邢稚坤，王二強(qiáng)，廖 原，高風(fēng)亦，趙雪源，譚小武，俞曉凡，吳向未

棘球蚴病是一種世界范圍的人獸共患病，以細(xì)粒棘球蚴絳蟲(chóng)(Echinococcusgranulosus，Eg)、多房棘球蚴絳蟲(chóng)(Echinococcusmultilocularis，Em)幼蟲(chóng)引起的疾病最為常見(jiàn)[1]。棘球蚴病可發(fā)生在肝、肺、腦等部位發(fā)生，肝臟是其最常見(jiàn)的好發(fā)部位[2-4]。棘球蚴寄生于肝臟后會(huì)引起周圍組織炎癥反應(yīng)、肉芽組織增生、纖維化、鈣化等一系列病理生理變化，其中纖維化會(huì)伴隨整個(gè)寄生過(guò)程[5]。由Eg引起的肝囊型包蟲(chóng)病(Cysticechinococcosis，CE)和由Em引起的肝泡型包蟲(chóng)病(Alveolarechinococcosis，AE)周圍組織纖維化情況有所不同，造成兩種棘球蚴的治療方式不同。前期研究發(fā)現(xiàn)包蟲(chóng)周圍組織纖維化主要由I型膠原(CollagenⅠ，COL1)、Ⅲ型膠原(CollagenⅢ，COL3)、Ⅳ型膠原(CollagenⅣ，COL4)構(gòu)成，其中COL1、COL3的含量較高[6-7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HE、masson、免疫組化染色，對(duì)比小鼠不同時(shí)間段兩種包蟲(chóng)纖維化進(jìn)程的區(qū)別，進(jìn)一步了解多房棘球蚴體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，從而尋找更好的診療方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及器材

1.1.1 主要耗材 本實(shí)驗(yàn)所用一抗(COL1：ab34710；COL3：ab184993；α-SMA：ab124964；TGF-β1：ab92486)、Masson染色試劑盒來(lái)自abcam公司，HE染色試劑盒來(lái)自生工生物工程(上海)股份有限公司，免疫組化二步法試劑盒(PV-6001)來(lái)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，1640培養(yǎng)基來(lái)自gibco，青鏈霉素混合液來(lái)自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清來(lái)自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.2 主要儀器 Leica輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2245)，蔡司顯微鏡(Axio Imager 2)，賽默飛Excelsior AS自動(dòng)組織脫水機(jī)，賽默飛公司二氧化碳培養(yǎng)箱(Heracell 240i)，Eppendorf公司移液器。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 來(lái)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，1月齡雌鼠90只。

1.2 原頭節(jié)的提取

1.2.1 細(xì)粒棘球蚴 屠宰場(chǎng)購(gòu)買患病羊肝(本地牲畜屠宰場(chǎng)，現(xiàn)場(chǎng)無(wú)菌封裝)，從中提取細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，用含有雙抗的PBS清洗數(shù)遍后，放入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中待用。用伊紅染色劑鑒定原頭節(jié)活性，活性大于90%可用。

1.2.2 多房棘球蚴 新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心購(gòu)SPF級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠(Meriones unguiculatus)，腹腔種植多房棘球蚴原頭節(jié)，6月后開(kāi)腹提取腹腔多房棘球蚴組織，經(jīng)過(guò)研磨、過(guò)濾、清洗提取出多房棘球蚴原頭節(jié)。用伊紅染色劑鑒定原頭節(jié)活性，活性大于90%可用。

1.3 動(dòng)物模型的建立 選用健康雌性1月齡的C57BL/6小鼠90只，分為細(xì)粒棘球蚴組30只、多房棘球蚴組30只和對(duì)照組30只，細(xì)粒棘球蚴組、多房棘球蚴組分別進(jìn)行肝被膜下注射5 000個(gè)相應(yīng)原頭節(jié)，對(duì)照組肝被膜下注射等量的RPMI-1640培養(yǎng)基[8]。造模完成后分別于30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d 收取小鼠肝臟標(biāo)本。

1.4 標(biāo)本的處理 小鼠肝臟取得后使用PBS緩沖液沖洗3次，放入4%中性甲醛中浸泡48 h，全自動(dòng)脫水機(jī)脫水處理，石蠟包埋，制成3 μm石蠟切片。

1.5 染色 HE染色：脫蠟至水，中性蘇木素染色6 min，清水沖洗10 min，鹽酸酒精分化，伊紅染色1 min。免疫組織化學(xué)染色：抗原修復(fù)采用pH6枸櫞酸高壓修復(fù)法，染色采用EnViSion二步染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 本實(shí)驗(yàn)使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較，理論頻數(shù)小于1的分組使用Fisher’s確切概率法，計(jì)量資料符合正態(tài)分布的使用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，如果不符合正態(tài)分布使用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 H&E染色觀察CE、AE發(fā)育過(guò)程 動(dòng)物模型兩種包蟲(chóng)不同時(shí)期的HE染色可觀察到，細(xì)粒棘球蚴組30 d未形成囊腫，存在變形增大的原頭節(jié)，以及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，30～60 d形成囊腫組織，可見(jiàn)完整的內(nèi)囊壁，內(nèi)囊周圍有較厚的炎癥帶，60～120 d內(nèi)囊逐漸增厚，內(nèi)囊周圍炎癥帶逐漸減少至消失，外囊逐漸形成，120～180 d內(nèi)囊壁、外囊壁逐漸增厚，囊腫對(duì)周圍組織擠壓明顯。

多房棘球蚴組30 d頭節(jié)注射部位可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肉芽組織增生，未見(jiàn)囊腫形成，未見(jiàn)完整的原頭節(jié)。囊腫形成在30～60 d，90 d后可觀察到囊腫向周圍組織浸潤(rùn)現(xiàn)象，囊腫無(wú)固定形態(tài)，120 d后囊腫繼續(xù)增長(zhǎng)，出現(xiàn)玻璃樣變纖維組織，180 d組可見(jiàn)大面積玻璃樣變纖維組織，其中包含大量大小不同的囊腫。AE生長(zhǎng)過(guò)程中內(nèi)囊壁增厚不明顯且對(duì)周圍組織的浸潤(rùn)、侵襲始終存在。

A-F為CE組，G-L為AE組，M-R為對(duì)照組，*標(biāo)注為包蟲(chóng)囊內(nèi)(×200)，病灶周圍可見(jiàn)大量炎癥反應(yīng)，包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞等圖1 不同時(shí)期小鼠肝臟CE、AE標(biāo)本HE染色Fig.1 HE staining of mice liver specimens of CE and AE at different stages

2.2 Masson染色觀察CE、AE膠原纖維分布情況 Masson染色細(xì)粒棘球蚴組30 d可觀察到病灶周圍炎癥浸潤(rùn)及肉芽組織增生區(qū)域內(nèi)分泌大量膠原纖維蛋白，60 d可見(jiàn)膠原纖維蛋白在內(nèi)囊外側(cè)聚集，90 d可見(jiàn)炎癥及肉芽組織區(qū)域面積減少，在內(nèi)囊外側(cè)沉積的纖維蛋白形成纖維外囊，120～150 d可見(jiàn)炎癥及肉芽腫區(qū)域減退至消失，膠原蛋白纖維由彌漫分布逐漸形成連續(xù)致密的纖維外囊，180 d纖維外囊進(jìn)一步致密增厚。

多房棘球蚴組30 d見(jiàn)病灶周圍炎癥浸潤(rùn)及肉芽組織增生區(qū)域內(nèi)分泌大量膠原纖維蛋白類似于細(xì)粒棘球蚴組，60～90 d可見(jiàn)纖維蛋白在內(nèi)囊外側(cè)彌漫性分布無(wú)明顯聚集現(xiàn)象，90～150 d膠原纖維蛋白仍呈彌漫性分布，有聚集形成外囊的現(xiàn)象但是相較細(xì)粒棘球蚴組，其外囊較為疏松，未見(jiàn)形成連續(xù)致密的纖維外囊，在多房棘球蚴病灶中形成的玻璃樣變纖維化組織中可見(jiàn)大面積膠原蛋白分布，如圖2L。

2.3 免疫組化染色觀察COL1、COL3分布情況 在細(xì)粒棘球蚴組COL1、COL3免疫組化染色，觀察到兩種膠原蛋白的分布符合Masson染色膠原纖維的分布情況， COL1、COL3在包蟲(chóng)周圍炎癥浸潤(rùn)及肉芽組織增生區(qū)域分布高于其他區(qū)域，且兩種膠原蛋白的分布在該區(qū)域中由彌散性逐漸聚集成完整連續(xù)的纖維外囊，見(jiàn)圖3和圖4。

多房棘球蚴組COL1、COL3在包蟲(chóng)周圍炎癥浸潤(rùn)及肉芽組織增生區(qū)域分布高于其他區(qū)域，其中相較于同一時(shí)期細(xì)粒棘球蚴組COL1在病灶周圍的表達(dá)相對(duì)較低。病灶周圍COL3高表達(dá)，但彌散性分布無(wú)法聚集成完整纖維外囊。

對(duì)小鼠肝組織COL1、COL3的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行分析，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞COL1、COL3呈弱陽(yáng)性(+)表達(dá)，因此統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性(++)和強(qiáng)陽(yáng)性(+++)的表達(dá)率如表1，使用Fisher’s精確檢驗(yàn)COL1的表達(dá)，CE組對(duì)比NC組(P=0.000<0.05)，AE組對(duì)比NC組(P=0.000<0.05)，COL3的表達(dá)CE組對(duì)比NC組(P=0.000<0.05)，AE組對(duì)比NC組(P=0.000<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為觀察COL1、COL3表達(dá)強(qiáng)度與天數(shù)之間的關(guān)系，繪制散點(diǎn)圖及擬合線，并進(jìn)行相關(guān)性分析(表2、圖5)，CE組COL1的表達(dá)強(qiáng)度與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(P=0.000<0.05)，CE組COL3的表達(dá)強(qiáng)度與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(P=0.000<0.05)，AE組COL1的表達(dá)強(qiáng)度與時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性(P=0.059>0.05)，AE組COL3的表達(dá)強(qiáng)度與時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性(P=0.848>0.05)，隨著細(xì)粒棘球蚴完整纖維外囊的形成，細(xì)粒棘球蚴病灶周圍的COL1、COL3表達(dá)降低，多房棘球蚴病灶周圍COL1、COL3表達(dá)隨時(shí)間變化不明顯。對(duì)比COL1、COL3的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)CE中兩種膠原蛋白的比值相較于AE組有差異，使用ImageJ軟件計(jì)算兩種膠原蛋白的表達(dá)面積，并計(jì)算出不同時(shí)間段COL1/COL3表達(dá)面積比值進(jìn)行比較，CE組高于AE組，如圖6使用秩和檢驗(yàn)將CE組全部標(biāo)本與AE組全部標(biāo)本的COL1/COL3進(jìn)行對(duì)比(Z=-3.23，P=1.2×10-3<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A-F為CE組，G-L為AE組，M-R為對(duì)照組, 箭頭標(biāo)注為膠原纖維區(qū)域(藍(lán)色)，*標(biāo)注為包蟲(chóng)囊內(nèi)(×200)圖2 不同時(shí)期小鼠肝臟CE、AE標(biāo)本Masson染色Fig.2 Masson staining of mice liver specimens of CE and AE at different stages

A-F為CE組，G-L為AE組，M-R為對(duì)照組，箭頭標(biāo)注為COL1表達(dá)區(qū)域(褐色)，*標(biāo)注為包蟲(chóng)囊內(nèi)(×200)圖3 不同時(shí)期小鼠肝臟CE、AE標(biāo)本COL1 IHC染色Fig.3 Col1 IHC staining of CE and AE liver specimens in different periods

A-F為CE組，G-L為AE組，M-R為對(duì)照組,箭頭標(biāo)注為COL3表達(dá)區(qū)域(褐色),“*”標(biāo)注為包蟲(chóng)囊內(nèi)(×200)圖4 不同時(shí)期小鼠肝臟CE、AE標(biāo)本COL3 IHC染色Fig.4 Col3 IHC staining of CE and AE liver specimens in different periods

表1 小鼠肝組織中COL1和COL3的表達(dá)Tab.1 Expression of COL1 and COL3 in mouse liver tissue

圖5 CE、AE標(biāo)本COL1、COL3表達(dá)強(qiáng)度與時(shí)間的的散點(diǎn)圖，并繪制擬合線Fig.5 Scatter plot of COL1 and COL3 expression intensity and time in CE and AE specimens, and draw the fitting line

表2 兩種棘球蚴病病灶周圍COL1、COL3表達(dá)強(qiáng)度與造模時(shí)間的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis between the expression intensity of COL1 and COL3 around the lesions of the two hydatid diseases and the days of modeling

①P<0.05圖6 CE組、AE組全部樣本COL1/COL3值柱狀圖Fig.6 Col1/Col3 histogram of all samples in CE group and AE group

2.4 免疫組化染色觀察α-SMA、TGF-β1表達(dá)情況 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)免疫組化染色可見(jiàn)，對(duì)照組中僅在血管壁中表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組主要表達(dá)在炎癥浸潤(rùn)及肉芽組織增生區(qū)域。隨著細(xì)粒棘球蚴組連續(xù)致密的纖維外囊形成，α-SMA表達(dá)逐漸減少，直至180 d 組可見(jiàn)其囊周表達(dá)基本消失。多房棘球蚴組炎癥浸潤(rùn)及肉芽組織增生區(qū)域始終存在，α-SMA在整個(gè)試驗(yàn)周期中均有較高的囊周表達(dá)，見(jiàn)圖7。

TGF-β1免疫組化可見(jiàn)，對(duì)照組肝細(xì)胞中有TGF-β1表達(dá)，高表達(dá)于囊周組織，在細(xì)粒棘球蚴組中可見(jiàn)隨著致密纖維外囊的形成TGF-β1的表達(dá)逐漸減少，多房棘球蚴組囊周持續(xù)有TGF-β1高表達(dá)，見(jiàn)圖8。

α-SMA、TGF-β1在病灶周圍表達(dá)強(qiáng)度情況如表3，使用Fisher’s精確檢驗(yàn)α-SMA的表達(dá)CE組對(duì)比NC組(P=0.000<0.05)，AE組對(duì)比NC組(P=0.000<0.05)；TGF-β1的表達(dá)CE組對(duì)比NC組(P=0.000<0.05)，AE組對(duì)比NC組(P=0.000<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為觀察α-SMA、TGF-β1表達(dá)強(qiáng)度與天數(shù)之間的關(guān)系，繪制散點(diǎn)圖及擬合線，并進(jìn)行相關(guān)性分析如表4、圖9，CE組α-SMA的表達(dá)強(qiáng)度與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(P=0.000<0.05)，CE組TGF-β1的表達(dá)強(qiáng)度與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(P=0.000<0.05)，AE組α-SMA的表達(dá)強(qiáng)度與時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性(P=0.573>0.05)，AE組TGF-β1的表達(dá)強(qiáng)度與時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性(P=0.437>0.05)隨著細(xì)粒棘球蚴完整纖維外囊的形成，細(xì)粒棘球蚴周圍的α-SMA、TGF-β1表達(dá)降低，多房棘球蚴病灶周圍α-SMA、TGF-β1表達(dá)隨時(shí)間變化不明顯。

表3 小鼠肝組織中 鼠肝組織中和TGF-織中的表達(dá)Tab.3 Expression of α-SMA and TGF-β1 in mouse liver tissue

α-SMA IHC染色；A-F為CE組，G-L為AE組，M-R為對(duì)照組, 箭頭標(biāo)注為α-SMA表達(dá)區(qū)域(褐色),“*”標(biāo)注為包蟲(chóng)囊內(nèi)(×200)圖7 不同時(shí)期小鼠肝臟CE、AE標(biāo)本α-SMA IHC染色Fig.7 α-SMA IHC staining of CE and AE liver specimens in different periods

A-F為CE組，G-L為AE組，M-R為對(duì)照組,箭頭標(biāo)注為TGF-β1表達(dá)區(qū)域(褐色),“*”標(biāo)注為包蟲(chóng)囊內(nèi)(×200)圖8 不同時(shí)期小鼠肝臟CE、AE標(biāo)本TGF-β1 IHC染色Fig.8 TGF-β1 IHC staining of CE and AE liver specimens in different periods

圖9 CE、AE標(biāo)本α-SMA、TGF-β1表達(dá)強(qiáng)度與時(shí)間的的散點(diǎn)圖及其擬合線Fig.9 Scatter plot ofα-SMA and TGF-β1 expression intensity and time in CE and AE specimens, and draw the fitting line

表4 兩種包蟲(chóng)病病灶周圍α-SMA、TGF-β1表達(dá)強(qiáng)度與造模天數(shù)間的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between the expression intensity of α-SMA and TGF-β1 around the lesions of the two hydatid diseases and the days of modeling

3 討 論

CE、AE兩種疾病均為慢性占位性病變，但是在生長(zhǎng)模式、治療方案上有較大的差異。CE因?yàn)槠渑c周圍組織有明確的界線，轉(zhuǎn)移病灶較少，手術(shù)治療后可治愈[9-10]。AE雖然從組織病理學(xué)上看是一種良性疾病，但它表現(xiàn)出惡性疾病的特點(diǎn)，生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)周圍組織具有破壞性、侵犯鄰近器官和遠(yuǎn)處播散的特點(diǎn)[11]，因此被稱為“蟲(chóng)癌”。目前早期根治性手術(shù)可以提高患者生存質(zhì)量、生存周期[12]。兩種疾病引起周圍組織纖維化模式不同是造成以上差異的重要因素。

TGF-β通路是纖維化過(guò)程中重要的信號(hào)通路，其中TGF-β1被認(rèn)為是TGF-β通路的主要啟動(dòng)因子之一[13]。TGF-β1在組織修復(fù)、炎癥反應(yīng)、星狀細(xì)胞的活化及細(xì)胞外基質(zhì)分泌等過(guò)程中起主要調(diào)節(jié)作用[14]。在肝臟中TGF-β1是提高肝纖維化最有效的因子之一，可以激活肝星狀細(xì)胞，同時(shí)可以提高肉芽組織中成纖維細(xì)胞α-SMA mRNA的表達(dá)[15]。肝星狀細(xì)胞在纖維化過(guò)程中有重要作用，在炎癥及損傷等因素的過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞分泌多余的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在肝臟中導(dǎo)致纖維化[16]。肝星狀細(xì)胞在包蟲(chóng)的持續(xù)刺激下激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA[17]，因此在肝臟中α-SMA通常作為肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志物，反映了星狀細(xì)胞活化和由疾病引起的持續(xù)壞死性炎癥的進(jìn)展情況[18]。對(duì)細(xì)粒棘球蚴侵入肝臟，會(huì)引起病灶周圍炎癥反應(yīng)并形成肉芽腫[19]，肝星狀細(xì)胞被激活，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子導(dǎo)致ECM過(guò)度沉積即周圍肝組織纖維化形成完整致密的纖維外膜。纖維外膜的形成能在一定程度上限制棘球蚴的生長(zhǎng)發(fā)育，與周圍肝組織形成明確的界線；在完整的纖維外囊形成過(guò)程中，囊周的炎癥及肉芽組織增生反應(yīng)減弱直至消失，α-SMA、TGF-β1在囊周的表達(dá)也逐漸減弱，纖維化進(jìn)程也逐漸減緩；可以說(shuō)完整的纖維外囊可以減輕寄生蟲(chóng)與宿主間的抗原抗體反應(yīng)以及纖維化反應(yīng)。對(duì)于多房棘球蚴組，周圍肝組織彌漫性纖維化，無(wú)法形成完整致密的纖維外膜，囊周α-SMA、TGF-β持續(xù)高表達(dá)，可以認(rèn)為囊周持續(xù)有活躍的纖維化反應(yīng)，彌漫性纖維化無(wú)法限制棘球蚴的生長(zhǎng)發(fā)育，可以造成大面積肝組織纖維化、玻璃樣變纖維化，影響肝功能。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)多房棘球蚴相較于細(xì)粒棘球蚴病灶周圍I型膠原的表達(dá)較低。由于I型膠原和III型膠原結(jié)構(gòu)不同而具有不同的性質(zhì)。I型膠原由機(jī)械強(qiáng)度較高而順應(yīng)性較差的原纖維組成，而III型膠原纖維彈性好，順應(yīng)性較好，機(jī)械強(qiáng)度較低[20]。研究表明I/III型膠原比例對(duì)各種組織的功能完整性至關(guān)重要，增加I型膠原的降解或增加III型膠原的沉積可能有助于對(duì)抗組織間質(zhì)基質(zhì)的高強(qiáng)度低順應(yīng)性[21]。在擴(kuò)張性心肌病中I/III型膠原比例增高心臟的強(qiáng)度增大，組織順應(yīng)性下降[22-23]，III型分泌增多導(dǎo)致I/III型膠原比例降低，使得結(jié)締組織機(jī)械強(qiáng)度降低[24]。由圖3、4、6可見(jiàn)多房棘球蚴組囊周I/III型膠原比例小于細(xì)粒棘球蚴組，這也可能是細(xì)粒棘球蚴囊周產(chǎn)生連續(xù)致密纖維外囊而多房棘球蚴較少產(chǎn)生完整纖維外囊的原因之一。如果使多房棘球蚴囊周形成連續(xù)致密囊壁，將在一定程度上限制多房棘球蚴的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，減輕宿主炎癥反應(yīng)，同時(shí)有助于多房棘球蚴的手術(shù)治療。如何使多房棘球蚴囊周形成連續(xù)致密的纖維外膜，有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：邢稚坤，王二強(qiáng)，廖原，等.小鼠肝細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴病不同時(shí)期病灶周圍組織纖維化對(duì)比[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2021，37(11)：1008-1016. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.140