何琳莉，黃一凡

(川北醫(yī)學(xué)院，1.病理學(xué)教研室；2.附屬醫(yī)院病理科，四川 南充 637000)

食管癌是一種臨床中非常多見的惡性腫瘤疾病，發(fā)病率和死亡率分別居全部惡性腫瘤疾病中的第八位和第六位[1-2]。目前，在食管癌高發(fā)地區(qū)的普查中仍以內(nèi)窺鏡檢查和食管拉網(wǎng)脫落細(xì)胞檢查為主，但篩查效率較低，局限性較大。因此，探討食管癌的發(fā)病機(jī)制，尋找和發(fā)現(xiàn)早期診斷生物標(biāo)志物至關(guān)重要。與大多數(shù)腫瘤一樣，食管癌是一種多基因參與、多因素作用、多階段發(fā)展的復(fù)雜性疾病，其發(fā)病機(jī)制仍然無法完全明確[3]。有研究者[4]認(rèn)為，有絲分裂相關(guān)蛋白在腫瘤中扮演著重要角色。目前，針對有絲分裂相關(guān)蛋白在腫瘤中的作用成為腫瘤研究的重要思路和熱點(diǎn)。本研究通過測定有絲分裂相關(guān)蛋白Xklp2靶蛋白(TPX2)、極光激酶A(Aurora-A)、F框/WD40蛋白基因(FBXW7)在食道癌的表達(dá)情況，探討三者之間及與腫瘤組織病理特征、五年生存率的相關(guān)性，為臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2012年1月至2013年12月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院127例食管癌患者存檔的癌組織及癌旁組織石蠟標(biāo)本，分別設(shè)為癌組織組和癌旁組織組；另選60例食管高級別上皮內(nèi)瘤變組織標(biāo)本為對照組。所有病例均未接受過任何臨床治療或者輔助治療，有完整的臨床資料；標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定處理，常規(guī)包埋、切片，切片規(guī)格均采取連續(xù)切取4 μm的組織切片，備用，并由病理科醫(yī)師重新閱片復(fù)核。

1.2 方法

1.2.1 TPX2、Aurora-A、FBXW7水平檢測 運(yùn)用免疫組化法(IHC)染色，EnVision System二步法顯色法檢測，具體操作如下：脫蠟、水化組織切片；預(yù)處理組織切片；蒸餾水漂洗，放置于TBS內(nèi)；阻斷內(nèi)源性氧化物酶；蒸餾水漂洗，置TBS 10 min；一抗孵育10～30 min；TBS漂洗10 min；EnVision TM孵育10～30 min；TBS漂洗10 min；色源底物溶液孵育10 min；蒸餾水漂洗；復(fù)染及封片，光鏡觀察。運(yùn)用已知陽性切片作為陽性對照；PBS代替一抗作為陰性對照組。一抗抗體(TPX2貨號：TA328025；Aurora-A 貨號：TA346888；FBXW7貨號：TA802834)與二抗試劑盒(貨號：SAP-9101)均購自北京中衫金橋生物有限公司，操作均嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行。

1.2.2 結(jié)果判斷 TPX2及FBXW7蛋白的陽性信號定位在細(xì)胞核內(nèi)，表現(xiàn)為棕黃色或黃色。Aurora-A蛋白的陽性信號定位在細(xì)胞漿內(nèi)，呈黃色顆?；蛘咦攸S色顆粒。由兩名有豐富經(jīng)驗的病理科醫(yī)師同時進(jìn)行雙盲閱片，每張切片隨機(jī)計數(shù)均在10個高倍鏡下(×400)視野中表現(xiàn)為陽性細(xì)胞，即可判斷[5]：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分，無著色為0分；陽性范圍>75%為4分，51%～75%為3分，26%～50%為2分，5%～25%為1分，<5%為0分；上述兩項分?jǐn)?shù)總分，作為最終判斷結(jié)果；4～7分為強(qiáng)陽性(++)，2～3分為弱陽性(+)，<2分為陰性(1)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同組織TPX2、Aurora-A、FBXW7蛋白表達(dá)陽性率比較

癌組織組TPX2、Aurora-A、FBXW7蛋白陽性率高于癌旁組織組和對照組(P<0.05)，且對照組高于癌旁組織組(P<0.05)。見圖1、圖2、圖3及表1。

表1 不同組織TPX2、Aurora-A、FBXW7蛋白陽性表達(dá)率比較[n(%)]

2.2 TPX2、Aurora-A、FBXW7蛋白與食管癌臨床病理特征的關(guān)系

不同食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TPX2蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同腫塊浸潤深度、食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Aurora-A蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同臨床病理特征食管癌的FBXW7蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 TPX2、Aurora-A、FBXW7蛋白與食管癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 TPX2、Aurora-A、FBXW7蛋白表達(dá)的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，Aurora-A與TPX2的表達(dá)呈正相關(guān)(r=5.581，P<0.05)；Aurora-A與FBXW7的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-3.514，P<0.05)；TPX2與FBXW7的表達(dá)無明顯相關(guān)性(r=0.362，P>0.05)。見表3、表4及表5。

表3 TPX2與Aurora-A蛋白表達(dá)的相關(guān)性[n(%)]

表4 TPX2與FBXW7蛋白表達(dá)的相關(guān)性[n(%)]

表5 Aurora-A與FBXW7蛋白表達(dá)的相關(guān)性[n(%)]

2.4 TPX2、Aurora-A、FBXW7蛋白表達(dá)與食管癌患者5年生存率的相關(guān)性

患者5年隨訪平均生存時間為2.32年，其中TPX2、Aurora-A、FBXW7陰性表達(dá)51例患者平均生存時間為3.63年，生存率為68.63%(35/51)；TPX2、Aurora-A、FBXW7陽性表達(dá)58例患者平均生存時間為1.01年，生存率為18.97%(11/58)。生存率分析結(jié)果顯示，TPX2與食管癌患者5年生存率相關(guān)(P=0.026)，Aurora-A與FBXW7與患者預(yù)后無明顯相關(guān)性(P=0.639、0.727)。見圖4。

3 討論

腫瘤通常是在機(jī)體各種不同致癌成分共同作用下，組織中某個細(xì)胞的基因水平出現(xiàn)異常調(diào)控而發(fā)生克隆性的非正常增生導(dǎo)致的異常病變現(xiàn)象[6]。有絲分裂相關(guān)蛋白可參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及周期分布等生物學(xué)功能的調(diào)控[7]。Samson等[8]首次明確了有絲分裂相關(guān)蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。隨后關(guān)于有絲分裂相關(guān)蛋白參與腫瘤疾病生物學(xué)功能的相關(guān)研究成果也隨之逐漸明確。

研究[9]成果表明，在宮頸癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤疾病中，TPX2呈現(xiàn)為呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)，且陽性表達(dá)率為70%～95%。本研究結(jié)果顯示，TPX2陽性率在癌旁組織、食管高級別上皮內(nèi)瘤變和癌組織的表達(dá)率依次增高(P<0.05)，陽性表達(dá)率為59.84%(76/127)，可能與病例選擇的差異有關(guān)。相關(guān)性及生存分析發(fā)現(xiàn)，TPX2蛋白表達(dá)水平與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，且與食管癌患者5年生存率相關(guān)(P<0.05)。TPX2是有絲分裂過程中的一種核增生性相關(guān)蛋白，表達(dá)受嚴(yán)格的控制。Liu等[10]研究認(rèn)為，TPX2的刺激能夠促使T-Loop中較為保守的T288在有絲分裂雙極紡錘體柱組裝期間發(fā)揮磷酸化作用，從而促使Aurora-A被迅速的激活。另有研究[11]證實(shí)，在有絲分裂過程中，TPX2既參與了微管的形成及中心體酶的活化，還可對Aurora-A進(jìn)行調(diào)節(jié)，使其能夠與其他蛋白形成相互作用，表明在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中，TPX2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)中可能參與了眾多基因表達(dá)，并且發(fā)揮了非常很重要的協(xié)同作用，并且在預(yù)后判斷上具有較高的應(yīng)用價值。

本研究中，Aurora-A陽性表達(dá)率為48.82%(62/127)，低于已有研究，可能與病例選擇、標(biāo)本處理方法和操作方法的差異有關(guān)。相關(guān)性分析顯示， Aurora-A蛋白表達(dá)水平與腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，表明在組織病變過程中，Aurora-A發(fā)揮部分作用。生存分析發(fā)現(xiàn)，Aurora-A與患者5年生存率無相關(guān)性(P>0.05)，表明Aurora-A在食管癌預(yù)后診斷中價值不高。Aurora-A是一種具有較高保守度的C末尾催化結(jié)構(gòu)域，主要的功能是在啟動子的參與下，實(shí)現(xiàn)中心體的分離、復(fù)制，是DNA正常復(fù)制至關(guān)重要的調(diào)節(jié)器[12]。既往研究[13]也發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌、卵巢正常組織的細(xì)胞質(zhì)中均能檢測到Aurora-A蛋白表達(dá)，尤其在卵巢癌中呈現(xiàn)為非常顯著的高表達(dá)。

有研究[14]表明，在子宮頸癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤疾病中，F(xiàn)BXW7均呈現(xiàn)低表達(dá)，陽性表達(dá)率為20%～35%。本研究結(jié)果顯示，癌組織中FBXW7陽性率高于食管高級別上皮內(nèi)瘤變和癌旁組織(P<0.05)，與上述結(jié)論一致，表明隨著疾病的惡化，F(xiàn)BXW7蛋白的抑制作用也越來越明顯；而FBXW7的陽性表達(dá)率(45.67%)高于上述研究結(jié)果，可能也與病例選擇的差異有關(guān)。FBXW7是F-box蛋白中非常重要的家族成員，能夠?qū)崿F(xiàn)對原癌基因表達(dá)蛋白產(chǎn)物的快速降解，以此來實(shí)現(xiàn)對腫瘤的有效抑制[15]。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXW7蛋白與各項病理特征均無相關(guān)性(P>0.05)，推測可能是在食管癌的發(fā)生發(fā)展期間，F(xiàn)BXW7并非呈現(xiàn)為絕對的陽性表達(dá)，僅是在其中發(fā)揮著一部分的作用。FBXW7與食管癌患者5年生存率也無明顯相關(guān)性(P>0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了FBXW7的協(xié)作作用。

綜上所述，在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中，有絲分裂相關(guān)蛋白TPX2、Aurora-A、FBXW7均有參與，其中TPX2的參與作用更大，Aurora-A、FBXW7更多的是協(xié)同作用，故在預(yù)后診斷中，TPX2具有較高價值。