余文權(quán), 林鄭和, 陳常頌, 鐘秋生, 游小妹, 陳志輝, 單睿陽, 阮其春

19個(gè)茶樹雜交新品系主要性狀比較及其遺傳多樣性分析

余文權(quán)1,2, 林鄭和1*, 陳常頌1, 鐘秋生1, 游小妹1, 陳志輝1, 單睿陽1, 阮其春1

(1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福州 350013; 2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 福州 350003)

為探討茶樹()種質(zhì)資源的遺傳背景，加快新品種選育進(jìn)程，對(duì)19份區(qū)試茶樹新品系的農(nóng)藝性狀進(jìn)行觀測，結(jié)合SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，新品系1001 (‘春綠2號(hào)’)、1017、46-6為特早生種，萌發(fā)期比對(duì)照‘福鼎大白’早10 d以上；除1001是小喬木外，其余品系均為灌木；新品系葉形多為長橢圓形，1017品系為近圓形，1011與1012品系為近橢圓形。利用48對(duì)SSR引物對(duì)19個(gè)茶樹新品系進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出231個(gè)等位基因(Na)，每對(duì)引物平均擴(kuò)增出4.8個(gè)；多態(tài)性信息含量(PIC)為0.14～0.85，平均0.55，PIC超過平均值(0.55)的有28對(duì)引物，占引物總數(shù)的58.33%。聚類分析表明，在遺傳距離為0.32時(shí)，29份種質(zhì)資源可分為4類，第一類有1009、‘黃玫瑰’、‘黃旦’和‘黃觀音’等4個(gè)，第二類有1011、1008、1014等16個(gè)，第三類有‘福鼎大白’、‘福云6號(hào)’、1017、1019、1015等5個(gè)；第四類有1001與‘早春毫’。這為茶樹新品種的選育提供了種質(zhì)資源。

茶樹；農(nóng)藝性狀；SSR；遺傳多樣性

福建有豐富的茶樹資源、悠久的產(chǎn)茶歷史、多茶類的共同發(fā)展，茶樹育種工作一直是茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)與重點(diǎn)工程。良種是提高茶葉質(zhì)量、實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品多樣化的最有效措施，尤其是無性系良種茶園具有發(fā)芽整齊，品質(zhì)穩(wěn)定，便于管理和加工等優(yōu)點(diǎn), 適宜于進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，其經(jīng)濟(jì)效益平均可比有性系茶園提高一倍以上。綜合分析我國和世界其他產(chǎn)茶國的茶葉發(fā)展史，茶葉生產(chǎn)的每一次飛躍總是與茶樹新品種的育成和利用分不開[1]。茶()是多年生木本植物，屬于山茶科(Theaceae)山茶屬茶組，復(fù)雜的遺傳背景、基因型高度雜合及環(huán)境因素的影響，使得傳統(tǒng)育種方法耗時(shí)長和效率低[2–4]，有的長達(dá)20 a以上。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的飛速發(fā)展，與以往的RAPD和ISSR標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記由于具有共顯性、位點(diǎn)豐富、多態(tài)性好、穩(wěn)定性高等諸多優(yōu)點(diǎn)而備受青睞，已廣泛應(yīng)用于DNA指紋圖譜繪制[5–6]、親緣關(guān)系分析[7–8]、連鎖圖譜構(gòu)建[9–11]和品種鑒定[12–14]等研究。

茶樹育種是為選育出符合社會(huì)發(fā)展需求的高效、優(yōu)質(zhì)品種。然而隨著生產(chǎn)的發(fā)展與市場需求的變化，茶樹育種目標(biāo)也隨之改變。20世紀(jì)80年代前，高產(chǎn)是主要的育種目標(biāo)；后來隨著名優(yōu)茶的崛起，早生品種、高產(chǎn)成為育種目標(biāo)；進(jìn)入21世紀(jì), 高香(品質(zhì))育種成為首要目標(biāo)；目前育種開始向多樣化方向發(fā)展，高香、高功能性成份育種或者特異葉色育種將成為主流。

本研究以‘福云6號(hào)’、‘金牡丹’等19個(gè)F1代雜交創(chuàng)新種質(zhì)為材料，對(duì)其主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析(芽期、葉類、樹型、生化等)和評(píng)價(jià)鑒定，利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行分析，旨在為今后茶樹種質(zhì)資源的開發(fā)和新品種選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

以茶樹() ‘福云6號(hào)’、‘金牡丹’等品種為母本，通過天然雜交獲得雜交創(chuàng)新種質(zhì)100個(gè)。經(jīng)單株制樣，有19個(gè)新品系的香氣獨(dú)特、長勢良好(表1)。采用短穗扦插進(jìn)行擴(kuò)繁后，建立品系比較試驗(yàn)，以‘福鼎大白’(綠茶)及‘黃旦’(烏龍茶)為對(duì)照種。

表1 新品系雜交親本

1.2 方法

在同一塊地，相同的施肥條件，每小區(qū)選定10株5 a生茶樹，按陳亮等[15]的標(biāo)準(zhǔn)觀測春梢生育期、樹型、樹姿、葉色。在春茶采摘前，茶樹隨機(jī)采摘一芽三葉初展新梢(留魚葉采)和成熟葉，測量新梢長度、新梢質(zhì)量等。

于2019年采集春茶第一批新梢頂端一芽二葉約100 g，當(dāng)蒸鍋水沸騰(100℃)時(shí)，將鮮葉平鋪在蒸板上蒸1 min，然后快速吹風(fēng)晾干表面水分，最后置于80℃烘箱中烘干(含水量低于5% )，制成蒸青樣，裝入密封袋或容器，在低溫(約4℃)干燥條件下保存?zhèn)溆?，水浸出物總量測定參照GB 8305-2013方法；茶多酚總量參照GB 8313-2008酒石酸鐵比色法測定；可溶性糖參照蒽酮比色法[16]測定；游離氨基酸含量測定參照GB/T 8314-2013方法[17]。

1.3 DNA的提取和PCR擴(kuò)增

取新稍嫩葉，迅速用冰塊冷凍，置于-80℃冰箱保存。DNA提取參照天根生化科技有限公司生產(chǎn)的植物基因組試劑盒(型號(hào)：DP320)說明書操作。參考林鄭和等[18]的方法，利用瓊脂糖凝膠電泳及紫外光/可見光分光光度計(jì)(Biochrom Libra S22)測定DNA濃度和純度。

SSR引物從已公開發(fā)表的茶樹SSR特異性引物網(wǎng)站(NCBI)上選取[19–20]，共60對(duì)引物，由上海生工有限公司合成。以親本‘福云6號(hào)’、‘金牡丹’基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的SSR特異性引物48對(duì)(表2)。PCR反應(yīng)體系共20L：ddH2O 12.4L、dNTP (10 nmol/L) 0.4L、DNA 2L、酶(2 U/L) 0.4L、10×PCR Buffer (Mg2+) 2L，以及正反向引物(10mol/L)各0.4L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min；然后94℃變性30 s，52℃～60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，140 V電壓下電泳70 min，銀染法顯色[21], 用凝膠成像儀拍照并記錄。

表2 SSR引物序列及特征

續(xù)表(Continued)

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS軟件(V 15.50)進(jìn)行差異顯著性(LSD法)分析，所有試驗(yàn)均重復(fù)3～4次(每個(gè)植株為１個(gè)重復(fù))。采用Excel 2007和SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用UPMGA方法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 農(nóng)藝性狀的觀察

春梢萌發(fā)期 氣候條件、土壤肥力等是影響茶樹萌發(fā)重要的外界因素。本研究所有新品種(系)都種植在同一塊地，土壤經(jīng)過深翻，肥力基本一致,且施肥、噴藥等管控措施均一致。從表3可見，新品系1001 (‘春綠2號(hào)’)、1017和46-6為特早生品種,與對(duì)照‘福鼎大白’相比，1001一芽一葉初展期早15 d, 一芽二葉初長期早16～17 d；新品系1017一芽一葉初長期早16～18 d，一芽二葉初長期早11～16 d；新品系46-6一芽一葉初長期早13～14 d，一芽二葉初長期早8～10 d。且屬于早生種的還有1015、1013、1016和‘黃2’，比‘福鼎大白’早2～7 d；屬于晚生種的有1007、1011和‘黃1’等，其余為中生種。

樹形 除1001是小喬木外，其余新品系均為灌木；除1001的樹姿直立外，其余新品系均為半開張或者開張。從葉片大小來看，有11個(gè)新品系為中葉，分別為1001、1003、1006、46-6、1013、‘黃1’、‘黃2’、1017、1012、1014和1016，其余8個(gè)新品系均為小葉，沒有大葉的。

成熟葉片性狀 從表4可見，葉長與葉寬均超過‘福鼎大白’和‘黃旦’的新品系有1001、‘黃1’、‘黃2’和1016。大部分新品系葉形為長橢圓形，1017為近圓形，1011和1012為近橢圓形。葉脈對(duì)數(shù)最多的是1013、1017和‘黃2’，均達(dá)12對(duì)以上。葉色除1003、‘黃1’、‘黃2’為黃綠色外，其余均為綠色。葉表面除1003、1012、1014為光滑外，其余均為微隆; 1007、1011、1012葉尖為鈍尖，其余均為漸尖; 1007、1011、1012葉基為近圓形，其余均為楔形。

春季新稍性狀 從表5可見，發(fā)芽密度大的新品系有1001和1006等9個(gè)，除‘黃1’發(fā)芽密度較稀疏外，其余發(fā)芽密度均為中等。新稍葉色為黃綠色的有1003、‘黃1’和‘黃2’，紫色的有1005、46-6、1013、1017、1009、1010、1011和1008，其余為綠色。一芽三葉最長的為1006，質(zhì)量最高的為1001。

2.2 生化分析

從表6可見，春稍一芽二葉的可溶性糖含量變化較大，最高的為1007 (7.1%)，其次為1001>1013> 1015>1010>1011>1016，最低的為‘黃1’ (3.7%), 超過對(duì)照‘黃旦’與‘福鼎大白’的有9個(gè)；水浸出物總量最高的是1009 (44.3%)，超過對(duì)照的有8個(gè)；茶多酚含量最高的是1017和1006，均為16.6%。新品系一芽二葉的游離氨基酸含量為2.0%～3.1%，其中最高的是1019 (3.1%)，咖啡堿含量為0.1～0.3 g/kg。

表3 新品種(系)的春梢萌發(fā)期(2019和2020年)

22～29為國家或者福建省審定過的品種。

22-29 are national or Fujian Province approved varieties.

表4 新品系成熟葉片性狀

=6

表5 春季新稍的芽葉性狀

=6

表6 春季新稍的生化性質(zhì)

=4; 同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(<0.05)。

=4; Data followed different letters indicate significant differences at 0.05 level.

2.3 SSR標(biāo)記分析

利用48對(duì)引物對(duì)19個(gè)茶樹新品系進(jìn)行SSR標(biāo)記擴(kuò)增，總共擴(kuò)增出231個(gè)等位基因(Na)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出4.8個(gè)，其中引物TM345和TM341分別擴(kuò)增出12和9個(gè)等位基因(表7)。擴(kuò)增的有效等位基因?yàn)?.17～7.36個(gè)，平均2.94個(gè)，其中引物TM345擴(kuò)增的有效等位基因達(dá)7.36個(gè)。引物的觀測雜合度為0.12～0.96，其中TM382的最高(0.96), TM579的最低(0.12)。期望雜合度為0.15～0.88，平均為0.61, 最大為0.88 (TM345), 最小為0.15(TM579)。Shannon信息指數(shù)為0.31～2.2，平均為1.15。多態(tài)性信息含量(PIC)為0.14～0.85，平均為0.55，其中TM345的最高(0.85)，TM579的最低(0.14)，超過平均值(0.55)的有28對(duì)引物，占總數(shù)的58.33%；基因多樣性指數(shù)為0.14～0.86，以TM345的最大(0.864 2), TM579的最小(0.144 2)，平均為0.596。說明所選引物具有鮮明的代表性，擴(kuò)增出的多態(tài)性情況良好。

2.4 聚類分析

基于葉片性狀與SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)對(duì)29個(gè)新品種(系)進(jìn)行聚類分析。從圖1可見，在遺傳距離為0.32處，29個(gè)新品種(系)可分為4類，第I類有1009、‘黃玫瑰’、‘黃旦’和‘黃觀音’等4個(gè)，第III類有‘福鼎大白茶’、‘福云6號(hào)’、1017、1019和1015等5個(gè);第IV類僅有1001和‘早春毫’，其余的均歸為第II類?？梢姡?001與‘早春毫’的遺傳關(guān)系較近，1009與‘黃觀音’的遺傳關(guān)系較近，1017、1019、1015與‘福鼎大白’的遺傳關(guān)系較近。

表7 19個(gè)茶樹新品系的SSR標(biāo)記擴(kuò)增

續(xù)表(Continued)

圖1 茶樹種質(zhì)聚類圖

3 結(jié)論和討論

茶樹新品種的培育在茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展中具有重要地位[1]，而茶樹種質(zhì)資源是品種創(chuàng)新的基礎(chǔ)，我國作為茶樹的原產(chǎn)地，茶樹種質(zhì)資源非常豐富[22]。農(nóng)藝性狀的觀測對(duì)茶樹新品種鑒定、選育及其分類都具有重要作用，是茶樹種質(zhì)資源最基礎(chǔ)的評(píng)價(jià)指標(biāo)[23]，也是茶樹進(jìn)行分類的重要依據(jù)之一。本研究結(jié)果，19個(gè)新品系中特早生種有1001、1017和46-6；除1001為小喬木外，其余品系均為灌木；葉長與葉寬均較大的有1001、‘黃1’、‘黃2’和1016；大部分新品系葉片為長橢圓形，1017為近圓形，1011和1012為近橢圓形，遺傳變異較大。李瑞等[24]調(diào)查了西北50份茶樹種質(zhì)資源的20個(gè)農(nóng)藝性狀，均存在不同程度的變異，篩選出4份表現(xiàn)優(yōu)良的種質(zhì); 王飛權(quán)等[25]調(diào)查了41份武夷名叢茶樹種質(zhì)的21個(gè)農(nóng)藝性狀，認(rèn)為地方種質(zhì)‘金鎖匙’、‘半天妖’、‘水金龜’和‘金羅漢’可在烏龍茶產(chǎn)品的開發(fā)與創(chuàng)新利用、優(yōu)良品種的選育等方面加以利用。

EST-SSR來自于基因的編碼區(qū)域，具有重現(xiàn)性好，對(duì)模板DNA要求不高，可提供基因組表達(dá)序列的差異，是分析遺傳多樣性、直接與性狀相關(guān)的有效標(biāo)記，并且可從EST數(shù)據(jù)庫中直接獲得，不需耗費(fèi)大量經(jīng)費(fèi)，通用性好[26]，已被廣泛應(yīng)用于多種作物的遺傳多樣性研究，如黍稷()[27]、梨(sp.)[28]、玉米()[29]、茶樹[10,30–31]等。本研究篩選出48對(duì)引物，每對(duì)引物可擴(kuò)增出等位基因4.8個(gè)，平均PIC為0.55，與福建茶樹種質(zhì)的平均PIC (0.56)相當(dāng)[32]，高于云南茶樹種質(zhì)的平均PIC (0.50)[33]。從分子水平上看，PIC越高，茶樹品種之間的遺傳差異越大，遺傳多樣性越高，同時(shí)也證明茶樹的遺傳背景相當(dāng)復(fù)雜[30]。PIC大于0.5時(shí)表明該基因?yàn)楦叨榷鄳B(tài)性；0.25

聚類分析結(jié)果表明多數(shù)新品系可以與親緣關(guān)系較近的母本聚在一起，說明種質(zhì)間具有較近的親緣關(guān)系，但也揭示了該新品系遺傳相似性很高，遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，應(yīng)廣泛收集地域相對(duì)較遠(yuǎn)、遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)的茶樹種質(zhì)進(jìn)行創(chuàng)新種質(zhì)。也可以通過積極引進(jìn)國外的優(yōu)異資源，挖掘國內(nèi)的野生資源，擴(kuò)大茶樹育種的種質(zhì)資源庫，加快我國茶樹育種步伐。1001未與母本‘福云6號(hào)’聚在一起，可能是受到其他茶樹品種的花粉影響。

目前，對(duì)茶樹種質(zhì)資源創(chuàng)新、研究、評(píng)價(jià)通常以分子標(biāo)記為主，并結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)。然而，分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)性狀間不具備足夠的相關(guān)性是當(dāng)前分子標(biāo)記單獨(dú)應(yīng)用于植物新品種特異性鑒定的瓶頸[34]。由于農(nóng)藝學(xué)(形態(tài)學(xué))性狀大部分為數(shù)量性狀，受微效多基因控制, 而SSR標(biāo)記通常位于基因組中的非轉(zhuǎn)錄區(qū)，被認(rèn)為是“中性”標(biāo)記，不具備明顯的生物學(xué)功能。劉洪等[34]認(rèn)為SSR標(biāo)記無法取代形態(tài)學(xué)性狀單獨(dú)用于花生品種特異性鑒定，理論上尋找與形態(tài)學(xué)性狀高度相關(guān)的SSR標(biāo)記存在很大難度。吳麗艷等[35]認(rèn)為雖然農(nóng)藝性狀和SSR標(biāo)記都將37份茄子()種質(zhì)資源劃分為4個(gè)類群，但大部分種質(zhì)的分子標(biāo)記與農(nóng)藝性狀的聚類結(jié)果一致性不高，這可能是由于農(nóng)藝(表型)性狀易受環(huán)境等外界因素的影響而存在差異。胡文舜等[36]報(bào)道19個(gè)枇杷雜交新品種(系)的遺傳相似系數(shù)為0.728～0.969，并未將紅肉與白肉的枇杷品種(系)間明顯劃分開。

與以往研究不同，本研究在明確茶樹母本種質(zhì)資源遺傳背景的基礎(chǔ)上，經(jīng)多年田間區(qū)域試驗(yàn)，篩選出在福建試種表現(xiàn)良好、品質(zhì)優(yōu)異、香氣獨(dú)特的茶樹種質(zhì)資源，符合福建當(dāng)?shù)叵M(fèi)需求，這為福建的茶樹發(fā)展提供了種質(zhì)基礎(chǔ)資料。

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Main Agronomic Characters and Genetic Diversity of 19 Cross New Lines of Tea Cultivars

YU Wenquan1,2, LIN Zhenghe1*, CHEN Changsong1, ZHONG Qiusheng1, YOU Xiaomei1, CHEN Zhihui1, SHAN Ruiyang1, RUAN Qichun1

(1. Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013, China; 2. Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003, China)

The aim was to explore the genetic background of tea () germplasm for accelerate the breeding of new varieties, the agronomic traits of 19 tea germplasms were observed, and the genetic diversity were analyzed by using SSR markers. The results showed that the new lines 1001 (‘chunlv 2’), 1017 and 46-6 were extra early cultivars, which germination stage was earlier more than 10 days than that of control (‘Fudingdabai’). Except 1001 line (‘chunlv2’) was small tree, the others were shrubs. The leaf shape of most new cultivars was long ellipse, except that 1017, 1011 and 1012 were circular or nearly circular. A total of 231 alleles were amplified from 19 tea germplasms by 48 SSR primers, with an average of 4.8 alleles per SSR. The polymorphism information content (PIC) ranged from 0.14 to 0.85 with an average of 0.55. The PIC of 28 pairs of primers was more than 0.55, accounting for 58.33% to the total of primers. The cluster analysis indicated that 27 tea germplasms could be divided into 4 categories at the genetic distance of 0.32, the first category included lines 1009, ‘Huangmeigui’, ‘Huangdan’ and ‘Huangguanyin’; the second category had 16 lines, such as 1011, 1008, and 1014, etc; the third category had ‘Fudingdabai’, ‘Fuyun 6’, 1017, 1019 and 1015; and the fourth category had 1001 and ‘Zaochunhao’. Therefore, these provide germplasm resources for breeding of new tea varieties.

; Agronomic trait; SSR; Genetic diversity

10.11926/jtsb.4376

2021-01-08

2021-03-19

福建省屬公益專項(xiàng)(2020R1029002, 2021R1029006); 國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-19); 福建省農(nóng)科院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(CXTD0008)資助

This work was supported by the Project for Public Welfare in Fujian (Grant No. 2020R1029002, 2021R1029006), the Project for National Tea Industry Technology System (Grant No. CARS-19), and the Project for Innovation Team of Fujian Academy of Agricultural Sciences (Grant No. CXTD0008).

余文權(quán)，男，博士，研究員，主要從事茶樹遺傳育種與生理生化。E-mail: 825938828@qq.com

通信作者 Corresponding author. E-mail: linzhenghe@126.com