楊 君，沙前坤，李玉先，陳 瑾，龍 馨，顏 麗，張 華

(1.重慶市婦幼保健院宮頸疾病診治中心,重慶 400021;2.重慶央都生物研究院藥學(xué)部,重慶 408000;3.重慶醫(yī)科大學(xué)北碚附屬醫(yī)院,重慶 400700;4.重慶市中醫(yī)院藥劑科，重慶 400011；5.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科,重慶 400016)

炎癥是天然免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素，可以減輕組織損傷。但是炎癥持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，組織損傷程度會(huì)加重[1-2]。研究表明LPS是革蘭氏陰性菌外膜內(nèi)毒素的致病成分，能夠激活多種信號(hào)通路，如免疫和炎癥反應(yīng)的紊亂等[3]。白藜蘆醇苷(piceid，PD)是從傳統(tǒng)中藥虎杖中提取的單體化合物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PD具有多種重要的生物學(xué)功能，如抗氧化、抗血栓形成等。以PD作為主要活性成分的虎黃燒傷搽劑(生產(chǎn)廠家：重慶喜旋生物科技有限公司，規(guī)格：50 mL/瓶，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20010151)能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合，調(diào)控機(jī)體免疫能力。然而其在抗炎作用中的研究機(jī)制尚未闡明。本研究旨在探究PD在LPS引起的炎癥反應(yīng)中的影響及分子機(jī)制，為揭示PD的治療機(jī)制以及其在臨床用藥中的運(yùn)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料PD(批號(hào):09042022)購(gòu)自美國(guó)LKT實(shí)驗(yàn)室，用二甲基亞砜(DMSO)(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)溶解配制成10 mmol·L-1的貯存液儲(chǔ)藏于-20 ℃冰箱?？贵wAnti-JNK1/2兔抗人單克隆抗體、Anti-ERK1/2鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，Anti-p38MAPK、Anti-p-JNK1/2、Anti-p-ERK1/2和Anti-p-p38MAPK兔抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。ELISA試劑盒購(gòu)自Abcam公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Bio-Rad公司，細(xì)胞裂解液RIPA購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，引物序列由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7(小鼠巨噬細(xì)胞)細(xì)胞系來(lái)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞系在DMEM高糖正常培養(yǎng)基(包括10% FBS、100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素)在加濕5% CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT 采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。將1×105RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，然后用PD(0、1.0、3.0、5.0 μmol·L-1)處理48 h，每孔加入MTT(5 g·L-1)，培養(yǎng)3 h。然后去除培養(yǎng)基，用DMSO(100 μL/孔)溶解結(jié)晶紫，最后用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定。

1.2.3Western blot 將RAW264.7細(xì)胞接種，過(guò)夜培養(yǎng)。LPS(1 mg·L-1)誘導(dǎo)2 h，在指示時(shí)間點(diǎn)PD(20、40、80 μmol·L-1)進(jìn)行預(yù)處理。用RIPA (1% PMSF和1% DTT)提取總細(xì)胞蛋白，提取細(xì)胞質(zhì)和核蛋白。采用BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，變性蛋白用SDS-PAGE凝膠分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，PVDF膜與一抗(1 ∶1 000)4 ℃過(guò)夜孵育。之后用TBST洗滌，并與二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育2 h。利用Bio-Rad發(fā)光試劑盒與Chemi DocTMMP成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)密度為1.5×105RAW264.7細(xì)胞接種于24孔板過(guò)夜。用PD預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后用LPS(1 mg·L-1)處理2 h。用不同的探針檢測(cè)相應(yīng)的指標(biāo)，包括NO檢測(cè)器DAF-FM (5 μmol·L-1，1 h)，ROS檢測(cè)器DCFH2-DA(10 μmol·L-1，30 min)，Ca2+檢測(cè)器Fluo-3/AM(1 μmol·L-1，1 h)或MMP 檢測(cè)器JC-1(10 mg·g-1，30 min)。探針?lè)跤?，用流式?xì)胞儀(BD，美國(guó))采集細(xì)胞并進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5免疫熒光染色 RAW264.7細(xì)胞以1.5×108個(gè)·L-1的密度接種到共聚焦培養(yǎng)皿中過(guò)夜，用PD預(yù)處理4 h，并用LPS刺激(1 mg·L-1)預(yù)處理2 h。固定、打孔、封閉后，將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞與抗體在4 ℃下孵育過(guò)夜。最后將細(xì)胞與Alexa Fluor 594二抗孵育1 h。Hoechst 33342染色顯示細(xì)胞核。在共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(Leica，Wetzlar，德國(guó))下收集熒光圖像。

1.2.6ELISA 按照說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備所有試劑，工作標(biāo)準(zhǔn)液和樣品。將50 μL所有樣品或標(biāo)準(zhǔn)液加到適當(dāng)?shù)目字?。在每個(gè)孔中加入50 μL抗體混合物。密封板并在設(shè)置為400 r·min-1的振蕩器上于室溫孵育1 h。用350 μL 1×Wash buffer PT清洗3次。晾干以除去多余的液體。每孔中加入100 μL TMB顯影液，并在避光中在設(shè)置為400 r·min-1的平板振蕩器上孵育10 min。每孔中加入100 μL終止溶液。在平板振蕩器上將平板搖晃1 min以進(jìn)行混合記錄450 nm處的OD。

1.2.7熒光測(cè)定 RAW264.7細(xì)胞以4×108個(gè)·L-1的密度過(guò)夜接種于96孔板中。用PD預(yù)處理細(xì)胞1次，然后在有或沒(méi)有LPS的情況下再孵育2 h。用JC-1(10 mg·L-1)和DCFH2-DA(100 μmol·L-1)染色30 min。最后通過(guò)熒光顯微鏡捕獲熒光圖像。

2 結(jié)果

2.1 PD減少LPS引起的炎癥反應(yīng)利用MTT試驗(yàn),計(jì)算不同濃度的PD(1.0、3.0、5.0 和7.0 μmol·L-1)處理后的細(xì)胞生存率，結(jié)果提示不同濃度的PD處理細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的存活率分別為(98.56%、96.51%、96.56%、87.24%)。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將選用濃度1.0-5.0 μmol·L-1。

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD對(duì)于上述指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)PD預(yù)處理呈劑量依賴(lài)性的方式抑制LPS刺激的亞硝酸鹽水平和iNOS蛋白的表達(dá)。如Fig 1所示，LPS處理的細(xì)胞亞硝酸鹽水平急劇升高。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，PD可以減少細(xì)胞NO生成。COX-2蛋白的表達(dá)無(wú)影響。

Fig 1 PD reduced LPS-induced inflammatory A:PD cytotoxicity in RAW264.7 cells;B:PD reduced the inflammatory response;C:Effect of PD on the expression of COX-2 and iNOS;D:Flow cytometry detection and analysis.*P<0.05 vs LPS group

2.2 PD減少LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)利用ELISA檢測(cè)PD處理后相關(guān)因子的水平，結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生(Fig 2)。同時(shí)，用PD預(yù)處理可明顯抑制LPS處理后TNF-α和IL-6的產(chǎn)生。

Fig 2 PD reduced expression of LPS-induced pro-inflammatory A、B：ELISA of TNF-α and IL-6 levels;C：Flow cytometry analysis of Fluo-3/AM labeled cells.*P<0.05 vs LPS group

2.3 PD對(duì)于MAPK和Nrf2/HO-1通路的影響利用蛋白印記方法檢測(cè)MAPK和Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)，如Fig 3所示，PD明顯抑制 p-JNK1/2、p-ERK1/2和p-p38MAPK的蛋白水平，但對(duì)JNK1/2、ERK1/2和p38MAPK總量的表達(dá)無(wú)影響。

Fig 3 Effect of PD on MAPK and Nrf2/HO-1 *P<0.05 vs LPS group

2.4 PD抑制活性氧的生產(chǎn)和降低線(xiàn)粒體膜電位利用DCFH2-DA檢測(cè)ROS的產(chǎn)生，結(jié)果表明，PD明顯抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞ROS生成(Fig 4A)。

Fig 4 PD inhibited production of reactive oxygen species and reduced mitochondrial membrane A、B、C：Immunofluorescence and intracellular ROS kit to detect intracellular ROS production;D：JC-1 probe to detect cell mitochondrial membrane potential (MMP).*P<0.05 vs LPS group.

另外還采用免疫熒光法和細(xì)胞內(nèi)ROS試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。結(jié)果表明，PD降低了細(xì)胞內(nèi)ROS水平(Fig 4B、C)。LPS破壞線(xiàn)粒體膜電位(MMP)的穩(wěn)定性，不利于維持細(xì)胞正常的生理功能。本研究利用免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)通過(guò)LPS刺激(綠色染色)增加JC-1單體，但PD的預(yù)處理降低了JC-1單體，使其恢復(fù)為聚集體(紅色熒光)(Fig 4D)。

2.5 PD對(duì)Keap1-Nrf2信號(hào)通路的影響研究表明，LPS可激活巨噬細(xì)胞中的Nrf2信號(hào)通路。在本研究檢測(cè)PD對(duì)Keap1-Nrf2信號(hào)通路的影響。如Fig 5所示，LPS刺激可誘導(dǎo)Keap1表達(dá)上調(diào)，而PD預(yù)處理則Keap1蛋白表達(dá)略有下調(diào)。用PD預(yù)處理可增加RWA264.7細(xì)胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)。與NC和LPS刺激組相比，PD的預(yù)處理提高了細(xì)胞核中Nrf2蛋白水平，但降低了細(xì)胞質(zhì)中的蛋白水平。

Fig 5 Effect of PD on Keap1-Nrf2 signaling A:Keap1,Nrf2y and HO-1 level detection;B:Nuclear and cytoplasmic Nrf2 level detection;C:Quantitative analysis of differences in Keap1,Nrf2y and HO-1 level of each group).*P<0.05 vs LPS group

2.6 Toll樣受體參與PD的抗炎過(guò)程在多個(gè)細(xì)胞上特異性發(fā)現(xiàn)的TLR4在炎癥過(guò)程中起著重要的作用。在LPS和MD2存在下，TLR4二聚，調(diào)節(jié)NF-κB、MAPK和其他信號(hào)級(jí)聯(lián)，通過(guò)促炎細(xì)胞因子釋放誘導(dǎo)病原體特異性天然免疫反應(yīng)。為了評(píng)價(jià)TLR4是否參與PD的抗炎過(guò)程，采用蛋白印跡檢測(cè)不同濃度PD處理后TLR4的表達(dá)情況。我們的結(jié)果表明，PD減弱了LPS誘導(dǎo)的TLR4的表達(dá)(Fig 6)。

Fig 6 Toll-like receptors involved in anti-inflammatory *P<0.05 vs LPS group

3 討論

炎癥反應(yīng)是生命中常見(jiàn)的病理反應(yīng)，存在于各種組織和器官中[1]。炎癥與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程有關(guān)，包括中風(fēng)、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病等[2]。因此，抑制炎癥在炎癥相關(guān)疾病治療中起關(guān)鍵作用。PD具有多種重要的生物學(xué)功能，如抗氧化、抗血栓形成等，然而其抗炎作用的研究還相對(duì)較少?；趥鹘y(tǒng)中藥研究的經(jīng)驗(yàn)，PD的藥用價(jià)值使其被添加到越來(lái)越多的成藥中。具有代表性的成藥虎黃燒傷搽劑，以PD為主要活性成分，其治療燒傷效果顯著，主要的適應(yīng)癥為嚴(yán)重?zé)齻鸬男菘撕图?xì)菌感染等。本文旨在進(jìn)一步探索PD抗炎作用的分子機(jī)制，為拓展其臨床應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。

本研究采用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)PD減少LPS引起的炎癥反應(yīng)，并減少LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。而且大量證據(jù)表明與TLR4結(jié)合的LPS可以激活許多炎癥途徑，如MAPKs途徑[2-6]。據(jù)報(bào)道TLR4和MAPKs信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)[6]。在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中增強(qiáng)JNK1/2、p38、ERK1/2的磷酸化[7]。本研究顯示PD明顯抑制了JNK1/2、p38、ERK1/2的磷酸化，而沒(méi)有改變總JNK1/2、p38、ERK1/2蛋白質(zhì)水平的激活。此外，我們的結(jié)果表明TLR4參與PD的抗炎過(guò)程。綜上所述，PD通過(guò)介導(dǎo)NF-κB和MAPKs途徑表現(xiàn)出抗炎作用。

文獻(xiàn)報(bào)道ROS的產(chǎn)生介導(dǎo)了各種炎癥信號(hào)通路，從而促進(jìn)了炎癥反應(yīng)[8]。MMP以及ROS45也是重要的炎癥反應(yīng)信號(hào)。因此抑制ROS或促進(jìn)MMP可能也是炎性疾病最重要的治療靶點(diǎn)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，PD明顯降低了ROS的產(chǎn)生并恢復(fù)了線(xiàn)粒體膜電位，從而減輕了炎癥反應(yīng)。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，HO-1是一種抗氧化酶，在血紅素降解中起著至關(guān)重要的作用，是氧化應(yīng)激和炎癥細(xì)胞病理生理?xiàng)l件的重要機(jī)制[8]。本研究結(jié)果表明，用PD預(yù)處理可降低Keap1表達(dá)，促進(jìn)Nrf2核易位并在體外誘導(dǎo)HO-1。更有文獻(xiàn)報(bào)道Nrf2作為調(diào)節(jié)HO-1表達(dá)的主要蛋白，通常與Keap1一起分布在細(xì)胞質(zhì)中。但是，當(dāng)Keap1在氧化應(yīng)激下降解時(shí)，Nrf2釋放并遷移到細(xì)胞核，然后誘導(dǎo)HO-1表達(dá)[9-11]。

LPS誘導(dǎo)其下游通路的活化可導(dǎo)致細(xì)胞分泌大量的炎癥因子，同時(shí)使iNOS和NO表達(dá)增加。然而MAPKs在LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)LPS能夠誘導(dǎo)激活MAPK通路。此外HO-1對(duì)于降低促炎COX-2和iNOS水平至關(guān)重要，這有助于減少COX-2衍生的PGE2和iNOS衍生的NO的產(chǎn)生[12]。HO-1是由Nrf2介導(dǎo)的，通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化反應(yīng)，Nrf2在改善細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥損傷方面起著至關(guān)重要的作用。在正常情況下，Nrf2位于細(xì)胞質(zhì)中，其抑制蛋白是Keap1[13-14]。在應(yīng)激條件下，Nrf2與Keap1解離，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，從而誘導(dǎo)Ⅱ期解毒酶和細(xì)胞保護(hù)基因，如HO-1[11,15-17]。綜上，PD可能通過(guò)MAPK和Nrf2/HO-1通路對(duì)RAW264.7細(xì)胞表現(xiàn)出抗炎和抗氧化作用。因此，PD可以作為研究和開(kāi)發(fā)炎性疾病的潛在藥物。