伏俊，任靜，昝春梅，嚴(yán)富天，李秀萼

(廣元市中心醫(yī)院，1.檢驗(yàn)科；2.特檢科；3.病理科；4.廣元市中醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 廣元 628000)

骨髓增生性腫瘤(myeloproliferative neoplasm，MPN)是克隆性造血干細(xì)胞腫瘤，特征為一種或多種骨髓細(xì)胞的增殖。大多數(shù)疾病影響中老年人群，且發(fā)病率逐年增加，易與血栓形成、栓塞或重要器官梗死并發(fā)[1]。盡早發(fā)現(xiàn)栓塞并及時采取干預(yù)措施，對降低患者死亡率意義重大。隨著研究的深入，目前發(fā)現(xiàn)MPN與個體的遺傳學(xué)突變密切相關(guān)，而JAK2 V617F基因突變位點(diǎn)是目前MPN最為特征性的遺傳學(xué)突變。國內(nèi)亦有研究[2]發(fā)現(xiàn)，JAK2 V617F突變陽性患者更易罹患血栓栓塞。目前，JAK2 V617F突變已被世界衛(wèi)生組織( WHO)列為 BCR/ ABL陰性 MPN的主要診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[3]。網(wǎng)織血小板由骨髓釋放，細(xì)胞漿內(nèi)含有殘留RNA，反映骨髓血小板增生的速度[4]。AK2V617F基因位點(diǎn)突變與網(wǎng)織血小板相互結(jié)合的檢測方法對早期診斷MPN有一定的應(yīng)用價值。本研究旨在探討JAK2 V617F基因突變及網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)與MPN并發(fā)血栓性疾病的相關(guān)性，為早期的干預(yù)治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年2月至2019年2月廣元市中心醫(yī)院收治的132例MPN患者為研究對象，是否并發(fā)血栓分為病例組(n=82)和血栓組(n=50)；另選40名同期體檢健康志愿者為對照組。病例組中，男性43 例，女性39 例；年齡31.6～75.3 歲，平均(44.7±4.6)歲。血栓組中，男性27例，女性22例；年齡32.8～77.5歲，平均(45.5±4.0)歲；對照組中，男性22名，女性18名；年齡31.4～75.9歲，平均(45.0±3.7)歲。本研究經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有對象知情同意。三組對象性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)“世界衛(wèi)生組織(WHO)相關(guān)MPN 新診斷標(biāo)準(zhǔn)”確診的患者，包括以下8種類型：慢性髓性白血病BCR/ABL1陽性(CML)、真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)、原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)、慢性中性粒細(xì)胞白血病(CNL)、慢性嗜酸性粒細(xì)胞白血病非特質(zhì)型(nototherwisespecified，CEL)、肥大細(xì)胞增多癥(mastocytosis)、骨髓增殖性腫瘤未分類型(MPN-U)；(2)年齡>18 歲；(3) 血栓事件經(jīng)計(jì)算機(jī)斷層掃描、磁共振成像、數(shù)字減影血管造影或彩色多普勒超聲證實(shí)，并由家進(jìn)一步診斷；(4) 臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他類型血液惡性疾病，如原發(fā)白血??；(2)其他引起血栓事件的疾病，如骨科手術(shù)、妊娠、房顫；(3)嚴(yán)重肝腎腦肺心等臟器功能障礙。

1.2 方法

1.2.1 網(wǎng)織血小板檢測 采集研究對象ETDA-K3抗凝全血3 mL，顛倒混勻 5～8 次，采用邁瑞B(yǎng)C- 6900自動血液分析儀檢測網(wǎng)狀血小板計(jì)數(shù)，試劑、質(zhì)控和校準(zhǔn)品均為配套(M-68FD染色液批號：2019101404等)。

1.2.2 JAK2V617基因突變檢測 (1)DNA提取：采用西安天隆全血基因組DNA提取試劑盒(批號：E01888070251等)提取， 操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。(2)PCR檢測：引物由上海之江生物合成，引物物序列為P5’- CCTCAGAACGTTGATGGCA-3’，P2r5’- ATTGCTTTCCTTTTTCACAACA-3’，Pnf5’-AGCATTTGGT TTTAAATTATGGAGTATATG-3’ 和Pmr5’-GTTTACTTACTCTCGTCTCCACAAAA-3’。擴(kuò)增條件：95 ℃反應(yīng)30 s、54 ℃反應(yīng)25 s、72 ℃反應(yīng)30 s，共40個循環(huán)，最后72 ℃反應(yīng)10 min 結(jié)束。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，產(chǎn)物為453 bp、279 bp (JAK2V617F 突變等位基因) 和 229 bp(野生型等位基因)。所有的實(shí)驗(yàn)室檢測均在廣元市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科由具備相應(yīng)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室老師完成，實(shí)驗(yàn)中所采購和使用的試劑均經(jīng)過CFDA批準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 三組網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)及JAK2V617基因突變陽性率比較

三組網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)及JAK2V617基因突變陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且血栓組>病例組>對照組。見表1。

表1 三組對象網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)及JAK2V617基因突變陽性率比較

2.2 網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)及JAK2V617基因突變與血栓形成的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)及JAK2V617基因突變與血栓形成呈正相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)及JAK2 V617 基因突變與血栓形成的相關(guān)性

3 討論

隨著MPN患者數(shù)量的增加，且大多數(shù)涉及中老年人，容易出現(xiàn)血栓形成、栓塞或重要器官梗塞等并發(fā)癥[5]。血小板是由骨髓成熟的巨核細(xì)胞所產(chǎn)生，而網(wǎng)織血小板是巨核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為血小板過程中的一個幼稚階段，可以反映骨髓血小板增生的速度。本研究結(jié)果顯示，三組對象網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且血栓組>病例組>對照組，與既往研究[6-7]結(jié)果一致，表明MPN患者存在血小板的異常增生，而血小板增多，會導(dǎo)致血液的凝固性增高，易誘發(fā)血栓的形成。

半個多世紀(jì)以來，通過對骨髓增殖性腫瘤持續(xù)研究，除了發(fā)現(xiàn)染色體 [t(9.22)(q34；q11)]形成 BCR/ ABL融合基因是MPN特異的分子標(biāo)記外，而在BCR/ ABL陰性患者(如 ET， PMF)中尚未發(fā)現(xiàn)類似的特征性分子生物學(xué)指標(biāo)，也沒有發(fā)現(xiàn)MPN早期診斷特異性較強(qiáng)的生物學(xué)指標(biāo)，而Baxter等在2005年文獻(xiàn)首次發(fā)現(xiàn)Janus kinase(JAK)2基因V617F突變存在于MPN患者，成為了此病研究的一大突破[8]。JAK2具備，通過對白細(xì)胞介素-3、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、促血小板生成素、促紅細(xì)胞生成素、生長因子等多種細(xì)胞因子的信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)、促進(jìn)細(xì)胞增殖[9]。多數(shù)學(xué)者[10]認(rèn)為，下游相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達(dá)異常是JAK2 基因突變后的主要繼發(fā)事件，可使一系列細(xì)胞產(chǎn)生過度增生，分別向粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、紅細(xì)胞分化，最終誘發(fā)MPN、血栓病變。在各種造血生長因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與JAK2V617基因的突變率及網(wǎng)狀血小板的生成狀態(tài)有著緊密的聯(lián)系，或可促進(jìn)或調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的増殖[11]。本研究結(jié)果也顯示，三組JAK2V617基因的突變率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且血栓組>病例組>對照組。相關(guān)性分析顯示，網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)及JAK2 V617F突變的陽性率呈正相關(guān)(P<0.05)，表明網(wǎng)織血小板升高及JAK2V617F突變的陽性率增加，MPN患者發(fā)生血栓的風(fēng)險更大。本研究的不足在于所收集的病例較少，且僅針對的疾病種類有限，今后將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，分析JAK2V617基因在多種血液病的突變狀況。

綜上，MPN患者并發(fā)血栓性疾病與網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)及JAK2 V617F 基因突變有一定的相關(guān)性，可能成為評估MPN患者血栓早期發(fā)生的實(shí)驗(yàn)室檢查手段。