文/林炳明 李吉明 張小東 張智

本研究基于DNA條形碼技術(shù)，對(duì)連城扁圓吻鲴池塘群體的序列變異、遺傳多樣性和種群歷史動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，連城扁圓吻鲴池塘群體的遺傳多樣性低于已報(bào)道的鲴亞科其他魚類，應(yīng)通過(guò)增加親本數(shù)量、增加不同品系的親本來(lái)源進(jìn)行人工繁殖等措施，保證連城扁圓吻鲴池塘群體基因庫(kù)的穩(wěn)定，提高遺傳多樣性，維持種質(zhì)資源活力。

扁圓吻鲴（Distoechodon compressus），隸屬于鯉科，鲴亞科，圓吻鲴屬，是一種主要分布于我國(guó)福建、江西、臺(tái)灣的小型淡水經(jīng)濟(jì)魚類。扁圓吻鲴能夠顯著控制水體藻類暴發(fā)，在改善內(nèi)河水質(zhì)，特別是在美化鄉(xiāng)村河流環(huán)境上發(fā)揮了重要作用，具有重要的生態(tài)意義。隨著人工繁育技術(shù)的攻克，扁圓吻鲴在福建省龍巖市已成為主要增殖對(duì)象，體現(xiàn)了較高的生態(tài)效益和社會(huì)效益。

DNA條形碼（DNA barcode）作為一種重要的分子生物學(xué)技術(shù)，不僅使傳統(tǒng)分類學(xué)研究得到了進(jìn)一步發(fā)展，而且加速了生物資源的保藏、鑒定和遺傳多樣性評(píng)估工作，推動(dòng)了生物資源的有效利用。目前，DNA條形碼技術(shù)廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品貿(mào)易領(lǐng)域和生物多樣性資源評(píng)估等方面。

隨著扁圓吻鲴增殖技術(shù)的發(fā)展，其遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)，特別是種群遺傳學(xué)特征需得到關(guān)注，以避免出現(xiàn)近交衰退等情況，而目前尚無(wú)扁圓吻鲴遺傳多樣性的相關(guān)研究報(bào)道。本研究基于DNA條形碼技術(shù)對(duì)扁圓吻鲴連城池塘群體的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估，以期更全面了解扁圓吻鲴種質(zhì)資源，同時(shí)為將來(lái)DNA條形碼技術(shù)在漁業(yè)資源調(diào)查、漁業(yè)監(jiān)管和生物多樣性保護(hù)等方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料與方法

（一）研究材料

扁圓吻鲴樣本采自福建省連城縣吉明魚苗養(yǎng)殖有限公司，樣本量為30尾。采集的扁圓吻鲴樣本根據(jù)《福建魚類志》進(jìn)行物種鑒定后，取背部肌肉保存于95%濃度的酒精溶液中，備用。

（二）室內(nèi)實(shí)驗(yàn)

剪取15mg肌肉組織，通過(guò)高鹽法提取扁圓吻鲴基因組總DNA，利用超微量紫外可見光分光光度計(jì)，檢測(cè)所提取的DNA濃度和純度。采用魚類DNA條形碼通用引物（線粒體COⅠ基因；引物序列：正向5'-TCAACCA ACCACAAAGACATTGGCAC-3'；反向5'-TAGACTTCTGGGTGGCCA AAGAATCA-3'）。PCR反應(yīng)總體積為30μL，包括10×PCR buffer3μL、dNTP 1.5μL、上下游引物各1μL、基因組DNA模板1μL、Taq酶0.25μL、dd H2O 22.25μL；PCR程序設(shè)定為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，54℃退火45s，72℃延伸1min，以上反應(yīng)35次循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

（三）數(shù)據(jù)分析

通過(guò)ClustalX和Seaview軟件進(jìn)行比對(duì)、校正并保存為不同格式的文件。序列變異、堿基組成等信息通過(guò)MegaX軟件進(jìn)行分析，計(jì)算整體堿基轉(zhuǎn)換顛換比（transition/transversion）。利用DnaSP軟件計(jì)算扁圓吻鲴池塘群體的單倍型多樣性（Haplotypediversity，Hd）和核苷酸多樣性（Nucleotidediversity，Pi），并分析單倍型組成情況。利用Arlequin軟件對(duì)全部個(gè)體進(jìn)行Tajima's D和Fu's Fs中性檢驗(yàn)，同時(shí)，結(jié)合DnaSP軟件進(jìn)行的核苷酸錯(cuò)配分析，判斷群體歷史動(dòng)態(tài)是否經(jīng)歷了群體擴(kuò)張或瓶頸效應(yīng)。

二、結(jié)果與討論

（一）序列變異情況

扁圓吻鲴標(biāo)本

本研究共獲得連城扁圓吻鲴池塘群體29條線粒體COⅠ基因序列，長(zhǎng)度為651bp。共檢測(cè)到13個(gè)變異位點(diǎn)，占總堿基數(shù)的2.0%，其中，單突變位點(diǎn)12個(gè)、多態(tài)信息位點(diǎn)1個(gè)。變異位點(diǎn)數(shù)量遠(yuǎn)低于其他鯉科魚類，表明扁圓吻鲴多樣性程度較低，種質(zhì)資源較單一。所有個(gè)體的平均堿基組成分別為：A（25.48%）、T（29.03%）、G（18.45%）、C（27.04%）。A+T的含量顯著高于C+G的含量，堿基組成存在強(qiáng)烈的偏倚現(xiàn)象。堿基轉(zhuǎn)換顛換比高達(dá)219.997，這一結(jié)果遠(yuǎn)高于其他鯉科魚類的研究結(jié)果，表明該序列進(jìn)化更為保守。

（二）單倍型分布情況

在獲得的29條線粒體COⅠ基因序列中，僅檢測(cè)到3個(gè)單倍型，其中，2個(gè)單倍型為共享單倍型，Hap-1包含25個(gè)個(gè)體，Hap-2包含3個(gè)個(gè)體，Hap-3僅有1個(gè)個(gè)體。

（三）遺傳多樣性情況

經(jīng)計(jì)算，連城扁圓吻鲴池塘群體的單倍型多樣性為0.254，核苷酸多樣性為0.00157。與已報(bào)道的鲴亞科魚類遺傳多樣性相比（表1），結(jié)果顯示，連城扁圓吻鲴池塘群體的單倍型多樣性僅高于細(xì)鱗鲴千島湖（富文）（臨歧）兩群體，核苷酸多樣性僅高于銀鲴錢塘江群體，遺傳多樣性水平偏低。

表1 已報(bào)道的基于COI基因的鲴亞科魚類遺傳多樣性比較

（四）群體歷史動(dòng)態(tài)

種群歷史動(dòng)態(tài)分析是通過(guò)保守序列的核苷酸變異情況，推斷該種群的進(jìn)化速率及其進(jìn)化歷史事件。目前，主要以Tajima's D和Fu's Fs兩種常用指標(biāo)，進(jìn)行種群歷史上是否存在擴(kuò)張的判定。當(dāng)檢測(cè)到二者呈顯著負(fù)值，則表明該種群在歷史上存在擴(kuò)張跡象，而兩個(gè)值趨于0時(shí)則說(shuō)明種群歷史保持穩(wěn)定。本研究基于Arlequin軟件中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示：Tajima's D值為-2.30148（p＜0.01），呈顯著負(fù)值，但Fu's Fs值為1.63749（p=0.829），未呈顯著負(fù)值。相對(duì)而言，F(xiàn)u's Fs檢驗(yàn)對(duì)種群擴(kuò)張更加敏感。因此，連城扁圓吻鲴池塘群體的規(guī)模保持相對(duì)穩(wěn)定，未出現(xiàn)擴(kuò)張跡象。錯(cuò)配分析也支持這一觀點(diǎn)。

此外，有學(xué)者以0.5和0.5%作為判斷遺傳多樣性Hd和Pi大小的閾值，并基于此提出種群進(jìn)化歷史模型。本研究遺傳多樣性結(jié)果顯示，連城扁圓吻鲴池塘群體的Hd和Pi小于0.5或0.5%，提示該群體可能近期經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)（bottleneck effect）或奠基者效應(yīng)（founder effect）。盡管本研究對(duì)象為池塘群體，但無(wú)論基于線粒體COⅠ基因的遺傳多樣性分析，還是基于中性檢驗(yàn)或種群進(jìn)化歷史模型分析，都顯示扁圓吻鲴池塘種群遺傳多樣性水平較低，需引起重視。

三、結(jié)論

生物的遺傳多樣性水平是生物適應(yīng)環(huán)境和長(zhǎng)期進(jìn)化的產(chǎn)物，能夠直觀地顯示生物資源現(xiàn)狀及其開發(fā)利用情況，是評(píng)估生物資源現(xiàn)狀的一個(gè)重要參數(shù)。遺傳多樣性越高，即遺傳變異越豐富，生物的進(jìn)化潛力就越大，生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，其生存競(jìng)爭(zhēng)力就越強(qiáng)。

本研究通過(guò)DNA條形碼技術(shù)，對(duì)連城扁圓吻鲴池塘群體的序列變異、遺傳多樣性和種群歷史動(dòng)態(tài)進(jìn)行了分析，同時(shí)與已報(bào)道的鲴亞科魚類進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)連城扁圓吻鲴池塘群體的遺傳多樣性水平明顯偏低。而人工選育過(guò)程容易發(fā)生奠基者效應(yīng)、遺傳漂變、瓶頸效應(yīng)或近交衰退等現(xiàn)象，威脅著種質(zhì)資源的可持續(xù)利用。因此，在未來(lái)的資源利用和繁育等實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)連城扁圓吻鲴池塘群體遺傳多樣性的保護(hù)，采取有效措施，如增加親本數(shù)量、增加不同親本來(lái)源或選擇遺傳多樣性較高的親本等方式，對(duì)連城扁圓吻鲴池塘群體進(jìn)行良種選育，盡量加大有效繁殖群體的數(shù)量，降低近交衰退幾率。建議采取家系選育技術(shù)，篩選與表型相關(guān)的分子標(biāo)記，進(jìn)行多性狀復(fù)合育種，提高選育效率，以保證封閉群體基因庫(kù)穩(wěn)定，保證扁圓吻鲴種質(zhì)資源健康、穩(wěn)定。