鄒瑞, 王青芬, 吳田

熱帶植物海巴戟抗寒株系選育

鄒瑞, 王青芬, 吳田*

(西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，國家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心，云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心，昆明 650224)

為了選育海巴戟()抗寒株系，拓寬種植范圍，在云南元江選擇8株海巴戟，采用石蠟切片法觀察葉片解剖結(jié)構(gòu)，并測(cè)量葉片的過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，對(duì)抗寒株系的甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)活性和表達(dá)進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，葉片解剖結(jié)構(gòu)表明有4株海巴戟葉片的柵海比較高，細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密，確定為抗寒性優(yōu)良的候選株系(5、6、8和12號(hào))。5號(hào)植株葉片經(jīng)低溫處理后的CAT、POD、SOD活性較高，MDA含量較低，確定為抗寒株系，且低溫處理后5號(hào)植株葉片的GPAT活性和基因表達(dá)水平均高于不抗寒材料。因此，海巴戟葉片通過增加?xùn)藕１群图?xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度，同時(shí)基因迅速應(yīng)答來提高抗寒性。

海巴戟；抗寒性；解剖結(jié)構(gòu)；甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶

海巴戟()，又稱諾麗(英文Noni的音譯)，是典型的熱帶植物，具有廣泛的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，具有抗氧化、消炎抑菌、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)肝臟和心血管等功能[1]，適宜在年均溫21℃～27℃的無霜區(qū)種植，不耐低溫，當(dāng)溫度低于5℃時(shí)，葉片開始發(fā)黃，若溫度持續(xù)降低葉片則發(fā)黑褐化，甚至植株脫水死亡[2]。近年來，極端氣溫頻發(fā)，嚴(yán)重影響了海巴戟產(chǎn)業(yè)，因此選育抗寒株系，增加溫度適應(yīng)性，擴(kuò)大種植范圍已成為其推廣的瓶頸問題。已有研究表明，葉片的形狀、厚度及其解剖結(jié)構(gòu)可作為植物抗寒性的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)[3]，葉片性狀在香蕉(spp.)[4]、可可()[5]、油棕()[6]等熱帶植物的抗寒性研究中占有重要地位，也篩選出一批抗寒性強(qiáng)的材料?？购詮?qiáng)的植物抗氧化酶活性較高[7]，過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等在抗寒性較強(qiáng)的植物中能夠快速響應(yīng)，而在抗寒性弱的植物中則緩慢合成[8–9]。植物的抗寒能力與葉綠體膜脂中順式不飽和脂肪酸磷脂酰甘油的水平密切相關(guān)[10]，甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(glycerol-3- phosphate acyltransferase, GPAT)是磷脂酰甘油生物合成過程中的第1個(gè)?；D(zhuǎn)移酶[11]，且對(duì)水稻()的研究表明，的表達(dá)水平與抗寒性有直接聯(lián)系[12–13]。

海巴戟原產(chǎn)于南太平洋島嶼，不耐寒，引種到我國云南熱區(qū)后，雖能基本適應(yīng)當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件,但云南熱區(qū)近年來頻發(fā)的低溫對(duì)海巴戟植株造成嚴(yán)重傷害。2015年12月，云南元江遭遇5℃的極端低溫，在海巴戟種植基地的海巴戟有的出現(xiàn)寒害現(xiàn)象，也有的正常生長(zhǎng)(圖1: A)，發(fā)生寒害的植株地上部分枯死，在溫度恢復(fù)后，經(jīng)臺(tái)刈可以在數(shù)月后萌發(fā)新枝(圖1: B, C)，暗示海巴戟對(duì)寒害有較積極的響應(yīng)機(jī)制。本研究以自然寒害發(fā)生后，在云南元江海巴戟種植基地中選擇8株抗寒海巴戟進(jìn)行研究，通過石蠟切片觀察葉片解剖結(jié)構(gòu)，測(cè)量葉片的CAT、POD、SOD、GPAT活性和丙二醛(MDA)含量及基因表達(dá)，以確定抗寒株系并分析其抗寒機(jī)理。

圖1 海巴戟。A: 寒害后的植株; B: 臺(tái)刈后1個(gè)月; C: 臺(tái)刈后4個(gè)月。

1 材料和方法

1.1 采樣和樣品處理

2017年5月，在云南省玉溪市元江縣海巴戟種植基地選擇12株海巴戟()并編號(hào),其中4株(No. 1～4)為2015年冬季發(fā)生寒害后地上部分枯死、臺(tái)刈后又發(fā)出新枝的植株，另8株為未受寒害影響植株(No. 5～12)。

1.2 葉片形態(tài)解剖觀察

每株取無病蟲害、健康的成熟葉片10片，剪切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，投入FAA固定液中固定，帶回實(shí)驗(yàn)室抽真空2 h，制成石蠟切片，在Nikon Eclipse CI顯微鏡下觀察并拍照，放大倍數(shù)為200倍, 用Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA)軟件測(cè)量各組織厚度，每張切片隨機(jī)挑選至少3個(gè)視野進(jìn)行拍照，每視野每個(gè)指標(biāo)隨機(jī)測(cè)量10次，共30個(gè)測(cè)量值，取平均值，計(jì)算葉片緊密度(CTR)、疏松度(SR)和柵海比(P/S)[14]，柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度；CTR%=柵欄組織厚度/葉片厚度×100%；SR%=海綿組織厚度/葉片厚度×100%。

1.3 低溫處理

取海巴戟植株中上部、位于向陽面無病蟲害、整齊均勻的成熟葉片，用保鮮盒包好帶回實(shí)驗(yàn)室,放入5℃冰箱進(jìn)行低溫處理。分別于0、2、12、24、48 h進(jìn)行取樣，液氮速凍后存于-80℃冰箱備用。

1.4 抗寒生理指標(biāo)測(cè)定

CAT、POD、SOD活性和MDA含量均按照蘇州格銳思生物科技公司的試劑盒說明書測(cè)定，用紫外分光光度計(jì)(Thermo scientific Evolution 201, USA)測(cè)定相應(yīng)波長(zhǎng)下的吸光值。3次重復(fù)。

1.5 GPAT活性測(cè)定

GPAT活性按照植物甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT) ELISA試劑盒(武漢酶免生物科技有限公司)說明書在酶標(biāo)儀(Tecan Austria GmbH 5082 Grodig, Austria)上測(cè)定。

1.6 GPAT表達(dá)分析

從本課題組前期海巴戟3代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(登錄號(hào)：SRR12716286)中查找到2個(gè)基因，設(shè)計(jì)qPCR引物(GPAT4F: 3?-GG- AAGAACCGGCCTAGAGAC-5?和GPAT4R: 3?-GG- CTCTCTGGATGACTCCCA-5?；GPAT9F: 3?-TCTA- AAGGCTGGTGAGACGC-5?和GPAT9R: 3?-TGCT- TAGGGCTAGGACGTGA-5?)，以海巴戟為內(nèi)參基因[15]，用熒光定量?jī)x(Roche Light Cycler 480, Swit)分析基因的表達(dá)情況，以2–△△CT計(jì)算表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行整理，用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(<0.05)數(shù)據(jù)的差異性。

2 結(jié)果和分析

2.1 葉片的解剖結(jié)構(gòu)

對(duì)海巴戟植株葉片進(jìn)行解剖觀察(圖2)，可見葉肉具有明顯的柵欄組織和海綿組織，屬于典型的異面葉。葉片橫切面構(gòu)造類似，上表皮均由排列緊密的單層細(xì)胞組成，無氣孔；其下是整齊而緊密的柵欄組織，細(xì)胞呈長(zhǎng)柱形，由1～2層細(xì)胞組成；柵欄組織下面為排列疏松多孔的海綿組織，細(xì)胞多為不規(guī)則球形；下表皮也由單層細(xì)胞組成，下表皮分布有氣孔。

圖2 海巴戟葉片的解剖結(jié)構(gòu)。1～12為植株編號(hào); a: 上表皮; b: 柵欄組織; c: 海綿組織; d: 下表皮。

柵海比 不同抗寒性的海巴戟葉片中的柵海比(P/S)差異顯著(圖3)。No. 5的P/S最大，達(dá)0.69,與No. 6、No. 8和No. 12的差異不顯著，但與其余8株的差異顯著(<0.05)；No. 1的最小，為0.42, 與No. 2的差異不顯著，與其余10株的差異均達(dá)顯著水平(<0.05)。

圖3 海巴戟葉片的柵海比(P/S)、緊密度(CTR)和疏松度(SR)。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

緊密度 海巴戟葉片結(jié)構(gòu)的緊密度(CTR)差異達(dá)顯著水平(圖3)。No. 5的CTR最大，達(dá)32.69%，與No. 3～4、No. 6和No. 8～12的差異不顯著，而與其余3株的差異顯著(<0.05)；No. 1的最小，為21.55%，與No. 2和No. 7的差異不顯著，與其余9株的差異顯著(<0.05)。

疏松度 海巴戟葉片結(jié)構(gòu)疏松度(SR)的差異顯著(圖3)。No. 2的SR最大，達(dá)54.16%，與No. 3和No. 9的差異不顯著，而與其余9株的差異顯著(<0.05)。No. 5的最小，為47.54%，與其余11株的差異顯著(<0.05)。

從葉片解剖結(jié)構(gòu)來看，初步選擇No. 5、No. 6、No. 8和No. 12號(hào)為抗寒性優(yōu)良的候選材料，而No. 1和No. 2的抗寒性最差，與田間觀察結(jié)果一致。

2.2 低溫對(duì)抗氧化能力的影響

低溫脅迫下12株海巴戟葉片的CAT活性差異顯著(圖4)，以No. 5的最高，與其余11株的差異顯著；其次是No. 8、No. 11和No. 12；不抗寒的No. 1號(hào)最低。低溫處理下12株海巴戟葉片的POD活性差異顯著(圖4)，以No. 8的最高，與其余11株的差異顯著；其次是No. 6、No. 5和No. 11；No. 1的最低?？梢?，No. 5抗寒性優(yōu)良，而No. 1不抗寒，No. 7的抗寒性一般，可作為對(duì)照材料，開展后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 低溫處理對(duì)海巴戟葉片的CAT、POD活性的影響

2.3 低溫處理時(shí)間對(duì)抗氧化能力的影響

低溫處理對(duì)抗寒性不同的海巴戟葉片的CAT、POD和SOD活性及MDA含量影響差異顯著(圖5)?？购腘o. 5葉片CAT活性隨低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)始終處于較高的水平，與另2株的差異顯著。No. 1低溫處理2和24 h的CAT活性低于No. 7，差異顯著。這說明海巴戟葉片CAT活性對(duì)低溫的響應(yīng)速度影響了材料的抗寒性，對(duì)低溫響應(yīng)越迅速越抗寒。低溫處理2 h，抗寒的No. 5葉片POD活性最強(qiáng)，此后逐漸降低，說明其遇低溫后POD能迅速響應(yīng)，并保持較高水平；No. 1和No. 7的POD活性變化趨勢(shì)與No. 5的相似，但活性水平均遠(yuǎn)低于No. 5, 說明No. 5具有較高的抗氧化活性?？购暂^好的No. 5葉片SOD活性較高，與No. 1和No. 7有顯著差異；不抗寒的No. 1葉片SOD活性顯著低于另2株，且隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)SOD活性不斷下降；抗寒性一般的No. 7葉片SOD活性在低溫處理12 h內(nèi)呈直線下降，24 h后出現(xiàn)明顯增高的趨勢(shì)。隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)No. 1和No. 5葉片的MDA含量曲線呈開口向下的拋物線，均在處理12 h時(shí)達(dá)到最高值，處理48 h時(shí)降至最低；No. 7葉片的MDA含量變化在前期與No. 1和No. 5一致，但處理48 h仍處于較高水平。No. 5葉片的MDA含量比No. 1和No. 7的低, No. 1在前期相對(duì)較高，No. 7則在后期相對(duì)較高。

圖5 低溫處理對(duì)海巴戟葉片的CAT、POD、SOD活性和MDA含量的影響

2.4 低溫處理對(duì)GPAT活性的影響

低溫處理下，抗寒性不同的海巴戟葉片中GPAT活性差異顯著(圖6)。No. 5葉片的GPAT活性隨低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)不斷上升，在處理前期表現(xiàn)不明顯，處理12 h后高于另2株；No. 1的約呈開口向下的拋物線趨勢(shì)，處理2 h時(shí)最高，在處理前期顯著高于另2株，后期介于No. 5和No. 7之間；No. 7葉片的GPAT活性變化趨勢(shì)與No. 5一致，但活性較低。

2.5 低溫處理對(duì)GPATs基因表達(dá)的影響

以No. 1和No. 5經(jīng)低溫處理的葉片cDNA為模板進(jìn)行qPCR分析。從圖6可見，隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，No. 5中的相對(duì)表達(dá)量不斷上升；而No. 1的呈開口向下的拋物線趨勢(shì)，處理12 h時(shí)達(dá)到最高。No. 5中的相對(duì)表達(dá)量則呈開口向下的拋物線趨勢(shì)，12 h時(shí)達(dá)到最高，而No. 1的呈下降趨勢(shì)。這表明和均參與了海巴戟的抗寒反應(yīng)，的表達(dá)量與GPAT活性變化趨勢(shì)基本一致，且表達(dá)量持續(xù)上升，推測(cè)其為海巴戟抗寒反應(yīng)中的關(guān)鍵基因。

3 結(jié)論和討論

3.1 葉片解剖結(jié)構(gòu)與抗寒性的關(guān)系

植物受到低溫脅迫后，其生理生化指標(biāo)易受環(huán)境的改變而發(fā)生不同的變化，但形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)是特定環(huán)境條件下形成的，不會(huì)因環(huán)境改變而發(fā)生較大變化。葉片是植物進(jìn)化過程中對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)敏感的器官之一[16]，葉片厚度、氣孔密度、柵欄組織/海綿組織比(P/S)等均與抗寒性密切相關(guān)[17]。郭學(xué)民等對(duì)桃樹()葉片解剖結(jié)構(gòu)的研究表明，葉片厚度等在一定程度上可以反映植物抗寒性[18]。有研究表明，植物的抗寒性與細(xì)胞緊密度呈正相關(guān)，與細(xì)胞疏松度呈負(fù)相關(guān)[19–21]。從本研究的12株海巴戟植株的葉片解剖結(jié)構(gòu)來看，抗寒性好的植株葉片的P/S較大，CTR較高，SR較低, 反之則CTR低，SR高。這與前人的研究結(jié)果一致。因此，可選用葉片解剖結(jié)構(gòu)作為海巴戟抗寒性鑒定的指標(biāo)之一。

圖6 低溫處理對(duì)海巴戟葉片GPAT活性和GPATs表達(dá)的影響

3.2 低溫脅迫與GPAT的關(guān)系

GPAT是磷脂酰甘油生物合成過程中的第1個(gè)?；D(zhuǎn)移酶，GPAT對(duì)底物?；哂羞x擇性差異, 影響著植物生物膜中PG分子的飽和程度，從而決定植物的抗寒性[22]?；?qū)χ参锟购缘挠绊懸训玫阶C實(shí)，將擬南芥()的質(zhì)體基因的cDNA轉(zhuǎn)入煙草()[23]和水稻()[24]中超表達(dá)能提高低溫抗性; 從番茄()中克隆了基因，在番茄中超表達(dá)基因，提高了抗低溫能力[25]。的相對(duì)表達(dá)量因植物的不同有很大的差異，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)多呈開口向下的拋物線趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)時(shí)間因植物而異[26–28]。本研究中，海巴戟葉片的表達(dá)量亦呈開口向下的拋物線，而的表達(dá)與GPAT活性變化趨勢(shì)一致，隨低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)上升，推測(cè)基因更可能是海巴戟抗寒過程中的關(guān)鍵基因，后續(xù)應(yīng)進(jìn)行深入研究。

3.3 海巴戟抗寒性研究的意義

海巴戟屬于熱帶植物，主要分布于南太平洋諸島嶼、東南亞等地，我國引種后主要集中在云南西雙版納、元江等熱區(qū)種植，盛產(chǎn)期后的海巴戟產(chǎn)量可達(dá)60 000～75 000 kg/hm2, 按目前的收購價(jià)4元/kg計(jì)算，種植海巴戟可獲得可觀的經(jīng)濟(jì)效益，平均年產(chǎn)值為240 000～300 000元/hm2，扣除45 000元/hm2的成本，種植海巴戟可獲得的年收益為195 000～ 255 000元/hm2。據(jù)統(tǒng)計(jì)，海巴戟產(chǎn)品的市場(chǎng)需求以每年約50%的速度增加，是全球最暢銷的健康產(chǎn)品之一，因此其市場(chǎng)前景非常廣闊，但海巴戟只有在赤道附近的熱區(qū)才能大量生長(zhǎng)繁殖，海巴戟產(chǎn)品一直供不應(yīng)求[29]。近年來，西雙版納和元江兩地極端天氣頻發(fā)，導(dǎo)致大多數(shù)海巴戟植株地上部分枯死，雖臺(tái)刈后可發(fā)新枝，但當(dāng)年的產(chǎn)量減半，對(duì)海巴戟產(chǎn)業(yè)造成了較大的損失。隨著海巴戟種植逐漸發(fā)展成為云南重要的特色產(chǎn)業(yè)，提高溫度適應(yīng)性，擴(kuò)大種植范圍已成為其推廣的瓶頸問題。雖然可以采用塑料大棚、溫室等一些保護(hù)措施，但通過在玉溪、昆明等地的種植表現(xiàn)，保護(hù)性栽培導(dǎo)致成本高、果實(shí)小且產(chǎn)量低, 因此進(jìn)行抗寒育種工作才是提高其抗寒性的根本措施。目前海巴戟No. 5植株作為抗寒株系正在進(jìn)行扦插繁殖，將在玉溪、昆明等地開展適應(yīng)性研究。此外，基因與提高海巴戟抗寒性密切相關(guān),后續(xù)亦可通過基因工程手段提高海巴戟的抗寒性。

本研究在自然寒害后篩選出海巴戟抗寒株系,且從細(xì)胞學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)等層面進(jìn)行了鑒定。海巴戟抗寒株系通過增加葉片的柵海比和結(jié)構(gòu)緊密度在細(xì)胞水平上提高抗寒性，并在寒害發(fā)生時(shí)通過基因的迅速應(yīng)答以提高GPAT活性，降低細(xì)胞膜流動(dòng)性，同時(shí)CAT、POD、SOD等保護(hù)酶也積極應(yīng)答以提高植株的抗氧化活性。

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Selective Breeding of Cold-resistant Strain for Tropical Plant

ZOU Rui, WANG Qingfen, WU Tian*

(College of Lamndscape Architecture and Horticuilture Sciences, Southwest Forestry University, Southwest Research Center for Engineering Techmology of Landscape Architecture, State Forestry and Grassland Acministration, Yunnam Engineering Research Center for Functional Flower Resources and Industrialization, Kumming 650224, China)

In order to select cold-resistant lines offor widen the range of planting, the leaf anatomic structures of eight plants growing in Yuanjiang, Yunnan, were observed by paraffin section method, and the activities of catalase (CAT), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD), and malondialdehyde (MDA) content were measured, and then, glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT) activity andgene expression in cold-resistant lines were quantitatively analyzed. The results showed that the leaves of 4 lines (No. 5, 6, 8, 12) had high ratio of palisade tissue to spongy tissue (P/S) with compact cell structure and low porosity, showing a certain cold resistance. The activities of CAT, POD, and SOD of No. 5 leaves were high, and the content of MDA was low after treated at low temperature, indicating that No. 5 was a cold-resistant line. After low temperature treatment, the GPAT activity andgene expression in No. 5 were higher than those in other plants. Therefore, the cold resistance ofleaves was improved by increasing P/S and cell structure tightness, as well as the rapid response ofgene.

; Cold resistance; Anatomic structure; Glycerol-3-phosphate acyltransferase

10.11926/jtsb.4373

2020-12-31

2021-03-12

云南省教育廳項(xiàng)目(2019Y0154)；國家林業(yè)與草原局推廣項(xiàng)目([2019]27)；國家留學(xué)基金項(xiàng)目(201908535030)資助

This work was supported by the Education Department of Yunnan Province (Grant No. 2019Y0154); the Extension Project of National Forestry and Grassland Administration (Grant No. [2019]27); and the Project for China Scholarship Council (Grant No. 201908535030).

鄒瑞(1995～ )，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿又参镉N。E-mail:zourui8556@dingtalk.com

通信作者Corresponding author. E-mail:wutianpotato@swfu.edu.cn.