沙愛龍 ，趙雪雯，何璐汐，黃燕婕

(1.重慶三峽學(xué)院教師教育學(xué)院，重慶 萬州 404120；2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院/重慶市渝東北特色生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，重慶 萬州 404120)

【研究意義】茶是生活中的常見飲品，飲茶與喝咖啡一樣，已成為人們?nèi)粘５纳盍?xí)慣。研究茶與咖啡的藥用價值，可使其更好、更正確的為人類所用?！厩叭搜芯窟M展】已有研究報道，二者均能興奮中樞神經(jīng)、影響心臟，是因為二者的成分中有相似物質(zhì)所致。茶葉中含有茶多酚、咖啡堿、茶堿、可可堿、茶氨酸、黃酮類化合物等主要成分[1]，其中所含茶多酚、咖啡堿、茶氨酸、黃酮等物質(zhì)與興奮神經(jīng)、影響心臟相關(guān)[2-4]。如有研究表明，提取自藤茶的黃酮類化合物對心肌損傷具有顯著保護作用[4]；茶多酚、茶氨酸對周圍神經(jīng)具有保護和修復(fù)作用[5-6]，其中湯銀娟等研究證實茶多酚能促進小鼠坐骨神經(jīng)的感覺功能和該神經(jīng)所支配的腓腸肌運動功能[5]。而普洱茶(Camelliasinensisvar.Assamica)和粗壯女貞苦丁茶[Ligustrumrobustum(Roxb.) Blume]中均含有茶多酚、茶氨酸、黃酮等成分[7-8]?！颈狙芯壳腥朦c】目前尚未見兩種茶對心臟、周圍神經(jīng)和骨骼肌收縮性的影響研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探究兩種茶提取物對牛蛙(RanacatesbianaShaw)離體心臟、在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌的影響及其作用機制，以期為兩種茶提取物在臨床上的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。牛蛙的心臟由心肌構(gòu)成，而其腓腸肌由骨骼肌構(gòu)成，心肌和骨骼肌在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、收縮性、興奮性、傳導(dǎo)性等生理特性和收縮機制方面均不盡相同，因此當(dāng)兩種茶提取物作用于牛蛙心臟和腓腸肌時，對二者生理特性影響程度和變化很可能不同。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

牛蛙54只，購于重慶市萬州區(qū)五橋永輝超市，體重340～380 g。

1.2 儀器

BL-420F生物信號采集處理系統(tǒng)、張力換能器和引導(dǎo)電極，成都泰盟軟件有限公司；iMark酶標(biāo)儀，美國Bio-RAD；UV-1200型紫外可見分光光度計，翱藝儀器(上海)有限公司；FA2004電子天平，上海津平科學(xué)儀器有限公司；臺式離心機，湖南平凡科技有限公司。

1.3 試劑

普洱茶(熟茶)，安寧海灣茶業(yè)有限責(zé)任公司；粗壯女貞苦丁茶，宜賓川紅茶葉集團有限公司；乙酰膽堿(Ach)ELISA試劑盒，美國cloud-clone公司；乙酰膽堿酯酶(A-CHE)測試盒，南京建成生物工程研究所；硝酸毛果蕓香堿和自制任氏液(6.5 g NaCl、0.14 g KCl、0.12 g CaCl2、0.2 g NaHCO3、0.01 g NaH2PO4、2 g 葡萄糖、1000 mL蒸餾水)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 普洱茶提取物和粗壯女貞苦丁茶提取物的制備 分別參照王友蘭等[9]和胡順莉等[10]方法制備兩種茶提取物：稱取普洱茶或苦丁茶2 g，放在紗布中，分別置于100 ℃沸蒸餾水中浸泡3次，每次30 min，合并3次濾液濃縮至100 mL，得高濃度(2.00 g/100 mL)普洱茶提取物或苦丁茶提取物。然后將高濃度溶液加倍稀釋，可得中濃度(1.00 g/100 mL)和低濃度(0.50 g/100 mL)普洱茶提取物或苦丁茶提取物。

1.4.2 制備牛蛙在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本，給藥及記錄 參照課題組先前的研究方法制備在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本[11]：破壞牛蛙腦和脊髓后，在股二頭肌和半膜肌之間的肌間溝內(nèi)用玻璃分針游離出坐骨神經(jīng)，將之輕挑至保護電極上；而后游離出腓腸肌，將腓腸肌通過張力換能器與BL-420F生物信號采集處理系統(tǒng)相連，記錄。將坐骨神經(jīng)、腓腸肌完全浸入到盛有普洱茶提取物或粗壯女貞苦丁茶提取物的培養(yǎng)皿中，浸泡10 min后立即記錄腓腸肌收縮各指標(biāo)。分別記錄給藥前和給藥后的標(biāo)本閾刺激、最大刺激和腓腸肌收縮潛伏期、收縮幅度、收縮時間、舒張時間。

1.4.3 兩種茶提取物對坐骨神經(jīng)-腓腸肌接頭處Ach含量和A-CHE活性的影響 使用鋒利刀片在坐骨神經(jīng)-腓腸肌接頭處取材，其中一部分標(biāo)本立即置于塑料管內(nèi)，密封后用液氮冷凍，以使乙酰膽堿酯酶失活，而后迅速用ELISA法檢測Ach含量，操作步驟按照美國cloud-clone公司所提供試劑盒說明書進行；另稱取0.1 g組織標(biāo)本，加入1 mL提取液冰浴勻漿，在4 ℃下8000 r/min離心10 min后取上清液，按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書測定A-CHE活性。

1.4.4 離體蛙心的制備及給藥 雙毀髓處死牛蛙，暴露蛙心，蛙心室插管固定后離體蛙心，連張力換能器和BL-420F生物信號采集處理系統(tǒng)。蛙心收縮曲線穩(wěn)定20 min后，分別灌注低、中、高濃度的普洱茶提取物或苦丁茶提取物，在每次灌流后均用任氏液進行3～5次沖洗，待牛蛙的心搏曲線穩(wěn)定后，再進行下一組實驗，并記錄、觀察蛙心收縮幅度變化。

1.4.5 兩種茶提取物對CaCl2誘導(dǎo)的牛蛙離體心臟收縮幅度的影響 待心臟收縮曲線穩(wěn)定后，向套管內(nèi)任氏液中滴加CaCl2(0.1 mol/L)2滴，作用6 min后加入高濃度普洱茶提取物或苦丁茶提取物，觀察記錄蛙心收縮幅度變化。另設(shè)一組用鹽酸維拉帕米(0.1 μmol/L)作為陽性對照。

1.4.6 兩種茶提取物對Ach誘導(dǎo)的牛蛙離體心臟收縮幅度的影響 向收縮曲線穩(wěn)定后的心臟灌流液中滴加Ach(0.1 μmol/L)2滴，作用6 min后加入高濃度普洱茶提取物或苦丁茶提取物，觀察記錄蛙心收縮幅度變化。另設(shè)一組用硝酸毛果蕓香堿(0.1 μmol/L)作為陽性對照。

1.4.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析 每組單收縮曲線中隨機選取3個，完成潛伏期(ms)、收縮時間(ms)、收縮幅度(g)、舒張時間(ms)的測定； 其中，收縮速率=收縮幅度/收縮時間，舒張速率=收縮幅度/舒張時間，單位皆為g/ms。抑制率=(給藥前平均值-給藥后平均值)/給藥前平均值，促進率=(給藥后平均值-給藥前平均值)/給藥前平均值。用SPSS 22.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。普洱茶或苦丁茶處理前后數(shù)據(jù)用配對t檢驗或單因素方差分析，進一步組間比較選用Dunnett-t檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種茶提取物對牛蛙在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌閾刺激、最大刺激和收縮潛伏期的影響比較

與浸潤前相比，兩種茶提取物浸潤后牛蛙在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌閾刺激、最大刺激和收縮潛伏期雖有一定程度減小，但差異均不顯著(P>0.05,表1)。表明普洱茶提取物和粗壯女貞苦丁茶提取物對牛蛙在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌的閾刺激、最大刺激和收縮潛伏期均無明顯影響。

2.2 兩種茶提取物對牛蛙在體腓腸肌收縮幅度、收縮速率、舒張速率和坐骨神經(jīng)-腓腸肌接頭處Ach含量、A-CHE活性的影響比較

坐骨神經(jīng)-腓腸肌接頭處興奮的傳遞過程需要電信號觸發(fā)接頭前膜的Ca2+通道，突觸囊泡量子釋放出Ach，Ach與終板膜中N2型Ach受體陽離子通道結(jié)合引起終板電位，從而完成興奮傳遞，隨后Ach會被終板膜中乙酰膽堿酯酶水解[12]。由表2可知，與浸潤前相比，兩種茶提取物浸潤后牛蛙在體腓腸肌收縮幅度、收縮速率和坐骨神經(jīng)-腓腸肌接頭處Ach含量均極顯著增加(P<0.01)，腓腸肌舒張速率也明顯變快，其中普洱茶提取物差異極顯著(P<0.01)，粗壯女貞苦丁茶提取物差異顯著(P<0.05)。而兩種茶提取物浸潤后坐骨神經(jīng)-腓腸肌接頭處A-CHE活性均極顯著降低(P<0.01)。表明兩種茶提取物均對牛蛙在體腓腸肌的收縮幅度、收縮速率、舒張速率和坐骨神經(jīng)-腓腸肌接頭處Ach含量、A-CHE活性有明顯影響，其中普洱茶提取物較粗壯女貞苦丁茶提取物影響更明顯。

已有研究表明，普洱茶主要成分有茶色素、茶多酚、茶多糖、茶氨酸、生物堿、黃酮類等[7]。其中茶色素含量高達(dá)15.19%～18.28%，茶多酚含量也可達(dá)9.03%～11.33%[7]。粗壯女貞苦丁茶主要成分有茶多酚、茶多糖、茶色素、生物堿、單萜類、黃酮類等[8]。其中茶多糖含量高達(dá)10.57%，茶多酚含量也可達(dá)8.80%[8]。本實驗結(jié)果提示：普洱茶及粗壯女貞苦丁茶中的茶多酚可能作為非選擇性磷酸二酯酶(PDE)抑制劑，通過抑制對環(huán)磷酸腺苷(cAMP)有水解作用的PDE3和PDE4，以及對環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)有水解作用的PDE5，進而使細(xì)胞內(nèi)cAMP和cGMP水平升高，接著cAMP激活蛋白激酶A (PKA)、cGMP激活蛋白激酶G (PKG)[13]，促進終池內(nèi)Ca2+進入肌漿，使肌漿內(nèi)Ca2+濃度升高，最終與肌鈣蛋白結(jié)合導(dǎo)致腓腸肌收縮增強。此外，兩種茶提取物均能通過抑制牛蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌接頭處乙酰膽堿酯酶活性，從而使接頭處Ach含量增加，最終促進腓腸肌收縮。

表1 兩種茶提取物對牛蛙在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌閾刺激、最大刺激和收縮潛伏期的影響比較

表2 兩種茶提取物對牛蛙在體腓腸肌收縮幅度、收縮速率、舒張速率和坐骨神經(jīng)-腓腸肌接頭處Ach含量、A-CHE活性的影響比較

2.3 兩種茶提取物對牛蛙離體心臟收縮幅度的影響

由表3可知，與給藥前相比，不同濃度的普洱茶提取物和苦丁茶提取物對牛蛙離體心臟收縮幅度都具有一定的抑制作用，其中苦丁茶低濃度組影響不顯著(P>0.05)，苦丁茶中濃度組和普洱茶低濃度組影響顯著(P<0.05)，而苦丁茶高濃度組和普洱茶中、高濃度組影響均極顯著(P<0.01)，且隨茶提取物濃度的升高抑制率逐漸增強，呈一定的量效關(guān)系。相比較而言，同濃度的普洱茶提取物較苦丁茶提取物對牛蛙離體心臟收縮抑制更明顯。

有研究表明，藤茶可通過舒張心肌、減緩心肌細(xì)胞凋亡、抑制動脈粥樣硬化而保護心血管[4,14]。與本實驗中普洱茶、苦丁茶的功效有相同之處。張毓等[15]和傅雷等[16]研究均表明，茶色素可使正常離體蛙心和心肌缺血蛙心的心肌收縮力增強，他們的研究結(jié)果均與本實驗研究結(jié)果相反。普洱茶和苦丁茶的活性成分中均有茶色素[7-8]，但本研究表明普洱茶和苦丁茶對離體蛙心收縮具有抑制作用，充分說明普洱茶和苦丁茶中還具備抑制心臟收縮活性成分，該成分對蛙心收縮的抑制作用大于茶色素對蛙心收縮的促進作用，且普洱茶中該成分含量要高于苦丁茶。但具體是哪種活性成分對心臟收縮具有如此強的抑制作用，尚待進一步研究。

2.4 兩種茶提取物對CaCl2誘導(dǎo)的牛蛙離體心臟收縮幅度的影響

心肌產(chǎn)生興奮后通過興奮-收縮耦聯(lián)使胞內(nèi)Ca2+濃度升高，再引發(fā)肌絲滑行而收縮心肌[17]。心肌細(xì)胞內(nèi)所含Ca2+較少，主要來源于胞外，并對細(xì)胞外Ca2+的變化及藥物作用十分敏感[18]。由表4可知，與給藥前相比，單獨應(yīng)用CaCl2極顯著增加了牛蛙離體心臟收縮幅度(P<0.01)。加入普洱茶提取物(2.00 g/100 mL)后，收縮幅度極顯著降低(P<0.01)，作用效果與鹽酸維拉帕米陽性對照相當(dāng)。當(dāng)加入苦丁茶提取物(2.00 g/100 mL)后，收縮幅度顯著降低(P<0.05)，作用效果與鹽酸維拉帕米相比要差一些，鹽酸維拉帕米與CaCl2相比差異極顯著(P<0.01)。鹽酸維拉帕米為常用的L型鈣通道(ICa-L)阻斷藥，因此說明普洱茶和苦丁茶可能對ICa-L具有阻斷作用，使胞外Ca2+內(nèi)流減少。

2.5 兩種茶提取物對Ach誘導(dǎo)的牛蛙離體心臟收縮幅度的影響

由表5可知，與給藥前相比，單獨應(yīng)用Ach極顯著降低了牛蛙離體心臟收縮幅度(P<0.01)。加入普洱茶提取物(2.00 g/100 mL)后，收縮幅度進一步下降，與Ach相比差異極顯著(P<0.01)，作用效果與硝酸毛果蕓香堿相當(dāng)。當(dāng)加入苦丁茶提取物(2.00 g/100 mL)后，收縮幅度也進一步下降，與Ach相比差異顯著(P<0.05)，作用效果與硝酸毛果蕓香堿相比要差一些，硝酸毛果蕓香堿與Ach相比差異極顯著(P<0.01)。硝酸毛果蕓香堿為常用的M膽堿受體激動藥，說明普洱茶和苦丁茶可激活心肌細(xì)胞膜上的M受體，使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度減少，抑制胞外Ca2+內(nèi)流。

表3 兩種茶提取物對牛蛙離體心臟收縮幅度的影響

表4 兩種茶提取物對CaCl2誘導(dǎo)的牛蛙離體心臟收縮幅度的影響

表5 兩種茶提取物對Ach誘導(dǎo)的牛蛙離體心臟收縮幅度的影響

3 討 論

心肌收縮與骨骼肌收縮存在差異。由于骨骼肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞產(chǎn)生興奮的時間不同，骨骼肌細(xì)胞動作電位產(chǎn)生快，故骨骼肌可以產(chǎn)生強直收縮；而心肌細(xì)胞動作電位持續(xù)時間長，心肌細(xì)胞興奮過程中有效不應(yīng)期特別長，故心肌不會產(chǎn)生強直收縮，其收縮和舒張始終會交替進行[18]。此外，心肌和骨骼肌在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、傳導(dǎo)性、收縮機制方面也存在差異。諸多差異便導(dǎo)致兩種茶提取物對心肌和骨骼肌生理特性影響程度和變化不同。

本實驗材料之所以選用牛蛙是因為：牛蛙骨骼肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞的生物電活動、骨骼肌和心肌的收縮舒張等都與人、哺乳動物相似[18]，肌絲滑行等生理學(xué)有關(guān)理論也可以用來解釋牛蛙的生理特性，可通過研究藥物對牛蛙心肌、骨骼肌的影響，從而研發(fā)適用于人、哺乳動物的藥物；牛蛙為變溫動物，離體后的心臟、腓腸肌不需要保證恒溫環(huán)境，其心臟無冠狀動脈，心肌細(xì)胞直接從心腔血液中獲得營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，不需要額外供氧，因此在一定時間內(nèi)其心臟可以節(jié)律性的興奮、收縮[17]?？傊?，牛蛙離體心臟和在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌所需生存條件比較簡單，易于掌握和控制，可以在室溫條件下一段時間內(nèi)保持生理活性，故選用牛蛙作為實驗材料，可研究兩種茶提取物對人、哺乳動物心臟和骨骼肌生理特性的影響。

4 結(jié) 論

綜上所述，普洱茶提取物和苦丁茶提取物均對骨骼肌收縮舒張具有促進作用，作用機制與通過促進終池內(nèi)Ca2+進入肌漿，使肌漿內(nèi)Ca2+濃度升高和通過抑制接頭處A-CHE活性，使Ach含量增加有關(guān)；兩種茶提取物均能抑制離體蛙心收縮，均能協(xié)同Ach對離體蛙心收縮幅度的抑制作用、抑制CaCl2對其促進作用，作用機制可能與阻斷ICa-L和激活心肌膜M受體，使胞內(nèi)cAMP濃度減少抑制胞外Ca2+內(nèi)流有關(guān)。無論對骨骼肌還是心肌，都是普洱茶提取物較粗壯女貞苦丁茶提取物影響更明顯。由此可推斷，普洱茶和粗壯女貞苦丁茶均具備良好的藥用價值，可望用于心肌損傷、心肌炎、高血壓等疾病的輔助治療。兩種茶均能增強體力，增強機體的抗疲勞能力[19]，尤以普洱茶效果更佳。常感覺疲勞的亞健康人群、骨骼肌疾病(如肌營養(yǎng)不良癥、代謝性肌病)患者常飲用普洱茶和粗壯女貞苦丁茶能輔助疾病的康復(fù)，可謂此類患者的“良好伴侶”。