合形成死亡信號誘導(dǎo)復(fù)合物(death-inducing signaling complex，DICS)，DICS可導(dǎo)致caspase-8被激活，激活狀態(tài)的caspase-8可激活下游的caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。caspase-1參與了白細(xì)胞介素1β(recombinant human interleukin-1 beta，IL-1β)的活化和功能，還可減輕各種動物模型中的炎癥反應(yīng)，并且很可能參與了caspase-8下游的凋亡途徑[15]。Fas/caspase通路參與調(diào)控缺氧復(fù)氧引起的心肌細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果表明，隨著NaF染毒濃度和染毒時(shí)間的增加，F(xiàn)as、caspase-8、caspase-1和caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平也隨之增加，說明在H9c2心肌細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)與其暴露在NaF中的濃度和時(shí)間有關(guān)，提示氟化鈉可能通過Fas表達(dá)上調(diào)參與心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，NaF可誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞活力下降及細(xì)胞凋亡增加，且Fas、caspase-8、caspase-1和caspase-3的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)水平隨NaF染毒劑量的增加及染毒時(shí)間的延長明顯上調(diào)，提示Fas介導(dǎo)的死亡受體通路可能參與氟誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果僅從細(xì)胞水平探討了氟染毒對心肌細(xì)胞的凋亡機(jī)制，為地方性氟中毒的預(yù)防和治療提供依據(jù)。在今后的研究中將從整體水平進(jìn)一步明確氟化鈉誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡與Fas通路的關(guān)系及具體機(jī)制。